Embry •i# 1. zygotická 2. somatická neze III situ í/j vitro Vývoj embrya = embryogenéze Nahosemenne rostliny Krytosemenne rostliny Makrosporogeneze = tvorba makrospor samicí archespor J makrosporocyt Meióza 1,11 tetrada haploidních makrospor Makrogametogeneze = tvorba zárodečného vaku tetráda haploidních makrospor ,, 1 fungující makrospora (makrospory) mitoticka dělení mladý zárodečný vak diferenciace buněk zralý zárodečný vak = samicí gametofyt monosporický, bisporický, tetrasporický Zárodečný vak typu Polygonum functional nnegaspore coenoc/tic phase Bioassays 28:1067-1071, 2006 Anatropní vajíčko - schema .■■ T*?" -'-l-i-At^^. nuclei :n: ^ h L ů£ů'í Micrüpylc -Antipodal ■ Integuments J ŕ - Základní typy vajíček krytosemenných rostlin 6oebel 1933 ortotropní anatropní hemitropní kampylotropni amfitropní (atropní) Embryogenéze Rostlinné embryo je charakterizováno svým původem, svou morfologií a svým vývojem v čase. Původ: zygotická embrya vznikají ze zygoty, která je výsledkem fůze gametických buněk - zárodečný vak somatická embrya (syn. asexuální embrya, adventivní embrya, embryoidy) se vyvíjejí ze somatických buněk Morfologie: plně vyvinuté embryo je bipolární struktura se stonkovým meristémem na jednom konci a kořenovým meristémem na konci druhém; dále je charakterizováno specifickým typem listů, tzv. dělohami. Vývoj embrya v čase je charakterizován sledem typických morfologických stadií zygota globulární embryo srdcovité embryo hruškovité (torpédovité) zralé embryo Modelové rostliny z čeledi Brassicaceae Capsella bursa-pastori s L. Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. courtesy of Chris Somcrvillc) Embryogenéze Capsella bursa-pastoris zygote lineární embryo 9,obutórrií ^t^ suspenzor c/bbularní embryo srdcovité embryo hruškovité (torpedovite) ----------embryo Erdelská 1981 Poddubnaja-Arnoldi 1976 Copse I/o bursa-pastor is - globuldtrni embryo torpedovite embryo vývojová stadia embrya starší torpedovite zralé embryo embryo http: //botit. botany. wise. cdu Stadia embryogenéze Arabidopsis thai tana http://people.whitman.edu/^vernondm/index.html Preglobular Stage o apical cel fertilized basal cell egg Mature Embryo em bryo .. - ■ v // 'S Globular Staqe f^r------^ '^ ■'■■■■ ) J %&l Vl Heart Stage J Torpedo Stage Mature Embryo cotyledons shoot apical rneristern epidermis seed ooat cotyledons hypoootyl— root- Image adapted from Wolpert, Lewis. (1998) Principles of Development. Oxford University Press, NY Embryogenéze Arabídopsis - Nomarskí DIC 1 preglobulární 2 globulární 3 srdcovité 4 torpédovité DM Vernon and Ď Mcinkc (1994) Ďev. Biol. 165: 566-573. Photos by DM Vcrnon Kultivace izolovaných zygotíckých embryí historie aplikace Historický přehled Bonnet (1754) - klíčeni zárodků fazolu zbavených děloh Sachs - 19. stol.- špatné klíčeni embryí bez endospermu van Tieghem - pěstování izolovaných embryí na rozetřeném endospermu jiného druhu Brown a Morris (1890) - transplantace embryí ječmene do endospermu pšenice Hannig (1904) - nezralá i zralá embrya Raphanusa Cochlearia Knudson (1920 - 1930) rostliny ze zárodků Orchidaceae -kultivace na agarovem médiu s cukrem bez symbiotických hub Dietrich (1924) - možnost zkrácení dormance Historický přehled Raghavan - experimentální embryológie Torrey Monnier - izolace globulárních embryí Capsella Norstog - kultivace embryí obilovin Preťová - izolovaná embrya lnu Rangaswamy Bajaj Zenkteler - využití překování aborce embryí po opylení in vitro Semeno a embryo fazolu Phaseolus vulgaris L. osemeni (testa) cikatrikula semenná jizva pupek = hilům plumula apex+prayé listy děloha (kotyledon) hypokotyl radikula Kultura izolovaných embryí aseptické vyjmutí embrya a jeho přenos do vhodného média a optimálních kultivačních podmínek • relativní snadnost získání embryí bez patogenu (povrchová desinfekce semen nebo plodu) • semena s tvrdým osemením - měkčení vodou, pak opakovaná desinfekce • podmínka nutná pro vývoj izolovaných