1
Ekotoxikologické
biotesty
Půdní biotesty
Jakub Hofman
10.3.2008
2
Půdní biotesty
Testy s půdními organismy
Matrice je půda (solid phase)
Cíl: chránit půdu a půdní biotu před účinky
chemických látek a dalšími stresory
Proč? Půda je nepostradatelná složka přírody,
základna pro růst rostlin, zásobárna živin,
počátek a konec potravních řetězců a cyklů
prvků, filtrační a dekontaminační zóna
3
Důsledky expozice v pevné matrici
Velké odlišnosti od akvatických testů
Obsahuje vždy všechny tři fáze PEVNOU,
KAPALNOU (pórová voda) a PLYN (vzduch)
Přítomnost pevné fáze má významný vliv na
OSUD a CHOVÁNÍ chemické látky
V závislosti na vlastnostech látky, vlastnostech
půdy a na čase dojde k distribuci látky v půdě
Stěžejním procesem je SORPCE a důsledkem je
klíčový faktor půdních testů - BIODOSTUPNOST
4
Které vlastnosti matrice jsou kritické
Obsah organické hmoty ­ OM, TOC
Obsah jílovitých částic ( < 10 m)
Kationtová výměnná kapacita
pH
Vlhkost
Struktura půdy
Čas
5
Legislativa vs půdní biotesty
= PROČ mají půdní biotesty své místo na slunci
Chemické látky ­ nové a existující
Biocidy ­ pesticidy, přípravky na ochranu rostlin
Odpady ­ kaly ČOV, sedimenty, popílky,
dřevoštěpka apod.
Kontaminované lokality ­ remediace, sanace
Hnojiva a další materiály vstupující do půdy
6
Legislativa vs půdní biotesty - ČR
1) CHEMICKÉ LÁTKY
Zákon č. 356/2003 Sb., O chemických látkách a chemických
přípravcích a jeho prováděcí vyhláška č. 222/2004 Sb., kterou se u
chemických látek a chemických přípravků stanoví základní metody
pro zkoušení fyzikálně-chemických vlastností, výbušných vlastností
a vlastností nebezpečných pro životní prostředí (ve znění ve znění
vyhlášky č. 389/2005 Sb.)
Jako povinné ekotoxikologické testy jsou uvedeny (včetně
metodiky):
akutní test se žížalou E. fetida
testy efektů na aktivitu půdních mikroorganismů při transformaci
dusíku a uhlíku
test efektů na aerobní a anaerobní transformace v půdě
Jde v podstatě o přeložené metodiky OECD testů
7
Legislativa vs půdní biotesty - ČR
2) PESTICIDY
Zákon č. 326/2004 Sb., o rostlinolékařské péči a jeho prováděcí vyhláška
č. 329/2004 Sb., o přípravcích a dalších prostředcích na ochranu rostlin
Příloha 1: Seznam studií, které musí žadatel dodat pro hodnocení přípravku
Příloha 2: seznam studií, které musí žadatel dodat pro hodnocení účinné
látky
S půdními biotesty souvisí požadavek na zhodnocení vlivů na:
necílové suchozemské členovce (dle metodiky SETAC/ESCORT)
žížaly (akutní, reprodukce a pokud potřeba i polní test)
mikroorganismy (dle metodiky SETAC)
Vyhláška č. 327/2004 Sb., ochrana včel, zvěře, vodních organismů před
přípravky na ochranu rostlin
Definuje skupinu prospěšných, necílových členovců = beneficial, non-target
arthropods
Definuje skupinu půdních organismů
Neobsahuje doporučení konkrétních testů
8
Legislativa vs půdní biotesty - ČR
3) ODPADY, HNOJIVA A DALŠÍ ...
Zákon 185/2001 Sb., o odpadech a jeho prováděcí vyhláška č.
376/2001 Sb., o hodnocení nebezpečných vlastností odpadů
(stejně jako EU pod kódem H14 je zde ekotoxicita)
Definuje hodnocení účinků na vyšší rostliny
Test inhibice růstu kořene hořčice bílé výluhem odpadu (Metodika v
Metodickém pokynu MŽP ke stanovení ekotoxicity odpadů - Zpravodaj
MŽP 12/1998)
Kontaktní testování odpadů je opomíjeno, ač má pro pevné
odpady nesrovnatelně vyšší vypovídací schopnost, zejména v
případě kalů a sedimentů, jež mají být aplikovány do zemědělských
půd
Hnojiva ­ pouze obecně definováno, že nesmí mít negativní vliv
9
Legislativa vs půdní biotesty - EU
Council Directive 2001/59/EC adapting to technical progress
for the 28th time Council Directive 67/548/EEC on the
approximation of the laws, regulations and administrative
provisions relating to the classification, packaging and
labelling of dangerous substances
Příloha V obsahuje metody včetně ekotoxikologických biotestů s
žížalami a půdními mikroorganismy dle směrnic OECD
Council Regulation (EEC) 793/93 on the evaluation and
control of the risks of existing substances
Regulation (EC) 1907/2006 of the European Parliament and
of the Council concerning the Registration, Evaluation,
Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH)
Technical Guidance Document on Risk Assessment.
Part II: Environmental Risk Assessment. European Chemical
Bureau, Luxembourg (2003) = TGD
10
Legislativa vs půdní biotesty - EU
COUNCIL DIRECTIVE 91/414/EEC of 15 July 1991
concerning the placing of plant protection products on
the market
Příloha 1 - seznam účinných látek hodnocených na evropské úrovni, které byly
seznány, že rizika jsou přijatelná a není třeba je dále hodnotit na národní úrovni
Příloha 2 - seznam studií, které musí žadatel dodat pro hodnocení účinné látky
Příloha 3 - seznam studií, které musí žadatel dodat pro hodnocení přípravku
Příloha 61 - podle čeho a jak se hodnotí na základě EC2 a SETAC3 metodik.
