E (C -Q O X o o 0 Testy toxicity na rybích modelech > Akutní testy toxicity > Prolongované testy toxicity > Chronické testy toxicity > Testy toxicity na rybích embryích a poteru Embryonálni testy Embryolarvální testy > Testy ovlivnění růstu na nedospělých rybách > Testy bioakumulace Chemické látky a chemické přípravky -hodnocení vlastností nebezpečných pro životní prostředí • Zák. č. 356/2003 Sb. O chemických látkách a chemických přípravcích • Metody pro zkoušení vlastností látek a přípravků uvedeny v části I. přílohy č.2 Vyhlášky MŽP č. 222/2004 Sb., kterou s u chemických látek a přípravků stanoví základní metody pro zkoušení fyzikálně-chemických vlastností, výbušných vlastností a vlastností nebezpečných pro životní prostředí • - akutní toxicita pro ryby • - bioakumulace - průtoková zkouška na rybách • - růstu na nedospělých rybách • - toxicity na rybích embryích a potěru - krátkodobá zkouška Akutní testy ČSN EN ISO 7346-1 (75 7761) Jakost vod - Stanovení akutní letální toxicity látek pro sladkovodní ryby Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae) - Část 1: Statická metoda ČSN EN ISO 7346-2 (75 7761) Jakost vod - Stanovení akutní letální toxicity látek pro sladkovodní ryby Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae) - Část 2: Obnovovací metoda ČSN EN ISO 7346-3 (75 7761) Jakost vod - Stanovení akutní letální toxicity látek pro sladkovodní ryby Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae) - Část 3: Průtočná metoda OECD 203: Test akutní toxicity na rybách - výsledkem je koncentrace, která vyvolá 50% úhyn ryb (96h LC50) Používané Brachydanio rerio (danio pruhovaný) Poecilia reticulata (živorodka duhová, páví očko) druhy Pimephales promelas (střevle) rinus carpio (kapr obecný) Oncorhynchus mykiss (pstruh d Střevle potoční (Pimephales promelas malá, malé nároky na prostor mimotělní vývoj široké rozmezí teplot i slanosti snadná kultivace v laboratoři krátká generační doba testy relativně levné Danio pruhovaný (Brachydanio rerio) 1 — / r-i Tri Hft-j*. -,~ ' b ^ 1 <* **-^ % ^ 1 1 ! 1 K J •^—^^^^■^^^i Jr ^^^^^_. J • Známý genom, dobře charakterizovaný druh • Tisíce mutantních druhů • Dobře popsaný model vývoje obratlovců Čeleď: Cyprinidae - kaprovití . Moddy pro některá Mská onemocnění a Původ: Asie poruchy Velikost: do 4 cm Teplota: 20 - 26 °C pH: 6,5 - 7,5 Tvrdost vody: 5 - 12 °dKH Potrava: všežravec (vločkové krmivo, nitěnky, dafhie) Rozmnožování: Samečci jsou vybarvenější a oproti samičkám dorbnější. Rozmnožují se ve větší, hodně zarostlé, nádrži s nízkou hladinou vody, při teplotě okoro 25 °C. Na vytírací nádrž by mělo dopadat denní světlo. Nejdříve do nádrže umístíme samičku a až po několika dnech přidáme samce. Pokud jsme byli úspěšní, samička naklade na rostliny až 500 jiker. Potěr se líhne po dvou dnech a soběstačný je po dalším dni. halančík japonsky {Oryzias latipes): Zcela průhledná vajíčka Dostupné křížené /transgenní /mutantní druhy Známý genom X-Y určení pohlaví Low tumor background Sensitivní odpověď na xenobiotika Test akutní toxicity na rybách Účel: Test slouží ke stanovení vlivu látek a odpadních vod na chování a přežívání ryb. Princip: Test spočívá ve sledování chování a přežívání ryb v odstupňovaných koncentracích testované látky po dobu 48 až 96 hodin Brachydanio rerio (2,5-3,5 měsíců, 2,5-3,5 cm, 21-25°C) Poecilia reticulata (1,5-2,5 cm, 3-3,5 měsíce, 21-25°C) Cyprinus carpio (2,5-3,5 cm, 20-24°CJ Oncorhinchus my kiss (4,5-5,5 cm, 13-17°C) Další druhy: Oryzias latipes (halančík japonský), Lepomis macrochirus (slunečnice modrá), Leuciscus idus (jelec jeseň) Při nákupu nutná aklimatizace 10-14 dni, standardní krmení, chov jako při testu Do testu - buď jen jedno pohlaví nebo vyrovnaný počet pohlaví Testy akutní toxicity na rybách Podmínky testu: Teplota 23±2°C, osvětlení 12-16 hod 2 000 lux, 48 hod před testem přestat krmit, během testu bez krmení; bez aerace, expozice 96 h min. 100 ml/jedince, 3-10 jedinců/koncentraci Limitní test: kontrola a 100 mg/L, 3-5 ryb/koncentraci Orientační test (předběžná zkouška): 3-5 ryb/500ml, několik koncentrací - cíl: získat informace o rozsahu koncentrací pro hlavní zkoušku Základní test (hlavní zkouška): 7-10 ks ve 3 litrech, 3 opakování, 5-10 koncentrací Uspořádání: statické, semistatické - obsádka max. 1 g na L průtokový systém - možno vyšší obsádka Akutní test Parametry sledované v průběhu testu • pH, teplota, 02 • změny chování (aktivita, neklid, trhavé pohyby apod.) • mortalita po 24, 48,72 h • Na konci testu - letalita - stanovení 96LC 50 Po ukončení testu jsou pokusné organismy usmrceny oxidem uhličitým dle zákona ČNR č. 246/1992 Sb na ochranu zvířat proti týrání. Experimentální design pro testy toxicity Conc Static **, 5 Flow-through V *+i Time Conc Time Překonání problémů statického designu: 1. Zvýšení objemu Conc Time **4* Uptake by organisms depletes chemical in solution Chemical depleted slowly Překonání problémů statického designu: 2. Semi-statické upořádání (obnovovací) Continuous: -exposure is function of duration me Static renewal, with recovery: -exposure is function of max cone n Static renewal, no recovery: -exposure is function of cumulative concentration Cone Effect Cone Cone Effect Test akutní to ] Vzorek: deity na rybách -základní test Druh ryby: Za spfávnost odpovídá: Podmínky v průběhu testu Číslo Nádrže Kunc. Tepfota CCJ Kyslík (% nasycení) pH Datum * hodina měfeni i Oh 24 h 48 h 46h 72 h 96h Oh 24 h 48 ti 48 h ' 72 h 96h Oh 24 h 46h 46 h 72 h 9Gh 1 j 2 i 3 i 4 5 6 7 8 9 10 K prelo ŕeni r r Test akutní toxicity na rybách - základní test Vzorek: Ředicí voda; Datum a hodina zahájeni testu: Počet testovacích organizmů v jedné koncentraci: Druh ryby: Test nasadil: Test odečetl: Za správnost odpovídá: Objem lázně: Doba trvání testu: Datum a hodina výměny lázné: ■ Číslo nádrže 1 Test< >vaný vzorek ■ftottjltta ryb (ks) - datum a hodina Velikost ryb koncentrace dávka do - ml zásobní roztok hmotnost délka obpem č. zás. rožt. 2 3 ii 4- 5 - 6 I 7 I 8 9 10 K Zásobr í roztok č. 1 Zásobní t oztok č. 2: Prolongované testy toxicity na rybách OECD č. 204: Prolongovaný test toxicity na rybách - výsledkem je koncentrace, která vyvolá 50% úhyn ryb za dobu působení 14 dnů (14d LC50) a koncentrace, která nezpůsobuje poškození ryb (NOEC) Expozice 14 dnů (OECD-14 dnů, ISO 21 dnů) Podle jiných norem - doba trvání testu 2-4 týdny během testu krmeno semistatická nebo průtočná expozice Sledujeme: zrychlené dýchání, překrvení zaber, křečovité pohyby, ztráta stability, neklid a zrychlené pohyby, úhyn (ihned odstranit z nádoby), pH, teplota, 02 Na konci testu: stanovení 14 d LC.n, NOEC, LOEC Test chronické toxicity na rybách Druhy: Poecilia reticulata (páví očko), Brachydanio rerio (zebřička pruhovaná), Cyprinus carpio (kapr obecný) a Oncorhynchus mykiss (pstruh duhový) Testování se provádí podle směrnic OECD. Testy chronické toxicity (doba trvání testu 3 měsíce). - nejčastěji pstruh duhový nebo kapr obecný - dlouhodobé účinky testovaných látek a přípravků Sledované parametry: chování ryb, příjem potravy, délkové a hmotnostní přírůstky, hematologické a biochemické ukazatele, kumulace testované látky v