Imunohistochemie • určení, ve kterých buňkách je daný protein přítomen (obdoba hybridizace nukleových kyselin in situ) • určení, v které části buňky je daný protein přítomen (membránový, cytoplazmatický, jaderný) – lokalizace naznačuje funkci Studium interakcí protein-protein • Dvouhybridní systém • Ko-imunoprecipitace • Knihovna „Phage display“ • Proteinová „microarray“ Interaktom • soubor všech meziproteinových interakcí v dané buňce nebo organismu • celkový skrínink interaktomu umožňuje dvouhybridní systém nebo proteinová „microarray“ Trojhybridní systém Knihovna „Phage display“ • fragmenty DNA se začlení do klonovacího místa uvnitř genu, který kóduje jeden z povrchových proteinů vláknitého fága M13 • fúzovaný gen kóduje proteinovou chiméru, která bude včleněna do fágové hlavy a to takovým způsobem, že cizí protein bude vystaven na povrchu fágové částice • přenesení knihovny „phage display“ do zkumavky nebo mikrotitrační destičky potažené ligandem, protilátkou, receptorem nebo jiným testovaným proteinem • odmytí nenavázaného fága • lze testovat velmi vysoké počty fágových částic a hledat interagující klony Knihovna „Phage display“ • fragmenty DNA se začlení do klonovacího místa uvnitř genu, který kóduje jeden z povrchových proteinů vláknitého fága M13 • fúzovaný gen kóduje proteinovou chiméru, která bude včleněna do fágové hlavy a to takovým způsobem, že cizí protein bude vystaven na povrchu fágové částice Knihovna „Phage display“ • přenesení knihovny „phage display“ do zkumavky nebo mikrotitrační destičky potažené ligandem, protilátkou, receptorem nebo jiným testovaným proteinem • odmytí nenavázaného fága • lze testovat velmi vysoké počty fágových částic a hledat interagující klony Ko-imunoprecipitace • vhodná metoda pro ověření meziproteinových interakcí stanovených dvojhybridním systémem v kvasinkách • savčí buňky se transfekují genem kódujícím testovaný protein • vytvořený protein se z buněk izoluje prostřednictvím protilátek • pokud není k dispozici vhodná protilátka může být protein označen pomocným peptidem FLAG, pak lze k precipitaci použít anti-FLAG protilátku • protein se z buněk precipituje za takových podmínek, že není narušeno jeho případné spojení s jinými proteiny • protein A izolovaný z buněk S. aureus pevně váže protilátky: imobilizovaný protein A je vhodným nástrojem pro izolaci protilátek s připojenými proteiny • proteinové komplexy se rozdělí elektroforézou SDS-PAGE • identifikace asociovaných proteinů je možná protilátkami, hmotnostní spektrometrií nebo sekvenováním proteinů „Protein tagging“ • „tag“ = visačka • „Protein tagging“ znamená označení proteinu připojením zřetelné značky • obvykle se provádí geneticky – sekvence DNA je opatřena segmentem kódujícím „tag“ • sekvence musí být klonována ve vhodném vektoru a přenesena do vhodné hostitelské buňky, která bude syntetizovat označený protein • značku lze využít např. pro účinnou purifikaci proteinu nebo imunoprecipitační experimenty Typy peptidových značek • „His tag“ = polyhistidinový tag • složen ze šesti tandemově uspořádaných zbytků histidinu • přidává se k cílovému proteinu na N- nebo C-konec • „His tag“ se velmi účinně váže k iontům niklu • proteiny označené „His tag“ lze snadno purifikovat chromatograficky na kolonách, kde je nosič opatřen niklovými ionty Protein arrays • umožňují simultánní monitorování interakcí mnoha proteinů • používají se pro biochemické a enzymatické analýzy proteinů a pro studium meziproteinových interakcí • sestaveny z proteinů označených tagy, které umožňují jejich připojení k pevnému podkladu buď ELISA destiček nebo podložním sklíčkům