Povinnými testovacími druhy necílových členovců jsou Typhlodromus pyri (dravý
roztoč), Aphidius rhapalosiphi (lumčík), Chrysoperla carnea (zlatoočka), Coccinela
septempunctata (slunéčko), Aleochara bilineata, Poecilus cupreus (střevlík), Orius
laevigatus (klopuška), Hypoaspis aculeifer
1. Guidance document on Terrestrial Ecotoxicology in the context of Directive 91/414/EEC
(SANCO/10329/2002)
2. Council Directive 97/57/EC of 22 September 1997 establishing Annex VI to Directive
91/414/EEC concerning the placing of plant protection products on the market
3. Guidance Document on Regulatory Testing and Risk Assessment Procedures for Plant
Protection Products with Non-Target Arthropods. From the ESCORT 2 Workshop
(European Standard Characteristics of Non-Target Arthropod Regulatory Testing). Ed: MP
Candolfi, KL Barrett, PJ Campbell, R Forster, N Grandy, M-C Huet, G Lewis, PA Oomen, R
Schmuck, H Vogt. SETAC-Europe
11
Legislativa vs půdní biotesty - EU
Směrnice 91/689/EEC o nebezpečném odpadu a seznamu
odpadů (rozhodnutí 2000/532/EC)
Rozhodující je 14 kriterií, která jsou odvozena z legislativy o
nebezpečných látkách.
Kritérium H14 značí ,,ekotoxické vlastnosti" - odpady, které
představují nebo mohou představovat akutní nebo pozdní
nebezpečí pro jednu nebo více složek životního prostředí.
Zatím není definován odkaz k žádné metodě a ani v seznamu
odpadů nejsou ekotoxické vlastnosti blíže specifikovány pro
rozhodnutí, zda se jedná či nejedná o nebezpečný odpad.
Příloha III direktivy 91/689/EEC pouze uvádí, že testovací metody
by měly korespondovat s metodami legislativy pro chemické látky
a dalšími doporučeními OECD.
Standard EN 14735 definuje přípravu a nakládání se vzorky
odpadů pro ekotoxikologické testy. V příloze B je obsažen i
seznam použitelných ekotoxikologických testů. Z půdních
jsou zde roupice, žížaly, chvostoskoci a rostliny
12
Organizace spojené s půdními testy
OECD = Organization for Economic Cooperation Development
ISO = International Standardization Organization
US EPA = US Environmental Protection Agency
SETAC = Society for Environmental Toxicology and Chemistry
IOBC = International Organisation for Biological and Integrated Control of
Noxious Animals and Plants
EPPO = European and Mediterranean Plant Protection Organization
ASTM = American Society of Testing and Materials
ANSI = American National Standards Institute
CEN = European Commitee for Standardization
AFNOR = Association Francaise de Normalisation
EEC = European Economic Community
WHO = World Health Organisation
BBA = Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft
OPPTS = The Office of Prevention, Pesticides and Toxic Substances (EPA)
13
Koncepce půdních biotestů
Stresor
Odpověď
A B C
A B C
+/-
+/A
B C
Frekvence
Frekvence
- +
Frekvence
Frekvence
- + A B C
Frekvence
Frekvence
A
B
C
- + A B C
14
Půdní biotesty - koncepce
Jde o prospektivní přístup k HODNOCENÍ
EKOLOGICKÝCH RIZIK
CÍL: Určit, jaká koncentrace chemické látky v půdě je
bezpečná
K tomu slouží soubor půdních ekotoxikologických testů a
následně metodika hodnocení ekologických rizik
Dose
Response
15
Půdní biotesty - koncepce
1. Testuje se chemická látka koncentrační
řada, např. 1, 10, 100, 1000 mg Cd / kgsuché
půdy
2. Testuje se materiál typu kontaminovaná půda,
sediment, kal ČOV apod. koncentrační řada
vzniká ,,ředěním" s referenční půdou,
např. 10, 20, 40, 80, 100 % kalu s čistou
půdou
Dose
Response
16
Testování toxicity tuhé matrice
17
Biotesty jako nástroj hodnocení kvality
tuhé matrice
Existují ISO normy určující výběr testů
ISO 15799 (2003): Guidance on the
ecotoxicological characterization of soils and soil
materials
ISO 17616 (2008): Guidance on the choice and
evaluation of bioassays for ecotoxicological
characterization of soils and soil materials
18
Existují ISO normy určující výběr testů
Specified chemical analytical
values according to BBodSchV,
LAGA or remediation plan
exceeded (if defined)?
Limitation of utilisation or
remediation goal not achieved
Ecological testing of soil eluate:
toxic effects detectable?
Ecological testing of soil: toxic
effects detectable?
Identification of
causalities
Habitat function
fulfilled:
Utilisation or
emplacement as
topsoil possible
Retention function
fulfilled: Low risk of
contamination
discharge or ground
water hazard:
Emplacement as
subsoil possible
yes
no
no noyes
yes
19
Biotesty jako nástroj hodnocení kvality
tuhé matrice
Retention function ­ Biotests with eluates
Ecotoxic
contents
Genotoxic
contents
Habitat function - Biotests with solids
Luminescent
bacteria test
Algal inhibition test
Site inherent
test organisms
Added test
organisms
Respiration test Nitrification test
Bacteria contact test Earthworm avoidance test
Plant test Earthworm test Collembolan test
Umu-test
20
Expoziční systémy
Chemikálie smíchána s půdou
Artificiální půda (OECD, ISO)
Reálná půda (LUFA 2.2 či jakákoliv jiná)
Aplikace na povrch těla
Injekce
Aplikace na přijímanou potravu
......
