Polymorfizmy detekované speciálními metodami s vysokou rozlišovací schopností Stanovení jednonukleotidových polymorfizmů (Single Nucleotide Polymorphisms - SNPs) Příklad jednonukleotidových polymorfizmů • Příklady běžných chorob detekovatelných pomocí SNPs – Parkinsonova choroba – Alzheimerova choroba – Diabetes typu II – Crohnova choroba – Obezita Schematické znázornění metod s vysokou rozlišovací schopností pro identifikaci polymorfizmů v genomech Přehled základních metod • Enzymatické – Ligázová řetězová reakce – Ligace prostřednictvím RCA – AFLP – Sangerovo sekvencování – Pyrosekvencování – CFLP – Kleaváza + “vetřelec” • Konformační – SSCP – ddF – DGGE – DCSA • Hybridizační – Oligonukleotidové čipy – Sekvencování hybridizací – Kvantitativí PCR s fluorescenčními hybridizačními sondami – PNA-sondy • Fluorescenční výměny – Molekulární „majáky“ – FRET – Fluorescenční polarizace • Hmotnostní spektrometrie Polymorfizmy detekované speciálními elektroforetickými metodami • Odhalení lokálních polymorfizmů v DNA je závislé na použití speciálních elektroforetických – Krátké fragmenty DNA o konstantní délce – Elektroforetické separace v závislosti na jejich odlišné sekvenci • Elektroforéza se obvykle provádí v polyakrylamidových gelech • Metody jsou vhodné zejména pro srovnání polymorfizmu na úrovni genů, aniž by bylo nutné stanovovat přímo jejich sekvenci. • Úseky DNA s vhodnou velikostí (100 - 2500 bp) se pro analýzy připravují: • Klonováním • Restrikčním štěpením • Polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) • Výsledky mohou být ovlivněny – hustotou a síťováním polyakrylamidového gelu – teplotou gelu – obsahem přídatných chemických látek v gelu – délkou analyzovaného fragmentu – lokalizací rozdílných sekvencí na analyzovaných fragmentech Konformační polymorfizmus jednořetězců (Single-Strand Conformation Polymorphism - SSCP) • SSCP analýza se obvykle používá pro detekci sekvenčních rozdílů mezi různými alelami téhož genu • Metoda je vhodná pro sledování změn (mutací) na krátkých fragmentech DNA o velikosti 150 - 400 bp • Metoda využívá vytváření rozdílné sekvenčně specifické intramolekulární struktury ssDNA ovlivňující rychlost pohybu při nedenaturujících elektroforetických podmínkách • U delších fragmentů se snižuje diskriminační účinnost a reprodukovatelnost Princip metody SSCP • zvýšení účinnosti SSCP se dosahuje různými modifikacemi: – RFLP-SSCP • přístup kombinující štěpení DNA restriktázami s následnou SSCP • vzdálenost polymorfizmu od konce fragmentu – Vazbou různých látek ovlivňujících elektroforetickou mobilitu ssDNA – RNA-SSCP (je nutno připravit ssRNA transkripcí pomocí T7- nebo SP6-RNA polymerázy) • SSCP je vhodná pro analýzu mutací v prokaryotických (rDNA), eukaryotických a virových genomech • Homozygotní DNA vytváří 2 elektroforetické formy • Heterozygotní DNA obsahující sekvence dvou různých alel vytváří 4 elektroforetické formy Dideoxy fingerprinting (ddF-SSCP) • Hybridní diagnostická metoda využívající dva metodické přístupy: – Sangerovo sekvencování, reakce je na rozdíl od klasického sekvencování prováděna pouze s jedním dideoxy terminátorem. – SSCP • Používá se zejména k detekci mutací u eukaryotických genů. • Mutace jsou detekovány jako výsledek ztráty nebo získání dideoxy-terminačního segmentu nebo na základě rozdílné elektroforetické mobility u alespoň