rybách apod.. Náročné provedení Vyšší vypovídací schopnost je ve srovnání s testy akutní toxicity Pro látky, u kterých se předpokládá cílená aplikace do vodního prostředí, nebo existuje potenciální nebezpečí, že jimi bude vodní prostředí kontaminováno. Embryonální a embryolarvální testy toxicity na rybách Cíl: Posoudit vliv testované látky na raná vývojová stadia ryb, Princip: Expozice oplodněných jiker v průtočném nebo semistatickém systému ISO 12890:1999 Determination of toxicity by embryo-larval stage of freshwater fish. OECD č. 210: Embryolarvální test toxicity na rybách - výsledkem je stanovení nejnižší účinné koncentrace (LOEC) a koncentrace, která nezpůsobuje poškození ryb (NOEC). OECD č. 212: Embryonální test toxicity na rybách - výsledkem je stanovení nejnižší účinné koncentrace (LOEC) a koncentrace, která nezpůsobuje poškození ryb (NOEC). Embryonální test na jikrách a plůdku - 6-7 dní expozice, čistě embryonální stadium -11 druhů, nejčastěji danio, pstruh, kapr, halančík - ukončení testu těsně před tím než dojde k úplné absorpci žloutkového váčku v kontrole Embryolarvální test - test na raných vývojových stadiích ryb - 31 dní expozice - nejčastěji kapr obecný a pak dalších 16 druhů - krmení Artemia šalina -100 ks na nádobu Sledované parametry: líhnutí a přežívání embryí, vzhled váčkovitého plůdku, rozdíly v chování, pohyblivost, na konci testu velikost - délka a hmotnost, anomálie ve vývinu T, pH, 02, koncentrace látky v testu Výsledky: LOEC, NOEC, vliv látky na líhnivost a dobu líhnutí, délkohmotnostní růst, výskyt morfologických odchylek Validita testu -jako u akutního + líhnutí v kontrole přes 80 %, přežití v kontrole přes 75 % Test ovlivnění růstu na nedospělých rybách OECD č. 215 Fish iuvenile growth test (2000) Cíl: posouzení účinků dlouhodobé expozice chemickými látkami na růst nedospělých ryb Druhy: doporučován nedospělý pstruh duhový (Oncorhynchus mykiss), možno i Brachydanio rerio (danio pruhovaný), Oryzias latipes (halančík japonský) Průtočné nebo semistatické uspořádání 28 dní expozice Vystavení ryb subletálním koncentracím Sledované parametry: přírůstek ryb v jednotlivých nádržích T, pH, 02, koncentrace látky v testu Výsledek: LOEC, NOEC, ECX = koncentrace, která vyvolá X% změnu růstu Metoda pro stanovení bioakumulace -průtoková zkouška na rybách • OECD č. 305: Bioaccumulation flow-through fish test (OECD 1996b) Dvě fáze: • Fáze příjmu - 28 dní (až 60 dnů k dosažení rovnovážného stavu) • Fáze vylučování • Počet ryb - pro každý odběr 4 ryby (min. 5 odběrů během příjmu, 4 odběry během vylučování) • Bioakumulační faktor BCF = rychlost příjmu/rychlost vylučování = koncentrace testované látky v rybách/koncentrace látky v okolním mediu BCF = ku/kd = Cf/cw • - vztažen k celkové hmotnosti a k obsahu tuku • Validita: mortalita menší než 10% Testy toxicity na rybách VALIDITA Výsledky se považují za platné-správné, jsou-li splněna následující kriteria: >Koncentrace rozpuštěného kyslíku neklesla pod 60% nasycení >Koncentrace testované látky neklesla pod 80% >Mortalita kontrolního vzorku nepřesáhla 10% >Teplota byla po celou dobu testu v rozmezí stanoveném pro daný druh ryb >Zjištěná koncentrace LC 50 je v souladu se standardy Testy toxicity na rybách Protokol • Údaje o látce - vlastnosti • Údaje o organismech - druh, kmen, velikost, stáří dodavatel, ošetření • Testovací postup - aerace, pH, T, objem, rybí obsádka, koncentrace, počet ryb na koncentraci, počet opakování • Vyhodnocení - výsledky, LC50 a konfidenční intervaly, grafy, LOEC a NOEC, zhodnocení všech sledovaných parametrů