21
Expoziční cesty v pevném vzorku
Ingesce a orální vstup
potrava a půdní částice - organismy konzumují minerální a
organickou hmotu - významná expoziční cesta pro sorbované
chemikálie; kontaminanty se mohou bioobohacovat - např. v
houbách, které konzumují chvostoskoci; významná cesta pro
členovce
Dermální vstup
z půdy, z půdního roztoku - zejména organismy vrtající v půdě
(žížaly a roupice), které mají tenkou kutikulu a jsou v kontaktu
s půdou a pórovou vodou; lze modelovat výsledky i z testů v
akvatickém prostředí při doplnění modelu distribuce látky mezi
půdní roztok a sorpci na částice = tzv. Equilibrium partitioning
theory (EqP)
Dýcháním
nejsou téměř žádná data
22
Artificiální půda
10% Suchá a jemně namletá rašelina
20% Kaolinitový jíl obsahující minimálně 30% kolinitu
70% Křemenný písek jemný obsahující minimálně 50%
zrn o velikosti 0,05 ­ 0,2 mm
0,3 ­ 1% Uhličitanu vápenatého, který je přidán tak,
aby výsledné pH bylo 6  0,5
23
Artificiální vs reálná půda:
24
Složení artificiální půdy je předmětem
výzkumu
25
LUFA standardní půdy (http://lufa-speyer.de/)
Landwirtschaftliche Untersuchungs und Forschungsanstalt Speyer
přírodní půdy je potřeba před testy ošetřit: defaunace, úprava vlastností
Cena: 4 EUR za 1 kg + doprava
LUFA 2.1 LUFA 2.2 LUFA 2.3 LUFA 5M LUFA 6S
organic carbon (%) 0.81  0.21 2.16  0.40 0.98  0.05 1.29  0.20 1.75  0.11
particles < 0.02 mm (%) 8.2  0.9 13.9  1.1 22.7  1.1 25.3  1.8 65.1  2.7
pH (0.01M CaCl2) 5.1 0.4 5.4  0.1 6.4  0.6 7.2  0.1 7.2  0.1
cation exchange capacity (meq/100g) 4 1 10  1 8  2 15  3 22  6
water holding capacity (g/100g) 33.2  1 48.2  5 34.4  2 42.1  4 40.7  5
weight per volume (g/1000ml) 1404  46 1197  60 1291  30 1212  56 1264  90
<0.002 3.0  0.9 6.4  0.9 9.4  0.9 10.8  1.3 42.1  1.8
0.002 - 0.006 2.2  0.7 3.5  0.7 4.2  0.8 5.4  0.3 10.8  0.7
0.006 - 0.02 2.9  0.7 3.8  0.7 9.1  0.5 9.1  0.5 12.1  1.3
0.02 - 0.063 5.3  1.8 5.4  1.2 18.6  2.3 19.5  1.3 14.1  2.5
0.063 - 0.2 27.0  3.1 35.4  2.3 29.3  3.4 38.9  1.0 8.7  0.9
0.2 - 0.63 57.2  4.3 44.8  2.7 26.9  0.7 14.9  1.0 9.0  0.3
0.63 - 2.0 2.4  0.6 0.7  0.1 2.5  0.8 1.4  0.1 3.2  0.7
soil type sand (S) loamy sand (lS) loamy sand (lS) silty sand (uS) clayey loam (tL)
<0.002 3.0  0.9 6.4  0.9 9.4  0.9 10.8  1.3 42.1  1.8
0.002 - 0.05 8.8  1.8 12.2  0.6 29.8  3.0 27.5  2.2 36.0 2.3
0.05 - 2.0 88.2  1.2 81.4  1.2 60.8  2.6 61.7  3.2 21.9  1.6
soil type sand loamy sand sandy loam sandy loam clay
Particle size (mm) distribution according to German DIN (in %):
Particle size (mm) distribution according to USDA (in %)
26
European reference soil set
(IRMM-443-EUROSOILS)
27
Dávkování látek do půdy
cílem je HOMOGENITA expozice testovanou látkou
ve vodě rozpustné
pro přídavek využita destilovaná voda, kterou současně adjustujeme
potřebné ovlhčení půdy, přičemž by jejich koncentrace v přidávané
vodě neměla přesahovat 50% saturační koncentrace
nerozpustné ve vodě
1. suspendovány ve vodním roztoku pomocí nosiče, který není toxický,
je rozpustný ve vodě (aceton, etanol, arabská guma) a je volatilní
2. rozpuštěny v organickém rozpouštědle, které není toxické a rychle
se odpaří
V předchozích případech lze aplikovat:
1. do malého množství (1-10%) jemného křemenného písku; po odpaření
rozpouštědla je tato směs přidána do půdy a promíchána
2. přímo do vzorku půdy (suchý či vlhký) s následným odparem a promícháním
Ve všech případech je nutno zařadit kontrolu na nosič respektive na
rozpouštědlo
nerozpustné ve vodě ani ve vhodném rozpouštědle
lze smíchat přímo s křemenným pískem (2,5g písku na 20g půdy)
28
Výběr testů do procesů hodnocení rizik
Optimální vlastnosti půdního testu jsou:
standardizovatelnost, opakovatelnost, variabilita
praktická proveditelnost, cena, rychlost
citlivost
vypovídací hodnota, použitelnost pro ochranu ŽP
ekologická relevance
(samozřejmě platí vlastně i pro všechny další biotesty)
29
Ekologická relevance testů
test má respektovat ekologii organismu
testované druhy by měly reprezentovat relevantní funkční
skupinu
sledované odpovědi by měly být ekologicky relevantní a
indikovat stav a funkci organismu (přežití, růst, reprodukce,
přijímání potravy a mobilita)
při sledování reprodukce by měla expozice pokrývat většinu
životního cyklu
abiotické a biotické faktory by měly v testu být podobné jako v
habitatu
expoziční cesty by měly napodobovat reálné expozice
biodostupnost kontaminantu by měly být podobná jako v reálu
koncentrace by měly být environmentálně reálné (u půdy
obecně pro všechny látky lze jako maximum dát 1 g/kg půdy)
30
Ekologická relevance organismů
hrají klíčovou roli ve fungování půdního ekosystému
vyskytují se v řadě ekosystémů ve vyšší abundanci
lehce použitelné v polních i laboratorních podmínkách
dostávají se do kontaktu s polutanty
jsou dostatečně citlivé na stres
Problém ekotoxikologie obecně:
v testech použiji organismy A (z celé řady důvodů), ale cílové
organismy v systému jsou B jaký je vztah výsledků pro A a B ?
Příklad: Eisenia fetida ­ nejznámější půdní test
31
Druhy žížal
Eisenia fetida ­ žije v kompostu !!