jednoho z dideoxy-terminačních segmentů. Princip ddF Denaturační gradientová gelová elektroforéza (Denaturating Gradient Gel Electrophoresis - DGGE) • Metoda využívá rozdílné elektroforetické mobility u částečně denaturované DNA a DNA v nedenaturovaném stavu • Vzorky o velikosti 150 - 1200 bp se analyzují v polyakrylamidovém gelu s denaturačním gradientem zajištěným – postupně vzrůstající teplotou (TGGE) – vzrůstající koncentrací denaturačního činidla • formamidu • močoviny • dsDNA se pohybuje během elektroforézy v závislosti na její velikosti a pozvolně denaturuje – na začátku elektroforézy není patrný žádný rozdíl v elektroforetické mobilitě – po určité době denaturace ovlivní rychlost elektroforetické migrace (zpomalení vzhledem k dsDNA) – elektroforéza sama umožní odlišit sekvenční polymorfizmus na základě odlišné hodnoty Tm srovnávaných vzorků • Zvýšení rozlišovací schopnosti dosáhneme – připojením GC-svorek na konce analyzovaných fragmentů • zamezíme tím úplné denaturaci až do jednořetězcových forem a zvýšíme – provedením 2-D (dvojrozměrné) DGGE DGGE je vhodná pro • analýzu mutací v eukaryotických genech • diagnostiku dědičných chorob • analýzu mutací v prokaryotických genech – charakterizaci bakteriálních populací na základě DGGE 16S rDNA Sekvenčně specifická elektroforéza zprostředkovaná vmezeření barviv do DNA • Zřídka používaná metoda ke stanovení sekvenčních rozdílů v dsDNA fragmentech do velikosti 1500 bp • využívá vazbu bis-benzimidu (H33342) na AT páry • Elektroforéza se provádí v agarózových gelech s bis-benzimid-polyetylen glykolem • Princip metody – a) vazba bis-benzimidu na AT bohaté fragmenty DNA – b) následné zpomalení elektroforetické mobility dlouhými molekulami polyetylenglykolu u DNA fragmentů bohatých na AT Analýza konformace dvouřetězcové DNA (Double Strand Conformation Analysis - DSCA) • Diagnostická metoda, která využívá rozdílných ohybů v dsDNA (double strand conformation polymorphism - DSCP) ovlivňujících elektroforetickou pohyblivost při nedenaturujících elektroforetických podmínkách v polyakrylamidovém gelu a umožňuje tak rozlišit DNA-řetězce s různou sekvencí. • Metoda využívá předpokladu, že dsDNA ve vodném roztoku zaujímá složitou konformaci s vnitřním zakřivením, které závisí na nukleotidové sekvenci • Zakřivení DNA se může přímo vztahovat ke tření, které fragment dsDNA překonává při elektroforéze v porézních gelech • Substituce páru bází v kritickém místě dsDNA fragmentu vede ke změně vinutí a může zásadně ovlivnit elektroforetickou mobilitu během nedenaturační polyakrylamidové gelové elektroforézy s vysokou rozlišovací schopností • Využívá se k detekci bodových mutací v eukaryotických genech (fragmenty o délce 100-500 bp) Heteroduplexní analýza, analýza pohyblivosti heteroduplexů (Heteroduplex Mobility Assay – HMA) • Diagnostická metoda, která využívá rozdílné elektroforetické pohyblivosti heteroduplexů. Používá se k lokalizaci a detekci bodových mutací v eukaryotických a virových genomech. • homoduplex (homoduplex). Hybridní molekula DNA, jejíž řetězce se vyznačují úplnou komplementaritou. • heteroduplex (heteroduplex). Hybridní molekula DNA vyznačující se neúplnou komplementaritou. Polymorfizmus délky fragmentů vytvořených štěpením enzymem Cleavase (Cleavase Fragment Length Polymorphisms - CFLP) • Diagnostická metoda, která využívá enzymu kleavázy k