embryí = nepoškození embrya (suspenzor) - preparační mikroskop • výběr média - čím mladší embryo, tím větší nároky Použití kultur izolovaných embryí • překonání dormance semen • prekonaní aborce embryí („embryo rescue") po křížení in situ nebo in vitro mezídruhove hybridy: bavlník, ječmen, rýže, juta, mezírodove hybridy: Hordeum x Secale, Triticum x Secale, Hordeum x Hordelymus, Tripsacum x Zea • monoploidní ječ men • studie experimentální embryogenéze • zdroj mladého materiálu pro mikropropagaci Prekonávaní aborce embryí po opylování in vitro 9 MC Papaver 35 ĎC Galanthus 60 ĎC aggie - horticulture. tomu. edu/f acuity/ king/TissuejCulture_Lecture. ppt Bulbosum Method of Haploid Production Hordeum vulgare ječmen obecný 2n = 2X = 14 X Hordeum bulbosum planý ječmen 2n = 2X = 14 Embryo Rescue haploidní ječmen 2n = X = 7 eliminace chromosomů H. bulbosum zdvojení chromosomů mezidruhový hybrid Hordeum vulgare homozygotní ječmen 2n = 2X = 14 dříve mnohem účinnější metoda pro tvorbu haploidních rostlinek než mikrosporové kultury (ale použití jen u ječmene) nyní, při použití zlepšeného složení média (sacharosa nahrazena maltosou), je mikrosporová kultuře mnohem účinnější (~2000 rostlin ze 100 prašníků) Príklady získaní alopolyploidu Trificum durum (pšenice) 2n = 28 AABB x I Secale cereale (žito) 2n = 14 RR izolace embrya _________________^ haploidní hybrid 2n = 21 ABR .1 vysoce sterilní zdvojení chromosomu Trificale 2n = 42 AABBRR mezidruhový hybrid ag9ie-horticulture.tomu.edu/foculty/ king/Tissue_Culture_Lecture.ppt V. Raghavan 1 % Kultivace izolovaných zralých embryí Z % Kultivace proembryi „in ovulo embryo culture" opyleni a oplození kultura embryí Embryo and ovary culture 10 DAP 30 DAP regenerace regenerace '---------------------* Lammerts van Bueren etol., Luis Bolk Instituut Podélný řez semenem modřínu Larix dexidua (L.)MILL. dělohy SAM hypokotyl embryo haploidní megagametofyt (primární endosperm) kořenová čepička parafínový řez, barveno Heidenheinovým hematoxylinem (osemení odstraněno před procedurou) Mikropropagace konifer Picea 14 DC BA Picea Larix Kultivace izolovaných embryí konifer {Picea, Pinus) • povrchová desinfekce semen • bobtnání semen ve sterilní destilované vodě přes noc • opakování povrchové desinfekce semen • sterilní izolace embryí • inokulace embryí na povrch agarem ztuženého média M-S s přídavkem auxinu a cytokininu (IF), kontrola M-S (1). Stavba embrya kukuřice (Zea mays L.) endosperm perikarp (oplodí + osemení) štítek (scuŤellum) koleoptile plumula rad i ku I a koleorhiza embryo J http: //boti t. botany. wise. edu Izolace a kultivace embryí kukuřice (Zea mays L.) povrchová desinfekce obilek bobtnání obilek ve sterilní destilované vodě přes noc opakování povrchové desinfekce semen sterilní izolace embryí inokulace embryí na povrch agarem ztuženého média M-S. hodnocení experimentu - rychlost růstu klíčních rostlin (délka kořenu a prýtu) Somatická embryogenéze definice, historie objevu iniciace využiti Somatická (adventivní) embryogenéze vývoj bipolární struktury embryonálními stadii bez fůze gamet 1. spontánní SE in vivo somatická pletiva - kapradiny, orch\de]e,Kalanchoe reprodukční pletiva - Citrus, Mango 2. indukovaná SE in vitro nepřímá - přes stadium kalusu přímá - meristémy, zygoticka embrya, klíč ní rostliny Totipotence somatických buněk Každá buňka obsahuje celou sadu genetických informací, které jsou nezbytné k vytvoření celé rostliny. Časová a prostorová exprese genů je přesně regulována, aby došlo k diferenciaci různých orgánů. Indukce SE musí sestávat z ukončení exprese genů vedoucích k diferenciaci orgánů a jejich nahrazení programem embryogenních genů („přepnutí morfogenetickeho programu") auxiny 2,4-D picloram Co víme o somatické embryogenezi a na co se musí výzkum koncentrovat Základní požadavky jsou obecně platné i pro zygotickou embryogenezi = regulace dělení a diferenciace pletiv Požadavky na indukci somatické embryogenéze: • kompetentní buňky • vhodné prostředí • stimul Regeneratíonal responses of various parts of cultured petiole explants of baucus carota (Schäfer et al.,1985). a) růst cytoplazmy a delení buněk = 12 D b) stadium 4 buněk = 14 D c) globularní stadium = 18D d) srdcovité stadium = 24 D e) torpédovité stadium = 28 D f) zralá embrya = 30 D i) rust cytoplazmy a dělení buněk = 5D b) Primordium stonku = 12 D :) objevení se prýtu = 23D embryogenní oblast rhizogenrlí oblast QU °9enni ° a) rust cytoplazmy a dělení buněk = 2D c) primordium korene = 5D d) objevení se korene = 7-10D Produkce somatických embryí odvozených od kořenových explantatö mrkve Steward et al. Science, 143, p. 20-27,1964 Somatic embryo gene sis --------> leat cuttings on culture medium callus growth V$&& callus culture single callus formation somatic embryos (shoots) embryo regenerated plant Lammerts van Bueren etol., Luis Bolk Instituut Somatic embryogenesis of Daucus carota: standard protocol (Ammirato, 1983) Place 0.5-1 cm petiole explant or 0.5cm3 storage root explant on MS agar medium + 4.5 ÜM 2,4-D After 4 weeks growth (dark or lighted) there is enough callus Subculture every 14-18 days Erlenmeyers are placed on a gyrotary shaker and maintained at 25°C and Subculture 2.0 -3.0 g of callus into 50ml of MS liquid medium + 4.5 ^lM 2n4-D contained in a 250 nil Erlenmeyer flask Aseptic ally aspirate and/ or decant the stale medium and re suspend the cells onto culture medium devoid of 2,4-D for initiation of embryo development agitated 125-1Ö0 rprn Awftftft^ww^ftft^ww.í.| ^vvvvvvv^^^vvvvvvvw.;.;.;.;.;.1. Pass the pro embryo suspension through a senes of mesh sieves for a uniform embryo population. Transfer the washed and sieved suspension For more normal development to 50ml of MS basal medium in Erlenmeyers. For more normal embryo development and to inhibit precocious germination, especially root elongation, 0.1-1 llM ÁBÁ can be added cultures should be grown in darkness. Embryos should appear in about 8 days and reach mature size in 10-15 days Í4 Somatic embryos can be placed out on agar medium devoid of 2,4-D for plantlet development TvT \ w Plantlets are transferred to Jiffy pots or verrniculite for subsequent development Vývojová stadia somatických embryí globulární srdcovité torpcdovitc kotyledonární http://www.plant.uoguelph.ca/research/embryo/IM&00003.ôIF Zrání somatických embryí a desikace • Předčasné klíčeni = torpedovite embryo pokračuje v růstu do klíč ní rostlinky bez fáze dozrávání = chybí zásobní látky a tolerance k vyschnutí • Akumulace zásobních proteinů • Nárůst obsahu kyseliny abcisové Nepřímá somatická embryogenéze somatická embrya Aesculus hippocastaneum odvozená z květenství Nepřímá somatická embryogenéze na kalusu Inu Somatická embryogenéze u dřevin Hevea brasiliensis mm »^^f 7m- *J^-i Sitka spruce (Picea sifchensis) (Photo: Dr. P.Krogstrup) Jednobuněčný versus mnohobuněčný původ SE Haccius (1978) SE - nová individua vznikající z jedné buňky a jsou bez spojení s cévními svazky materského pletiva Raghavan (1976) a jiní mnoho případů, kde zjevně bipolární embryoidy vznikly z agregátů buněk Maheswaran et Williams (1985) - u přímé SE existuje gradient spojený s postupnou diferenciací pletiv - viz schema Rozdíly mezi přímou a nepřímou SE (Sharp et al. 1980) přímá SE - embryogenní buňky jsou již přítomny na explantátu = pre-embryogenně determinované buňky (PEDC), které potřebují pouze vhodné podmínky, aby došlo k expresi embryogenéze nepřímá SE - napřed musí dojít k redeterminaci diferencovaných buněk = proliferace kalusu a v něm u části buněk se uskuteční indukce embryogenně determinovaného stavu (IEĎC) Kompetence k somatické embryogenezi u mrkve Generally speaking, some hierarchical order within the plant seems to exist for many species, with highest success using embryonic cell material, followed by that of the hypocotyl, the petiole, the young leaves and finally the root (Fig. 4). Embryo > Hypocotyl > Petiole > Leaf lamina > Root Fig. 4 Competence to somatic embryogenesis in carrot [Daucus carota L.) To this loss of embryogenic competence during ontogenesis, however, some exceptions exist and one of these is Daucus carota. the common carrot. Here it is possible to culture intact six to eight weeks old plants aseptic ally and partly submerged in an appropriate medium containing an auxin, and within about 4 weeks somatic embryos from all parts of the shoot appear (Fig. 5). If IAA is used as the auxin adventitious roots emerge about two weeks earlier (Schäfer et al. 1988). In this system the competence to somatic embryogenesis is apparently preserved beyond the embryo stage and it can be activated rather easily by a suitable environment. embryo > hypokotyl > rapík > listová čepel > koren Umělá semena Syntetická nebo umělá semena jsou jednotlivá enkapsulovana somatická embrya. Termín 'emblíng' se často používá pro označení rostlinek pocházejících ze somatických embryí nebo syntetických semen. Na-alginát se často používá pro enkapsulaci embrya. Byly vyvinuty rovněž speciální gely, které se samovolně rozkládají. Limitující faktory pro širší použití a tvorbu umělých semen ve větším měřítku*. • kvalita a pravidelná tvorba somatických embryí • konverze embryí Příprava umělých semen 2% LF Alginate sert embryo into drop Complex in 100 niM calcium nitrate for 20 minutes Wash capsules in water for 5 minutes Umělá semena embryo enkapsulované v alginátu sodném Problémy: nepravidelnosti utváření SE (často nedokonale vyvinuté, absence meristému, velké interceluláry, absence zásobních látek a ABA) konverze Somatická embrya sóje enkapsulovana v alginátu Ďr. 6riga, Agritec s.r.o. http://people.whitman.edu/-vernondm/embryo/plant.html embryogenéze Arabidopsis http://bibd.uni-giessen.de/ghtm/2000/uni/p000004.htm somatická embryogenéze a biotechnologie http://wwww.cirad.fr/presentation/programmes/biotrop/result ats/biositecirad/es.htm somatická embryogenéze - kaučukovník, rýže, banánovník apod. http://www.botanic-garden.ku.dk/eng/forskning/vaev2.htm somatická embryogenéze -jehličnany Využití SE - praktické i teoretické 1. u mnoha laboratoří je dnes SE základní metodikou pro množení transgenních rostlin 2. zatím ale r\er\\ plně pochopeno ani její cytologické ani fyziologické nebo biochemické pozadí podstaty. 3. praktické aplikace jsou zrejmé, ale SE je stále i objektem základního výzkumu, který by měl vést k pochopení diferenciace jako jednoho ze základních rysů biologických systémů. Otázky pro další výzkum 1. Co je podstatou konstituce embryogenní kompetence na buněčné a molekulární úrovni? 2. Jak jsou embryogenně kompetentní buňky produkovány během ontogeneze rostlin? 3. Molekulární organizace programu somatické embryogenéze a její realizace 4. Jaká je povaha stimulu, který indukuje program embryogenéze u kompetentních buněk? Kultivace drevokazných hub Příklad suspenzní kultury • uchování čisté kultury mycelia na šikmém agar-sladu (pasáž lx ročně) tma, 4°C • nárůst hmoty mycelia - Petriho misky s agar-sladovým médiem termostat, tma, 25°C • pasáž mycelia na povrch skleněných perel s 3% sladem termostat, tma, 25°C • roztřepání mycelia a inokulace do 3% sladu třepačka, 25°C • inokulace substrátu nasyceného 3% sladem termostat, tma, 25°C • indukce tvorby plodnic chladový šok Kultivace drevokazných hub Lentinus tigrinus - houzevnatec tygrovaný (1) Pleurofus osfreafus - hlíva ústřičná (2. 3) rust mycelia na šikmém agaru ve zkumavce 1 týden po pasáži na agar - sladové médium (tma, 25°C) Kultivace drevokazných hub Pleurotus ostreatus - hliva ústřičná rust mycciia na Pctriho misce 2 týdny po pasáži na agar - sladové médium (tma, 25°C) Kultivace drevokazných hub Pleurotus ostreatus - hliva ústřičná rust mycelia na slenených perlách 2 týdny po pasáži na 3% sladové médium (tma, 25°C) Pleurotus ostreatus - hliva ústřičná plodníce kukuřičné šustí a vřetena nasycená sladovým roztokem