Dendrobaena octaedra
Aporrectodea caliginosa
Lumbricus rubellus
Lumbricus terrestris
32
Půdní potravní síť vs biotesty
Žížaly, roupice
33
Stupeň standardizace půdních biotestů
1. Mezinárodní standard
2. Draft mezinárodního standardu
3. Národní standard
4. Draft národního standardu
5. Standardní operační procedura v rámci řešení
mezinárodního projektu
6. Popis v literatuře vědecky oponované
7. Popis v literatuře kompletní
8. Popis v literatuře nekompletní
34
Standardizovanost půdních testů
Skupina Druh Stupeň standardizovanosti
Mikroorganismy společenstvo 1
Hlístice Caenorhabditis elegans 3
Panagrellus redivivus 6
Plectus acuminatus 5
Roupice Enchytraeus crypticus 1
Enchytraeus albidus 1
Cognettia sphagnetorum 5
Žížaly Eisenia fetida 1
Aporrectodea caliginosa 5
Šneci Helix aspersa 2
Arion ater 7
Chvostoskoci Folsomia candida 1
Folsomia fimetaria 5
Isotoma viridis 5
Roztoči Hypoaspis aculeifer 2
Korýši Porcelio scaber 5
35
Standardy půdních biotestů - OECD
Determination of Developmental Toxicity of a Test Chemical to Dipteran Dung Flies (Scathophaga stercoraria L.
(Scathophagidae), Musca autumnalis De Geer (Muscidae))
Predatory Mite Reproduction Test in Soil (Hypoaspis (Geolaelaps) Aculeifer)
Drafty
227 Terrestrial Plant Test: Vegetitive Vigour Test (19th July 2006)
222 Earthworm Reproduction Test (Eisenia fetida/Eisenia andrei) (13th April 2004)
220 Enchytraeid Reproduction Test (13th April 2004)
217 Soil Microorganisms, Carbon Transformation Test (21st January 2000)
216 Soil Microorganisms, Nitrogen Transformation Test (21st January 2000)
208 Terrestrial Plants, Growth Test (19th July 2006)
207 Earthworm, Acute Toxicity Tests (4th April 1984)
Schválené standardy
V přípravě jsou v této chvíli: Folsomia sp. test a bioakumulační test
36
Standardy půdních biotestů - ISO
Determination of dehydrogenase activity in soils - Part 1: Method using triphenyltetrazolium chloride (TTC)2005ISO 23753-1
Determination of potential nitrification and inhibition of nitrification - Rapid test by ammonium oxidation2004ISO 15685
Determination of abundance and activity of soil microflora using respiration curves2002ISO 17155
Laboratory methods for determination of microbial soil respiration2002ISO 16072
Determination of soil microbial biomass - Part 2: Fumigation-extraction method1997ISO 14240-2
Determination of soil microbial biomass - Part 1: Substrate-induced respiration method1997ISO 14240-1
Determination of nitrogen mineralization and nitrification in soils and the influence of chemicals on these
processes
1997ISO 14238
Chronic toxicity in higher plants2005ISO 22030
Determination of the effects of pollutants on soil flora - Part 2: Effects of chemicals on the emergence and
growth of higher plants
2005ISO 11269-2
Determination of the effects of pollutants on soil flora - Part 1: Method for the measurement of inhibition
of root growth
1993ISO 11269-1
Avoidance test for testing the quality of soils and effects of chemicals on behaviour - Part 1: Test with
earthworms (Eisenia fetida and Eisenia andrei)
ISO/DIS
17512-1
Effects of pollutants on juvenile land snails (Helicidae) - Determination of the effects on growth by soil
contamination
2006ISO 15952
Effects of pollutants on insect larvae (Oxythyrea funesta) - Determination of acute toxicity2005ISO 20963
Effects of pollutants on Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) - Determination of effects on reproduction and
survival
2004ISO 16387
Inhibition of reproduction of Collembola (Folsomia candida) by soil pollutants1999ISO 11267
Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida) - Part 2: Determination of effects on reproduction1998ISO 11268-2
Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida) - Part 1: Determination of acute toxicity using
artificial soil substrate
1993ISO 11268-1
Guidance on the ecotoxicological characterization of soils and soil materials2003ISO 15799
37
Standardy v ČR
V ČR neexistuje ani jedna ČSN zaměřená na
půdní organismy !!!!!
Zákony odkazují na testy OECD
38
Standardy půdních biotestů ­ US EPA
850.6200 Earthworm subchronic toxicity test
850.5100 Soil microbial community toxicity test
850.4800 Plant uptake and translocation test
850.4600 Rhizobium-legume toxicity
850.4300 Terrestrial plants field study, Tier III
850.4250 Vegetative vigor, Tier II
850.4230 Early seedling growth toxicity test
850.4225 Seedling emergence, Tier II
850.4200 Seed germination/root elongation toxicity test
850.4150 Terrestrial plant toxicity, Tier I (vegetative vigor)
850.4100 Terrestrial plant toxicity, Tier I (seedling emergence)
850.4000 Background-Nontarget plant testing
850.2450 Terrestrial (soil-core) microcosm test
39
Přirození nepřátelé
škůdců z řad
členovců, kteří jsou
standardizováni ve
směrnicích IOBC,
BART, EPPO (SamsePetersen,
1990)
Opius+
Dacnusa, DiglyphusLeaf miner parasitoids
As for vegetablesAphid parasitoids
Aphidoletes sp.
As for cereals (except syrphids)Aphid-specific predators
Encarsia formosa°Whitefly parasitoids
Phytoseiulus persimilis°Predatory mitesGlasshouses
Orius sp.*
Anthocoris spp.+
Polyphagous predators
As for vegetablesLepidopteran parasitoids
As for cerealsAphid-specific predators
Amblyseius potentillae+
Typhlodromus pyri+*
Predatory mitesOrchards
Trichogramma cacoeciae+°
Lepidopteran parasitoids
Diaeretiella rapae+
Aphidius spp.+
Aphid parasitoids
As for cerealsPolyphagous predatorsVegetables
Aphidius spp.+*
Aphid parasitoids
Eupeodes corollae+
Episyrphus balteatus
Coccinella septempunctata+
Aphid-specific predators
Chrysoperla carnea+
Lycosid spiders+
Linyphiid spiders+
Aleochara bilineata+
Tachyporus hypnorum
Bembidion lampros+
Pterostichus cupreus+*
Polyphagous predatorsCereals
Examples1
Type of natural enemiesCrop
40
Testy obecně
Mladí ale dospělí jedinci (většinou 10) jsou exponováni chemikálii (či
kontaminované zemině) smíchané s artificiální půdou v nádobkách
ze skla či inertního materiálu
Předběžný test - hledáme rozmezí používaných koncentrací (ředící
faktor 10; 0,1 - 1000 mg/kg); mortalita hlavní endpoint hodnocený
po 2 týdnech
Finální test - výstupem je funkce závislosti účinků na koncentraci
testované substance (jemnější škála; nejlépe s faktorem 2);
hodnoceny přežití dospělců po 3 týdnech (mortalita - akutní test) a
počty juvenilů po 6 týdnech (reprodukce - reprodukční test)
NOEC design ­ méně koncentrací, ale více opakování - 5
koncentrací po 4 opakováních a kontrolní varianta (bez chemické
látky, na rozpouštědlo apod.)