detekci a lokalizaci polymorfizmů v jednořetězcové DNA • Optimální velikost fragmentů pro tuto analýzu je do 2700 bp. • ssDNA vytváří různé sekundární struktury (vlásenky, vlásenky se smyčkou, křížové struktury) v závislosti na primární struktuře. • Cleavase je specifická endonukleáza, jejíž cílové místo se nachází vždy u paty vytvořené vlásenky na molekule ssDNA. • Enzym nepůsobí na všechny vlásenky (pravděpodobně v závislosti na dalších faktorech ovlivněných strukturou ssDNA). • Mutace (bodové, delece, inzerce) a modifikace v nukleotidových sekvencích ovlivňují sekundární strukturu ssDNA a konečným výsledkem se vytvoření rozdílných míst rozpoznávaných enzymem. CFLP • Po stěpení enzymem Cleavase vzniká spektrum fragmentů charakteristické pro danou molekulu • Separaci fragmentů provádíme na krátkém denaturačním polyakrylamidovém gelu • Metoda CFLP je metodou porovnávající tvorbu vlásenek v jednotlivých jednořetězcích, ale z obecného hlediska je polymorfizmus CFLP analogický s RFLP. • Metoda byla použita na – odlišení bakteriálních patogenů – detekci mutací u rychle mutujících virů – detekci mutací v genech pro rezistenci u bakterií – detekci mutací v eukaryotických genech (např. gen pro p53) Schematický postup CFLP • Příprava koncově značené dsDNA (na obrázku je znázorněno *) • Teplotní denaturace DNA • Ochlazení DNA a vytvoření vlásenek • Štěpení Cleavase I (na obrázku znázorněno | ) • Elektroforéza v denaturačním polyakrylamidovém gelu • (pouze koncově značené DNA jsou detekovány) Vetřelec (Invader®) • Dva oligonukleotidy jako hybridizační sondy: • Invader • Primární signální sonda • Může nést fluorescenční značku • Komplex ve tvaru klapky: • Signální sonda hybridizuje k cílové molekule DNA blíže k jejímu 5‘-konci • Invader naruší tento komplex proti směru a vytěsní 1 bázi • Kleaváza: • Rozpozná vzniklou sekundární strukturu a rozštěpí „klapku“ v pozici 5‘-ramene + 1 báze ze signální sondy • Detekce: • Na základě vzniku fluorescence metodou FRET • Pomocí hmotnostní spektrometrie Test rezistence k RNáze (RNase protection analysis) • Diagnostická metoda používaná k detekci a lokalizaci bodových mutací v RNA. • Používá se RNáza A, která štěpí úseky ssRNA, kde nedošlo k vazbě ^32P značené sondy připravené ze standardního genu. • Touto metodou lze detekovat ~ 50% bodových mutací. • Využívá se zejména u rychle mutujících RNA-virů DNA čipy pro hybridizační analýzu • DNA čipy slouží k paralelnímu provádění DNA hybridizace testované DNA s velkým počtem (desetitisíce) sond. • Jejich hlavní aplikací je vyhledávání polymorfizmů, např. SNP, nebo srovnávání vzorků RNA izolovaných z různých buněk. • DNA čip je malá destička nesoucí velký počet sond DNA, které se vzájemně liší svou nukleotidovou sekvencí a na čipu jsou umístěny v definovaných polohách. • Sondy jsou – synteticky připravené oligonukleotidy přímo na povrchu čipu – Krátké molekuly DNA nanášené s použitím robotických systémů na skleněný či nylonový povrch matrice „array“ • cDNA • PCR produkty • U prvních používaných DNA čipů byly sondy DNA nakapány na povrch mikroskopického sklíčka nebo na nylonovou membránu za vzniku uspořádaného seskupení 6400 (80x80) sond na ploše 18x18 mm. • Novější technologie přípravy DNA čipů využívají fotolitografii • Umožnuje syntetizovat sondy s různou sekvencí přímo na povrchu čipu a dosáhnout tak na stejné