Manipulace s nukleovými kyselinami podmiňují • enzymy - zásahy do struktury DNA a RNA • vektory – klonování fragmentů DNA a RNA • hybridizace – identifikace specifických sekvencí Výhody enzymů: - vysoká specifičnost reakcí - možnost pracovat s malým množstvím substrátu Klasifikace enzymů, jejichž substrátem jsou nukleové kyseliny Podle typu substrátu: - DNA enzymy - RNA enzymy Podle typu reakce: - enzymy anabolické = polymerázy - enzymy katabolické = nukleázy - enzymy spojující řetězce nuk. kyselin = ligázy - enzymy modifikující nukleové kyseliny Enzymy modifikující DNA Enzymy spojující molekuly DNA Restrikční endonukleázy (RE) • endonukleázy izolované z bakterií • spolu s metylázami představují jednoduché varianty imunitního systému: jejich úkolem je ochrana bakteriálních buněk před cizorodými molekulami DNA • součást restrikčně modifikačních systémů • omezují propagaci bakteriofágů (např. fág namnožený v kmeni C E.coli nemůže účinně infikovat E.coli kmen K, protože fágová DNA je v kmeni K účinně degradována) • DNA hostitelské buňky je před účinkem vlastní endonukleázy chráněna metylací • objevitelé : H.O. Smith, K.W. Wilcox, and T.J. Kelley, (Johns Hopkins University, 1968) Restrikce bakteriofága Význam restrikčních endonukleáz • nástroj pro přípravu rekombinantních molekul DNA • prostředek pro studium struktury, organizace, exprese a evoluce genomu • základ pro genové inženýrství Vlastnosti restrikčních endonukleáz • sekvenčně specifické endonukleázy • producenty jsou bakterie • štěpí dvouřetězcové molekuly DNA většina RE rozeznává palindromy („radar“) • štěpí oba řetězce DNA • rozdělují se do tříd Tři třídy RE • rozdělení založeno na způsobu štěpení DNA, molekulové hmotnosti a požadavcích na kofaktory • RE třídy I a III nesou v jediném proteinu aktivitu modifikační a restrikční • v genovém inženýrství se téměř výhradně používají RE třídy II, které mají pouze aktivitu restrikční Restrikční endonukleázy třídy I (EcoK, EcoB) • vážou se na specifické nukleotidové sekvence • štěpí náhodně v místech vzdálených až několik 1000 pb od místa vazby • molekulová hmotnost dosahuje cca 300.000 • zajišťují modifikaci (metylaci) i restrikci DNA • vyžadují kofaktory ATP, Mg^2+ a S-adenosylmetionin • nevhodné pro analýzu sekvencí DNA nebo genové inženýrství Restrikční endonukleázy třídy II • vážou se na specifické (4-8 pb) dlouhé rozpoznávací (cílové) místo (často palindrom) • katalyzují štěpení dvouřetězcových molekul DNA hydrolýzou fosfodiesterových vazeb obou řetězců v restrikčním místě, které je uvnitř vazebného místa nebo v jeho bezprostředním sousedství • produktem jsou definované restrikční fragmenty DNA • štěpení se podrobují všechna cílová místa v dané molekule DNA • molekulová hmotnost: 20.000 - 100.000 • kofaktor: pouze ATP • v současné době známo více než 3500 restrikčních endonukleáz II Restrikční endonukleázy třídy III • vážou se na specifická místa DNA, ale štěpení není sekvenčně specifické • kofaktorem je ATP Charakter cílových míst RE třídy II Orientace cílových míst je důležitá Produkty štěpení restrikčních endonukleáz • tupé („blunt“) konce (po štěpení obou řetězců ve stejném místě) • ostré („sticky“) konce (po štěpení řetězců v různých místech, která jsou obvykle vzdálena 1-4 nukleotidy) - 5´přečnívající („overhang“) - 3´přečnívající Přečnívající kompatibilní konce usnadňují spojení fragmentů DNA pocházejících z různých zdrojů Názvosloví restrikčních endonukleáz např. EcoRI • 1. písmeno: počáteční písmeno rodu produkční bakterie • 2. a 3. písmeno: první dvě písmena druhu produkční bakterie • označení kmene (serotypu) produkční bakterie (ne vždy) • římská číslice vyjadřuje pořadové číslo endonukleázy izolované z dané bakterie Příklady cílových míst některých RE Izoschizomery • různé RE se stejným rozpoznávacím místem (odlišní producenti, reakce může být odlišná) • izoschizomery mohou mít odlišnou citlivost k metylovaným bazím v cílové sekvenci Izokaudamery • různé RE, které mají odlišné cílové sekvence, ale vytvářejí stejné lepivé konce • výhodné pro cílené spojování různých molekul DNA Relaxovaná (uvolněná) specifita (hvězdičková aktivita) • schopnost RE štěpit kromě cílového místa také jiné - příbuzné sekvence • většinou za neoptimálních reakčních podmínek • Např. EcoRI může vedle sekvence GAATTC štěpit i sekvence GGATTC, GGATTT, AGATTT Citlivost RE k metylaci bází v rozpoznávací sekvenci + + AC - štěpení je inhibováno přítomností N^6-metyladeninu nebo 5-metylcytozinu 0 0 AC - štěpení není přítomností N^6-metyladeninu nebo 5-metylcytozinu ovlivněno Jednotka RE množství RE, které zcela rozštěpí 1 mg DNA fága Lambda za 1 hodinu při optimální teplotě a v optimálním prostředí Počet restrikčních míst pro daný enzym v molekule DNA klesá s jejich velikostí DNA ligázy • enzymy, které obnovují cukr-fosfátovou kostru DNA tvorbou kovalentní fosfodiesterové vazby za spotřeby ATP nebo NAD • fyziologický význam při replikaci, rekombinaci a reparaci DNA- opravy jednovláknových přerušení • mohou spojit dva jednotlivé fragmenty dvouvláknové DNA - využití při genových manipulacích Reakce katalyzované DNA ligázami Použití DNA ligáz • příprava rekombinantních molekul DNA • spojování fragmentů DNA různého původu (restrikční fragmenty DNA, uměle syntetizované molekuly DNA, produkty zpětné transkripce, atd.) s komplementárními konci • připojování spojek a adaptérů • cirkularizace lineárních molekul DNA Běžné typy DNA ligáz T4-DNA-ligáza • izolována z buněk E. coli infikovaných fágem T4 • spojuje lepivé i tupé konce DNA • opravuje jednořetězcové zlomy („nicks“) v dvouřetězcové DNA, RNA a u hybridů DNA/RNA • vyžaduje přítomnost fosfátové skupiny na 5´konci a OH skupiny na 3´konci molekuly Bakteriální DNA ligáza • izolována z buněk E. coli • spojuje jen DNA s lepivými konci DNA polymeráza I • 3 aktivity, jejichž rychlost je ovlivněna stavem DNA a koncentrací dNTP v reakční směsi: • DNA-dependentní DNA polymerační • 3' ® 5' exonukleázová • 5' ® 3' exonukleázová Polymerace: prodlužování polynukleotidového řetězce ve směru 5´ ® 3´ • matrice čtena ve směru 3´ ® 5´ • tvorba fosfodiesterové vazby nukleofilním atakem 3´OH skupiny rostoucího řetězce a 5´P dNTP za tvorby pyrofosfátu • požadavek přítomnosti primeru Exonukleázová aktivita: 5´ ® 3´i 3´ ® 5´, hydrolýza DNA v obou směrech Degradace DNA ve směru 5´ ® 3´a současná syntéza degradovaného řetězce • oprava chybně začleněných nukleotidů in vivo („proof-reading“) • využití při značení DNA („nick translace“) DNA polymeráza I • jeden aminokyselinový řetězec (109 kDa), ale distinktní domény pro jednotlivé funkce • N-koncová část (323 aminokyselin) zajišťuje nukleázové aktivity • proteolýzou lze vytvořit zkrácené varianty, které postrádají některou z domén • DNA polymeráza I je vhodná pro značení DNA, syntézu cDNA a pro modifikaci konců při tvorbě rekombinantních molekul DNA Klenowův fragment DNA polymerázy I • vzniká odstraněním N-koncové části DNA polymerázy I štěpením subtilisinem • postrádá exonukleázovou aktivitu 5´-3´ Klenowův fragment DNA polymerázy I • syntetizuje vlákno DNA komplementární k danému templátu • jakmile vyplní zářez, nemůže v syntéze pokračovat • komerční enzymy: produkty exprese zkráceného genu kódujícího DNA polymerázu I v bakteriích T7 DNA polymeráza • DNA polymeráza bakteriofága T7 Aktivity: • DNA polymerázová 5'® 3' • 3'® 5' exonukleázová (5'® 3'exonukleázová doména chybí) • velmi podobná Klenowovu fragmentu a T4 DNA polymeráze Metody spojování molekul DNA • s lepivými konci: za vhodných podmínek dochází k párování komplementárních úseků, kovalentní spojení zajistí DNA ligáza B. s tupými konci: - vysokými koncentracemi T4 DNA ligázy - přeměnou tupých konců na lepivé prostřednictvím tzv. linkerů, dále viz A C. s přečnívajícími konci, které nejsou kompatibilní: - terminální transferázou přidat k 3´koncům jednoho fragmentu homopolymerní extenze (např. poly-dA) a k 3´koncům druhého fragmentu komplementární homopolymerní extenze (poly-dT) - „zatupení“ konců (polymerace, degradace) Vytváření rekombinantních molekul DNA in vitro Kohezní konce zvyšují účinnost ligace tupé konce • ligace není efektivní • setkání konců DNA pro ligační reakci je náhodné • vhodné zvýšení koncentrace DNA kohezní konce • probíhá s vyšší účinností • využití tvorby vodíkových vazeb komplementárních bází • prodloužení doby, kdy jsou konce v kontkaktu Ligace tupých konců nezaručuje jednotnou orientaci klonovaného fragmentu DNA Úpravy konců fragmentů DNA Přeměna lepivých konců na tupé: • doplněním chybějících nukleotidů polymerací („filling in“) • odstraněním přečnívající sekvence („trimming back“) Doplnění 3´zkrácených konců polymerací • umožněny přítomností 3´OH skupiny, která se uplatní jako primer (nutná podmínka pro funkci DNA polymerázy) • chybějící sekvence je doplněna polymerací Linkery • krátké synteticky připravené oligonukleotidy (např. CCGGATCCGG) • nesou cílovou sekvenci pro RE (např. BamHI – GGATCC) • v případě, že jsou autokomplementární, postačuje jen jeden řetězec • mají tupé konce Použití: 1. linker se připojí k tupým koncům DNA ligací 2. štěpením RE se vytvoří jednovláknové lepivé konce DNA 3. spojení původně nekompatibilních molekul DNA ligací Význam: • umožňují opatřit jakoukoliv DNA žádoucími konci Použití linkerů • pro usnadnění vazby linkerů a ligace „na tupo“ používají se vysoké koncentrace linkerů • může dojít k vazbě většího počtu linkerů za sebou • odstraní se následným štěpením Použití linkerů Nevýhoda: restrikční místo linkeru nesmí být přítomno uvnitř klonované sekvence Adaptéry • dvojice krátkých synteticky připravených oligonukleotidů, které se spolu částečně párují a přitom vytvoří krátký fragment dvouřetězcové DNA zakončený jedním tupým a jedním přečnívajícím koncem nebo dvěma přečnívajícími konci • ostrý konec je získán bez restrikčního štěpení Použití: • přeměna tupých konců na ostré • přeměna jedné přečnívající sekvence na jinou • ostré konce jsou získány bez štěpení RE Použití adaptérů Způsoby modifikace konců DNA