EC/LC design ­ více koncentrací, méně opakování ­ regresní
metody
41
Testy s půdními mikroorganismy
Soil sampling
Storage
Pre-incubation
(7 days)
START
Substance
application
Negative
control
Positive
control
7th day
14th day
21st day
28th day
Microbial
parameters
10 g per replicate
aerobic conditions
60% WHC; 22°C; dark
1010 g per replicateg per replicate
aerobic conditionsaerobic conditions
60% WHC; 22°C60% WHC; 22°C;; darkdark
OECD 217 (2000) Soil Microorganisms, Carbon Transformation Test
ISO 14238 (1997) Determination of nitrogen mineralization and nitrification in soils and the influence
of chemicals on these processes
OECD 216 (2000) Soil Microorganisms, Nitrogen Transformation Test
42
Požadavky na půdu
přirozená půda, která je vybrána tak, aby byla citlivá vůči
kontaminaci a splňovala tzv. "nejhorší scénář", tj. maximální
expozici mikroorganismů polutantu v této půdě:
více než 70% písku
pH 5,5 - 7,0
Corg 0,5 - 1,5%
Cbio/Corg více než 1% (dostatečné oživení)
kationtová výměnná kapacita vyšší než 70 mmol/kg
v historicky známé době nekontaminovaná (adaptace společenstva)
Alternativy:
vzhledem k možnosti přítomnosti resistentních mikroorganismů v
reálném společenstvu existují postupy, kdy je do sterilizované
přirozené půdy inokulována specifická kultura mikroorganismů
(Pseudomonas putida, Bacillus cereus) plynulý přechod k "solid
phase testům (SPT)" toxicity s prokaryoty
43
Endpointy v mikrobiálním testu
Standarně pouze mineralizace dusíku a uhlíku jako
produkci CO2 a sumy minerálních forem dusíku (NH4+,
NO2-, NO3-)
Lze ale stanovit i další parametry:
Mikrobiální biomasu
Substrátem indukovanou respiraci
Enzymatické aktivity
Kinetiku mineralizace C a N
Amonifikaci, nitrifikaci
Diverzitu
Výstupy: NOEC, LOEC, LC50, EC50, IC50 ...
44
Stanovení mikrobiální biomasy
Fumigačně-extrakční
metoda
Determination of soil microbial biomass - Part 2: Fumigation-extraction method1997ISO 14240-2
45
Bazální a potenciální respirace
Bazální respirace Potenciální respirace
Laboratory methods for determination of microbial soil respiration2002ISO 16072
Determination of soil microbial biomass - Part 1: Substrate-induced respiration method1997ISO 14240-1
46
Hodnocení mineralizace dusíku
Determination of nitrogen mineralization and nitrification in soils and the influence of chemicals on
these processes
1997ISO 14238
47
Krátké testy toxicity s půdními
mikroorganismy ­ SIR kinetika
A) Testování kontaminovaných půd B) Testování chemikálií
Determination of abundance and activity of soil microflora using respiration curves2002ISO 17155
48
Krátké testy toxicity s půdními
mikroorganismy ­ Oxidace amoniaku
Jde o míru nitrifikace = první krok nitrifikace
SNA = short term nitrification assay
PAO = potential ammonium oxidation
půda inkubována v roztoku síranu amonného
chlorečnan sodný inhibuje oxidaci dusitanu
po 5 či 24 hod stanovení NO2Determination
of potential nitrification and inhibition of nitrification - Rapid test by ammonium
oxidation
2004ISO 15685
49
Žížaly v ekotoxikologii
žížaly jsou asi nevíce a nejdéle ekotoxikologicky užívaný představitel
půdní fauny
Výhody a důvody:
celý vývojový cyklus probíhá v půdě - typický geobiont
zkonzumují velká množství půdy (vysoká expozice potravou a
akumulace kontaminantů)
mají velmi úzký fyzikální kontakt s půdou (expozice pokožkou)
mají výrazné bioakumulační a biokoncantrační charaktery
(jejich analýzou posuzujeme vliv delšího časového období) = patří
mezi tzv. makrokoncentrátory
vysoký a významný podíl na tvorbě půdy, dekompozičních
procesech, půdní úrodnosti
klíčové postavení v přenosu polutantů v potravních řetězcích
výskyt téměř ve všech půdách ve vysokých počtech i váhách
osvědčené, zavedené v laboratorních testech (nenáročný chov)
snadno se identifikují v reálných vzorcích (díky velikosti)
50
V různých testech byly pozorovány různé
endpointy
Mortalita
Reprodukce
Behaviorální změny
Malformace
Fyziologické změny
Snížení imunity
Aktivity enzymů
Biochemické markery
Genotoxicita
....