ploše podstatně vyšší hustoty sond (až milion oligonukleotidů na cm^2). • Při vyhledávání SNP je tak možné v jediném pokuse prověřit až půl milionu polymorfismů za předpokladu, že jsou k dispozici oligonukleotidy pro obě alely každého SNP. • Prakticky se při práci s DNA čipy postupuje tak, že je čip inkubován se značenou cílovou DNA za podmínek, umožňujících hybridizaci k sondě. • Poloha oligonukleotidové sondy, k níž se hybridizuje testovaná DNA, se stanoví detekováním emitované fluorescence na povrchu čipu pomocí konfokálního mikroskopu nebo laserového detektoru. Stanovení SNP pomocí DNA čipu 1. Varianta – Prodloužení primeru vázaného na čipu O/ Jeden primer pro každý SNP, který genotypizujeme je imobilizován na sklíčku. O/ K čipu jsou přidány multiplex PCR produkty, 3’ fluorescenčně značené ddNTPs a DNA-polymeráza. O/ Proběhne prodloužení primeru o jeden ddNTP a výsledek reakce je vyhodnocen. O/ Pozice primeru na čipu definuje, který SNP analyzujeme a fluorescence nukleotidu určuje genotyp příslušného SNP. Stanovení SNP pomocí DNA čipu 2. Varianta – Alelově specifické prodloužení primeru O/ Na sklíčku jsou imobilizovány dva alelově-specifické primery s bází na 3‘-konci komplementární k oběma možným variantám nukleotidů v každém SNP. O/ Produkty multiplex PCR jsou přepsány do mnoha kopií RNA pomocí RNA-polymerázy. O/ Molekuly RNA hybridizují k čipu a slouží jako templát pro prodloužení primeru, které je katalyzované pomocí zpětné transkriptázy O/ Během zpětné transkripce jsou do každého produktu začleněny fluorescenčně značené dNTP. O/ Pro homozygotní genotypy je signál tvořený pouze jedním ze dvou alelově-specifických primerů kdežto u heterozygotních genotypů je signál tvořený oběma primery. Stanovení SNP pomocí DNA čipu - minisekvencování 3. Varianta – Prodloužení primerů nesoucích specifickou sekvenci na 5‘-konci O/ Cyklické prodloužení primeru o jeden dideoxynukleotid je prováděno s denaturovanou DNA v roztoku za přítomnosti O/ fluorescenčně značených ddNTPs, O/ DNA-polymerázy O/ primerů nesoucích na 5‘-konci přídatnou sekvenci (tag). O/ DNA-čip, který je komplementární k přídatným sekvencím primerů (tag array) je potom použit pro zachycení produktů cyklické minisekvenační reakce. Stanovení SNP pomocí DNA čipu - RCA (Rolling Circle Amplification) • Metoda pracuje na principu amplifikace signálu na DNA-čipu • Studovaná cílová molekula DNA je denaturována • Při hybridizaci k cílové sekvenci ligáza katalyzuje spojení dvou oligonukleotidových sond z nichž jedna je imobilizovaná na pevném podkladu čipu • Ligace nastane pouze tehdy jestliže je 5‘ báze v místě SNP přesně komplementární k cílové DNA (je 500× efektivnější než při nehomologickém páru) • Rozdíly v sekvenci na 5‘-konci poskytují možnost specificky a simultánně detekovat jednotlivé varianty SNP • f29 DNA-polymeráza katalyzuje izotermní replikaci formou otáčivé kružnice, inkorporuje značené nukleotidy a rostoucí řetězec je vytěsňován RCA v homogenním roztoku • Ligáza katalyzuje ligaci sondy ve formě otevžené kružnice, která přesně svými 3‘- a 5‘-konci hybridizuje k místu se SNP • Hybridizace náhodných hexanukleotidů • Replikace otáčivou kružnicí pomocí DNA-polymerázy fága 29 • Vznikme až 10^9 kopií sekvence Alelově specifické ologonukleotidy (ASO) • Identifikace PCR-produktů • Rutinně lze provádět obrácenou tečkovou hybridizací: