Diagnostické amplifikační metody nevyužívající PCR Amplifikační metody umožňují detekovat jedinou kopii cílové DNA, zatímco při hybridizačních metodách musí být k dispozici minimálně 10^4 -10^5 kopií DNA, aby bylo možné při detekci získat signál. Přehled metod používaných pro amplifikaci nukleových kyselin Amplifikační systémy založené na transkripci (TAS a 3SR) • Transcription-based Amplification System: metoda využívá pro amplifikaci nukleových kyselin transkripci in vitro. • Každý cyklus TAS se skládá ze dvou částí: – syntéza molekuly DNA, která je komplementární k cílové nukleové kyselině (RNA nebo ssDNA) – transkripce nově syntetizované cDNA, která slouží jako intermediát a templát pro RNA polymerázu in vitro. • Syntéza cDNA je umožněna připojením speciálně navržených primerů: – oblast primeru směrem ke 3‘-konci je komplementární k cílové DNA – oblast primeru směrem k 5‘-konci tvoří specifická sekvence obsahující promotor pro T7 RNA polymerázu. Amplifikační systémy založené na transkripci (TAS a 3SR) • V prvním kroku je po připojení primeru pro každou cílovou RNA nebo ssDNA syntetizována molekula ssDNA pomocí zpětné transkriptázy. • Syntéza druhého řetězce vyžaduje tepelnou denaturaci *RNA-DNA nebo DNA-DNA hybridních molekul. • Po přidání druhého primeru a opět zpětné transkriptázy, probíhá syntéza druhého řetězce. Výsledná kopie dsDNA obsahuje funkční T7 promotor na jednom nebo obou koncích cDNA. • Po přidání T7 RNA polymerázy dochází k transkripci cDNA a z každého templátu vzniká až 40 molekul RNA (toto je amplifikační krok). TAS a 3SR Amplifikace DNA vytěsňováním řetězce (Strand Displacement Amplification - SDA) • SDA je založená na schopnosti DNA polymerázy iniciovat syntézu DNA v místě jednořetězcového zlomu uvnitř cílové molekuly a vytěsnit řetězec se zlomem během syntézy nového řetězce DNA. • Takto vzniklé jednořetězce slouží jako substrát prodalší SDA-reakci a isotermní akumulaci dvou- a jednořetězcových kopií cílové molekuly. • Klíčem technologie je vytvoření místně specifických jednořetězcových zlomů pomocí restrikční endonukleázy. Za normálních podmínek restrikční endonukleázy štěpí oba řetězce, což není pro SDA vhodné. • Při syntéze DNA je proto použit jeden z nukleotidů a-thio-subtituovaný (např. deoxyadenosin-5‘-a-thio-trifosfát, dGTP, dCTP a dTTP). Jeden z řetězců syntetizované DNA potom obsahuje modifikované nukleotidy. • Restrikční endonukleáza v takto modifikovaném rozpoznávacím místě štěpí pouze jeden řetězec a vytvoří místně specifický jednořetězcový zlom. • Pro SDA se používá dvojice primerů s dvěma funkčními oblastmi: – oblast směrem k 3‘-konci obsahuje 15 až 20 bp dlouhou sekvenci komplementární k cílové molekule DNA – oblast směrem k 5‘-konci obsahuje rozpoznávací sekvenci pro restrikční endonukleázu. Strand Displacement Amplification - SDA Reakce zahrnuje následující kroky: • denaturaci cílové molekuly dsDNA • připojení SDA primerů • syntézu a-thiolovaných řetězců pomocí DNA polymerázy • štěpení jednoho řetězce restrikční endonukleázou • reakci s DNA polymerázou (s deficientní 3‘®5‘ exonukleázovou aktivitou) • nový cyklus s vytěsněnými řetězci obou polarit • Použití a aplikace SDA: – detekce různých mykobakterií na základě amplifikace IS6110 • Nevýhody: – Cenově náročná metoda. – Je potřeba vhodná restrikční endonukleáza. – Další rozpoznávací místo pro restrikční endonukleázu se nesmí nacházet v amplifikované sekvenci. Skupina metod pro amplifikaci molekuly navázané sondy Alternativní metody pro detekci nízkého počtu molekul cílové sekvence využívající amplifikaci samotné sondy po vazbě na cílovou sekvenci. Amplifikace RNA-sondy pomocí Qb-replikázy • Qb-replikáza je RNA-dependentní RNA polymeráza, která replikuje genomovou RNA bakteriofága Qb (Leviviridae). Enzym rozpoznává specifickou sekundární strukturu RNA tvořenou párováním bazí uvnitř molekuly bakteriofágové RNA. Jiné sekundární struktury RNA nejsou enzymem rozpoznávány. • Sonda se připravuje transkripcí in vitro. Pro konstrukci sondy, která je schopná replikace se využívá: – predikce sekundární struktury RNA podobné standardní struktuře v genomu bakteriofága – sonda nese navíc ve smyčce s vlásenkou na 3‘ nebo 5‘ konci sekvenci specifickou pro cílovou molekulu. • Po provedení hybridizace se volná sonda se odstraní RNázou III (u navázané sondy chybí rozpoznávací místo pro RNázu III v důsledku změny sekundární struktury po vazbě na cíl). • Systém s Qb-replikázou byl vyvinut za účelem zesílení hybridizačních signálů amplifikací samotné sondy. • Využívá se pro detekci obtížně kultivovatelných mikroorganizmů, např. Chlamydia trachomatis. Amplifikace sondy Qb-replikázou Ligázová řetězová reakce (Ligase chain reaction - LCR) • Amplifikace cílové sekvence pomocí ligázy je alternativní metoda pro amplifikaci oligonukleotidové sondy navázané na cílovou sekvenci využívající DNA ligázu. • Při LCR se nevytváří nové kopie cílové sekvence, proto se řadí do skupiny metod pro amplifikaci sondy. • Metoda využívá DNA ligázu ke spojení dvou párů komplementárních oligonukleotidových sond po jejich připojení na cílovou sekvenci. – Úspěšná ligace proběhne pouze při dokonalém párování 3‘ a 5‘ konců obou oligonukleotidových sond k cílové molekule. • Po proběhnutí první úspěšné ligace vzniká produkt, který napodobuje původní molekulu a slouží jako templát pro připojení zbývající dvojice oligonukleotidů a jejich ligaci. • Nevýhodou ligázové amplifikační reakce (LAR) je teplotní nestabilita DNA ligázy a nutnost přidávát ligázu po každé denaturaci. – V současnosti sepoužívá ternostabilní DNA ligáza z Thermus aquaticus, která je stabilní po mnoha cyklech denaturace (LCR). Ligázová řetězová reakce (LCR) Použití LCR • pro detekci obtížně kultivovatelných patogenů – Neisseria gonorrhoae – Borrelia burgdorferi – Mycobacterium sp. • pro detekci mutací v lidských genech (dědičná nemocnění) Oligonukleotidové ligační stanovení (OLA) • Modifikace LCR využívající pouze jedné dvojice sousedících oligonukleotidů může být kvantitativní metodou – ligázová detekční reakce (LDR) – oligonukleotidové ligační stanovení (OLA) • Lineární kinetika amplifikace • Ve spojení s analýzou produktů PCR, kde se dá očekávat dostatečné množství templátu, je OLA používáno jako účinný detekční systém bodových mutací (PCR-OLA). • Tento přístup nevyžaduje průkaz amplifikovaného produktu na elektroforéze – využívá 5'-koncového značení první oligonukleotidové sondy afinitní značkou - biotinem a opačného konce druhé sondy reportérskou značkou (např. fluorescenční látka, digoxigenin nebo alkalická fosfatáza). – Pouze po ligaci jsou obě značky neseny jednou molekulou. – Po ligázové reakci jsou produkty zachyceny na afinitní matrici se streptavidinem a nezligované reportérské sondy jsou odmyty. – Navázaný materiál je měřen na základě • fluorescence, • barevné reakce • enzymatické aktivity • FRET – může se stát v budoucnu rozšířenou automatizovanou metodou využívající DNA-čipy pro detekci nízkokopiových cílů a změn v nukleotidových bázích Amplifikace otáčivou kružnicí - RCA (Rolling Circle Amplification) • Metoda amplifikace sondy navržená pro detekci jednonukleotidových polymorfizmů přímo v genomové DNA. • Pro každý polymorfizmus je navržena alelově specifická sonda, kterou tvoří oligonukleotid dlouhý 80 až 90 bází. – Fosforylovaný 5'-konec sondy nese přibližně 20 nukleotidů, které hybridizují k oblasti bezprostředně vedle 5' polymorfního místa. – 3'-konec sondy obsahuje 10 až 20 nukleotidů, komplementárních k oblasti bezprostředně vedle 3' polymorfního místa. • Používané alelově-specifické sondy jsou identické s výjimkou báze na 3'-konci, která se liší tak aby byla komplementární k polymorfnímu místu. • První krok RCA zahrnuje – společnou hybridizaci obou konců sondy s cílovou sekvencí (vytvoření otevřené kružnice) – diskriminační ligaci sondy termostabilní ligázou, jejímž výsledkem je kružnicová ssDNA. – Ligační krok proběhne pouze v případě, že se 3'-konec sondy páruje s polymorfním místem. • Mezi koncovými rameny sondy, která jsou cílově specifická pro detekovanou sekvenci jsou vtěsnaná vazebná místa pro RCA-primery. • Druhý krok RCA zahrnuje – hybridizaci RCA-primerů, případně náhodných hexanukleotidů na cirkularizovanou sondu – izotermní replikaci otáčivou kružnicí v přítomnosti DNA-polymerázy vytěsňující řetězce (např. DNA-polymeráza fága 29) – Prodlužující se řetězce jsou vytěsňovány a tvoří jednořetězcové konkatemery původní sondy, na které se mohou vázat další RCA-primery a vytvořit složité replikativní struktury RCA v homogenním roztoku • Ligáza katalyzuje ligaci sondy ve formě otevžené kružnice, která přesně svými 3‘- a 5‘-konci hybridizuje k místu se SNP • Hybridizace náhodných hexanukleotidů • Replikace otáčivou kružnicí pomocí DNA-polymerázy fága 29 • Vznikme až 10^9 kopií sekvence Stanovení SNP pomocí DNA čipu a RCA • Metoda pracuje na principu amplifikace signálu na DNA-čipu • Studovaná cílová molekula DNA je denaturována • Při hybridizaci k cílové sekvenci ligáza katalyzuje spojení dvou oligonukleotidových sond z nichž jedna je imobilizovaná na pevném podkladu čipu • Ligace nastane pouze tehdy jestliže je 5‘ báze v místě SNP přesně komplementární k cílové DNA (je 500× efektivnější než při nehomologickém páru) • Rozdíly v sekvenci na 5‘-konci poskytují možnost specificky a simultánně detekovat jednotlivé varianty SNP • f29 DNA-polymeráza katalyzuje izotermní replikaci formou otáčivé kružnice, inkorporuje značené nukleotidy a rostoucí řetězec je vytěsňován Technologie cirkulující sondy – Cycling Probe Technology (CPT) • CPT využívá hybridizaci cílové sekvence DNA (může být použit i amplifikovaný produkt PCR) s chimérickou na obou koncích fluorescenčně značenou DNA-RNA-DNA sondou • Sonda po navázání na komplementární sekvenci poskytuje vytvoření štěpitelného místa pro RNázu H. • Reakce probíhá za specifické konstantní teploty, která umožňuje jak hybridizaci sondy, tak zachování templátové DNA v jednořetězcovém stavu. • Vytvořený duplex chimérické sondy a cílové sekvence je rozpoznán RNázou H a RNA-sekvence sondy je degradována. • Rozštěpené fragmenty sondy nemají v cílovém místě při reakční teplotě stabilní vazbu a disociují do prostředí. • Uvolněná fluorescenčně značená část sondy emituje fluorescenci, jejíž intenzita je měřena. • Cílové místo je potom volné, hybridizuje s další sondou a celý cyklus se opakuje • Fragmenty sondy se akumulují lineární kinetikou a slouží jako základ pro detekci a kvantifikaci cílové sekvence. • Výhodou oproti PCR je, že cílová sekvence sama o sobě není amplifikována a tím se minimalizuje riziko přenosu kontaminace. Současnou snahou je optimalizace reakce CPT tak, aby bylo možné detekovat jednonukleotidové polymorfizmy. Amplifikace signálu • Pro zvýšení citlivosti hybridizačních metod je možné použít alternativní techniky k technikám enzamatickým (založeným na polymeráze nebo ligáze). • Zesílení signálu vytvořeného navázanou sondou může být dosaženo – větší reportérskou molekulou – skupinou více molekul připojených na samotnou sondu (složené sondy) • Výsledkem metod pro amplifikaci signálu nejsou amplifikované sekvence DNA, proto jsou tyto metody více citlivé na kontaminaci a nespecifické signály • Detekční citlivost metod pro amplifikaci signálu je vyšší než u klasických hybridizačních metod s autoradiografickou barevnou nebo chemiluminiscenční detekcí. Amplifikace signálu pomocí složené sondy