51
Testy se žížalami
Užívané druhy
epigeická je Eisenia fetida (žížala hnojní)
aneická je Lumbricus terrestris (žížala obecná)
endogeická je Aporredoctea caliginosa
E.fetida se v přírodě vyskytuje jen ve velmi organicky bohatých
stanovištích (komposty), což je nevýhoda
A. caliginosa je rozšířená na pastvinách i na polích, hraje klíčovou
roli v půdních ekosystémech
Používá se také Lumbricus rubellus či Dendrobaena octaedra
ALE reálně půdní žížaly jsou nevhodné díky dlouhé generační době a
díky velkým objemům půdy, které vyžadují v laboratoři
52
Eisenia fetida
Výhody
Standardní druh
Snadná kultivace velkých počtů
Krátký životní cyklus
53
Chov žížal
Nevýhoda těchto jinak perfektních testů: nároky na
prostor, čas
boxy 50×50×15 cm s těsnícími víky
médium 1:1 směs kravího či koňského hnoje a rašeliny
pH cca 7
nekontaminovaná amoniakem či močí
pokud vše jde dobře za 6 týdnů až 1000 žížal (na 20 kg směsi):
týdně 2-5 kokonů s cca 4 juvenily na kokon
v optimálních podmínkách je dospělá za 2-3 měsíce
kulturu lze také získat ve vermikompostovacích firmách
Synchronizace kultury:
začne se s kokony, za 3-4 týdny se vylíhnou, za 7-8
týdnů dospějí (20°C)
54
Akutní toxicita pro E. fetida na filtračním
papíře
48 expozice na navlhčeném filtračním papíře ve
zkumavkách, 20°C, tma, 10 opakování na jednu
koncentraci, do jedné zkumavky 1 žížala
před finálním testem provádíme test hledající rozmezí
koncentrací
aplikace je ve vodném rozroku či volatilním rozpouštědle
+ odpaření + ovlhčení
kontaminace se udává v mg/cm2; doporučené
koncentrace jsou 1, 0.1, ... 0.0001
mortalita po 24 a 48 h (= nereagují na jemný
mechanický stimul) se převede na LC50
expozice puze přes pokožku
téměř nemožná extrapolace na reálnou expozici; velmi
umělý test
jen slabé korelace tohoto testu a testu s půdou
55
E. fetida akutní test v půdě
dospělci E.f. jsou chovány 14 dní v artificiální půdě obsahující
kontaminant (500 g půdy)
před finálním testem provádíme test hledající rozmezí koncentrací
kontaminace se udává v mg/kg; doporučené koncentrace jsou 0.1, 1,
10, 100, 1000
dávkování (rozpustné × nerozpustné × pevné ... klasika)
vyšší koncentrace než 1000 mg/kg nejsou environmentálně relevantní
a nemá smysl je testovat
na 1 koncentraci 1 nádoba v předběžném testu a 4 nádoby ve finálním
testu
nádoba má 10 jedinců (dospělci: clitellum, váha 300 - 600mg, věk 212
měsíců, rozdíly ve věku by neměly být vetší než 4 týdny)
kontinuální osvětlení (400-800lx) zabezpečuje setrvání jedinců celou
dobu v půdě
mortalita a váha po 7 a 14 dnech (nereagují na jemný mechanický
stimul) se převede na LC50
doporučuje se užití referenční látky - chloracetamid (LC50 mezi 20 a
80mg/kg)
kontrola - mortalita méně než 10% a úbytek váhy menší než 20%
56
E. fetida reprodukční test
v nádobách 1-2L s povrchem 200cm2, vrstvička asi 5-6cm (500600g)
AS
potrava 0,5g hnoje na jedince a na týden
do nádoby 10 dospělců
1 týden předinkubace; předběžný test; finální test
aplikace jako postřik na povrch půdy pro pesticidy (!! až cca 30min
po introdukci žížal) a pro chemikálie vmíchání do půdy (před
introdukcí)
2 koncentrace: doporučená dávka pro užívání přípravku a 5× větší
20°C; 16:8 400-800lx; krmení 5g sušeného hnoje týdně
po cca 4 týdnech mortalita, zvážení, spočítají se kokony +
juvenilové; oddělají se dospělci
kokony se inkubují další čtyři týdny - extrakce juvenilů ručním
tříděním
výsledky jsou váha dospělců a počet juvenilů na dospělce
KONTROLA musí mít cca 30 juvenilů/dospělce; koeficient variance
pro reprodukci <30% a mortalita dospělců po 4 týdnech by neměla
být větší než 10%
REFERENČNÍ LÁTKA je doporučován carbendazim; má mít
statisticky významný efekt v koncentraci 1-5 mg/kg (250-500g/ha)
57
Příprava půd Měření WHC půd Ovlhčená AS
rozvážená do
testovacích nádob
Výběr 10
reprezentativních
adultů z chovu a
jejich omytí dH20
Zvážení jedincůPřídavek 10 adultů do
nádoby na test
Eisenia fetida reprodukční test - začátek
58
Prohlídka nádob (známky
aktivity)
Zhodnocení mortalityZvážení žížal
Nádoby během testu v
kontrolované místnosti
E. fetida test ­ po 28 dnech
59
Po cca 20 min
juvenilové na
povrchu
Vodní lázeň s narůstající teplotou
40C až 60C
Přesátí půdy
Sbírání a
počítání
PočítáníRuční třídění kokonů
E. fetida ­ po 8 týdnech
60
61
Příklad hodnocení pesticidů
62
Earthworm Avoidance Test
Guideline: ISO/DIS 17512 (draft)
Species: E. fetida / E. andrei
Substrate: LUFA St. 2.2 standard soil
Duration: 1 - 2 days
Parameter: Behaviour of the worms
Test vessels: Dual chamber
63
Testy s roupicemi
význam při srovnání s prostorovými, časovými a finančními náklady
testů na žížalách (mají asi poloviční generační dobu - 4-6 týdnů
oproti 8 týdnům u žížal, v testu je potřeba jen asi 20g půdy oproti
1/2 kg u žížal)
NAVÍC roupice zastávají podobné funkce jako žížaly a v některých
systémech je nahrazují
DŮLEŽITÁ je také expozice roupic polutantům (horní vrstvička
půdy)
v terénu představují velmi dobrý INDIKÁTOROVÝ ORGANISMUS, i
když žížaly jsou asi ekologicky důležitější
jako laboratorní testovací roupice se používají Enchytraeus albidus,
Cognettia sphagnetorum, E. crypticus, E. buchholzi, E. minutus
64
Chovy roupic
65
Chov roupic
ve směsi artificiální půdy a zahradní zeminy (1:1) či ve směsi
rašeliny a standardní přirozené půdy LUFA 2.2, či prostě jen v
zahradním substrátu < 2mm
použitá půda musí být zbavena fauny (např. opakované silné
zmrazení a roztátí) a zejména by neměla obsahovat polutanty
pro vhodnost substrátu lze provést i předběžný test (cca 2 týdny),
kde jsou indikátory nevhodného substrátu behaviorální změny
(roupice pohybující se pouze po povrchu půdy či snažící se uniknout
z nádoby), nevyskytující se juvenilní jedinci a částečky zeminy
ulpívající na roupicích
V optimálních podmínkách vytváří pohlavně se rozmnožující roupice
po rozmnožování (optimální teplota do 25 °C) kokon obsahující
průměrně 5 - 15 vajíček. Po dvou až třech týdnech se vylíhnou cca
1 mm (15 - 20 segmentů) velcí juvenilní jedinci, kteří dospívají v
závislosti na podmínkách po 10 až 20 týdnech (důležitá teplota jejíž
optimum leží mezi 5 - 25 °C). Nově vylíhlé roupice mají 15 - 20
segmentů a jejich počet přibývá s věkem. Za dospělé lze považovat
tehdy, vyvinul-li se zcela rozmnožovací systém.
66
Test na reprodukci roupic ­ 1. část
Je možno provádět se dvěma druhy E. albidus a E. crypticus
Inertní nádobky a v každé 20g půdy pro E.a. a 10 g pro E.c.
Podmínky testu: optimální teplota (max 20 °C), vlhkost (40 - 60%
WHC), osvětlení (perioda 16:8, 400-800 lux)
10 dospělých jedinců (opasek s tečkami vajíček) do každé nádobky
Každý týden s vyjímkou prvního týdne po odstranění dospělců je
přidávána potrava (cca 1,2 mg ovesných vloček na g půdy).
Mortalita ­ po 2 týdnech (E.c.) či 3 týdnech (E.a.) se spočítají
dospělci a odstraní se z půdy
Pozorování morfologických změn lze provádět na petriho
miskách:
Jedinci jsou asi 12 hodin necháni na miskách v chladu, čímž dojde k
vyčištění trávící soustavy.
Jedinec je přemístěn do kapky vody na podložní sklíčko a přikryt krycím
sklíčkem.
Pozorování začíná na 100× zvětšení a detailní studium externích a
interních struktur provádíme při 400× zvětšení.
67
Test na reprodukci roupic ­ 2. část
Po odstranění adultů se inkubuje pouze půda s kokony ­ bez
potravy
Po dalších 2 týdnech (E.c.) či 3 týdnech (E.a.) se hodnotí
reprodukce - fekundita, pro extrakci juvenilních jedinců
Metoda mokré extrakce (fixace etanolem a barvení 1% bengalskou
červení po 12 hodinách)
Kontrola v testu (bez aplikace chemikálie i nosiče) má vykazovat
následující parametry:
mortalita dospělců méně než 20% na konci testu
rozmnožení nejméně 25 juvenilních jedinců na 10 dospělců (pro E.c.
je zo 300 až 500)
koeficient variance pro počet juvenilů méně než 50%.
Pozitivní kontrola - referenční látka - carbendazim
(1,20,8mg/kg by mělo vyvolat EC50)
68
Timetable
69
ERT je citlivý zejména na pH
70
Avoidance test s E. albidus
24 hodin
1 2 3
 8,4 cm
4
5
10 dospělců
10 opakování 2 x 10 g půdy
Hledání živých roupic
v obou polovinách
odpad artificiální půda
Např. testování
odpadů
71
Bioakumulační
test s
máloštětinatci
72
Testy s chvostoskoky
ekotoxikologicky dlouho využívané organismy - první test na
filtračním papíře byl již v roce 1956 s DDT
Výhody:
dobře prostudovaná skupina půdních bezobratlých
ekologická relevance
široce rozšířené, abundantní v půdách
lehce vzorkovatelní
lze je chovat v laboratoři
relativně rychlý životní cyklus s vysokou reprodukcí
nejčastěji užívaným druhem je Folsomia candida
omnivor (řasy, bakterie, prvoci, detritus)
lehká kultura
partenogenetická povaha neposkytuje příliš ekologicky relevantní
obrázek
i další druhy: Folsomia fimetaria, Isotoma viridis, Onychiurus
armatus, O. quadricellatus, Orchesella cincta, Tullbergia granulata
73
Reprodukční test s F. candida
74
Postup testu s F. candida
Kultivace
na petriho miskách či jiných nádobách, kde je na dně štuková sádra
(pH 6,4) a aktivní uhlí (pH 6-7) smíchané v poměru 8 až 10 ku 1,
100g směsi + 60-100g vody = dostatečná vlhkost; uhlí pohlcuje
exkrety
tmavé pozadí umožňuje pozorování
20-22°C; 70-80% rel. vlhkost vzduchu; 400-800lx
potravou jsou kvasnice párkrát týdně
po 8 týdnech je nutné přemístit do nové misky (tím se spouští
ovipozice)
Synchronizace
shluk vajíček se přemístí do nové nádoby; po 48h. odstranit zbylá
vajíčka a krmí se juvenilové
nebo čerstvě vylíhlí jedinci se dají do nové nádoby a po nakladení
vajíček se odstraní dospělci
manipulace pomocí exhaustoru dechového či automatického
75
Test s F. candida
30g AS + na počátku 2mg sušených kvasnic + 10
jedinců F.c. (10-12 dní staré) a těsně zavřít nádobky
po 28 dnech (případně po době, než se vylíhnou potomci
z vajíček nakladených dospělci) se sleduje přežití a
potomstvo (F1)
flotační metoda na konci pokusu
endpointy jsou reprodukce (produkce vajíček), růst,
změny v chování, přežití
REFERENČNÍ LÁTKA: Betanal plus (160g/L
Phenmedipham) či E605 forte (507,5g/L Parathion) efekt
na reprodukci 100-200mg první látky a 0,1-0,18mg
druhé
VALIDITA TESTU: v kontrole ne více než 20% mortalita
a minimum 100 juvenilů na jednu testovací nádobu
76
Flotační metoda
77
Flotační metoda
Kontrola: 8 adultů a 235 juvenilů 100 mg/kg kadmium: 4 adulti a 5
juvenilů
78
Analýza obrazu
79
Testy s hlísticemi
Hlístice jsou de facto vodní organismy ­ žijí v pórové
vodě
Nesnadná extrapolace na reálné podmínky
 Velmi rychlé testy ­ krátký životní cyklus
 Hlístice jsou nejpočetnější půdní bezobratlí
 Existují varianty s půdou jako matricí
Caenorhabditis elegans, Panagrellus redivivus, Plectus
acuminatis
80
Caenorhabditis elegans chov a test
ASTM: E2172-01 Standard
Guide for Conducting
Laboratory Soil Toxicity
Tests with the Nematode
Caenorhabditis elegans
C. elegans se chová na
agarových plotnách s
nárůstem E. coli
Nutné jsou aseptické techniky
a opatrné zacházení
Několik medií ­ NGM ­
Nematode Growth Medium,
LB ­ agar, K ­ roztok apod.
Po 1-2 měsících se přesazuje
na nové plotny
Při nedostatku potravy se
vyvinout tzv. Dauerovy larvy
81
C. Elegans test
Protože testovací organismy by měly být stejné věkové a váhové
kategorie, použije se synchronizovaná kultura nematod: ošetření
kultury roztokem chlornanu a hydroxidu sodného (SAVO) - vajíčka
rezistentní, dospělce usmrtí; pak cca 3-4 dny staré hlístice
připraví se varianty půd ve větších objemech; poté na petriho
miskách ( 3,5) menší navážky + testovací organismy (10 jedinců)
po 24h. pokusu (20°C ve tmě) se provede speciální extrakce
(Ludox - koloidní suspenze) + centrifugace; nematoda jsou na
povrchu supernatantu - přemístíme je na petriho misku s médiem a
počítají se mrtví jedinci (bez pohybu při dráždění); spočítá se LC50
kontrola pro validitu měření by měla mít 80% výtěžnost nematod z
půdy a v kontrole 90% přežívání
pokud je test delší než 24h. musíme zajistit potravu - inokulum
E.coli
82
Postup
Kontaminovanou půdu
lze připravit předem
Nutný je kvalitní
mikroskop
Tento test je méně
ekologicky relevantní než
ostatní půdní testy:
- hodně vodné fáze
- krátké trvání
= rychlý screeningový test
83
Šneci v půdní ekotoxikologii
84
Helix aspersa test
juvenilní H. aspersa (3-5 týdnů staří jedinci; 10,3g; 15,51mm
schránka; ze synchronní kultury) po estivaci = 1-20 týdnů v
dřevěných krabičkách v suchu; pár dní před testem postřik vodou,
krmení
pak je 5 jedinců exponováno 28dní testovacímu substrátu (AS či
přírodní čistá půda) obsahujícímu testovanou látku nebo
kontaminované půdě; v boxech s 1cm vrstvou cca 140g půdy
po sedmi dnech se přendávají do nového substrátu
20°C, 16:8 fotoperioda 50-100lx
během testu se přidává potrava (např. Helixal) v misce na dno
testovací nádoby
každých 7 dní se jako parametr růstu měří hmotnost a velikost
schránky a sleduje se mortalita
referenční látka je Cd: pro hmotnost by EC50 mělo být mez 350650mg/kg
a pro schránku mezi 500-800mg/kg
VALIDITA: menší mortalita než 10%; koeficient variance pro růst <
40%; cca 4× zvětšení hmotnosti; cca 1,5× zvětšení ulity
85
H. aspersa ­ náročný chov
86
Chov
a
test
87
Testy s roztoči
vhodné testovací organismy, zastávají řadu potravních
typů ­ herbivoři, fungivoři, detrivoři a carnivoři
Hypoaspis aculeifer (gamasida) ­ predátor lovící
roupice, chvostoskoky, roztoče; cca 0,8mm; sexuální
rozmnožování
ekologická úloha spočívá v biokontrole škůdců rostlin
(hlístic, larev hmyzu, roztočů) a patří mezi prospěšné
členovce
testovací systém zahrnuje vztah predátor ­ oběť ­
vysoká citlivost
88
Kultura
roztoče lze chovat v plastových nádobkách na sádře ve 20°C při
12:12h fotoperiodě
krmí se Folsomií fimetaria jednou týdně
pro vyprodukování vajíček se umístí na nový substrát 150 samiček
a 20 samečků; je potřeba udělat jehlou malé dírky do sádry
za cca 10 dní jsou juvenilové, kteří se krmí juvenilními Folsomiemi
Hypoaspis aculeifer test
89
H. Aculeifer test
10 samiček a 5 samečků H.a. a 100 F.c. či F.f.
se přidá do 60g půdy AS či LUFA (kontrola +
kontaminované varianty)
po třech týdnech se sleduje přežití, růst a
reprodukce
na začátku a po 14 dnech se přidají kvasnice
jako potrava pro chvostoskoky
testovací nádobky obsahují naspod síťku pro
pozdější extrakci v McFaydenově
vysocegradientovém extraktoru
referenční látka může být dimethoát
Validita: reprodukce roztočů cca 20 juvenilů na
misku a přežití samiček více než 90%
90
Testy s prospěšnými členovci
existuje pojem "užiteční členovci", spojen s ochranou před účinkem
pesticidů na necílové organismy, například na pavouky, hmyz a
roztoče které jsou přímo prospěšné, neboť v ekosystémech fungují
proti škůdcům (predátoři a parazité škůdců)
existuje skupina IOBC (International Organisation for Biological and
Integrated Control of Noxious Animals and Plants) - připravila cca
30 testů v 3 stupňovém schématu hodnocení rizik (vychází z testů
BBA a spolupracuje s BART)
cca 6 testů na blanokřídlých
4 testy na broucích
2 testy na dvoukřídlých
jeden na síťokřídlých
jeden na plošticích
3 na roztočích
jeden na pavoucích
jeden na patogenní houbě
91
Organismy? Většinou dravci
Poecilus cupreus
Philonthus cognatus
Linyphiidae
Lithobius mutabilis
92
BBA testy
93
BBA testy
94
BBA testy
95
BBA testy
96
BBA testy
97
Půdní ekotoxikologie vs biotesty
Není soubor půdních ekotoxikologických biotestů
Pomáhá POROZUMĚT složitým vztahům mezi
chemickými látkami, půdou a půdními organismy
látka
půda
biota
98
Půdní ekotoxikologie vs biotesty
Chceme určit, jaká koncentrace chemické látky v
půdě je bezpečná
Chceme určit, jaké efekty a proč mají chemické
látky a jejich směsi v půdách určitých vlastností
v určitých podmínkách a jaké to bude mít
důsledky a proč.
Funkční biotesty pro proveditelné hodnocení rizik
Porozumění komplexní problematice