Hybridizace nukleových kyselin Tvorba dvouřetězcových hybridů ze dvou jednořetězcových a alespoň částečně komplementárních molekul nukleových kyselin Založena na schopnosti denaturace a renaturace DNA. Denaturace DNA • oddělení komplementárních vláken DNA působením vysoké teploty (90-100^oC), extrémních hodnot pH nebo denaturačních činidel (formamid, močovina) • změna v uspořádání bazí při denaturaci zvyšuje absorbci světla při vlnové délce 260 nm (hyperchromní efekt) Renaturace • opětná tvorba dvouřetězcových struktur z jednořetězcových polynukleotidů za vhodných připojovacích („annealing“) podmínek • nastává při pomalém ochlazování (65^oC) roztoku teplem denaturované DNA • nenastává při prudkém ochlazení roztoku denaturované DNA • při renaturaci se mohou tvořit hybridní molekuly DNA/DNA, RNA/RNA i DNA/RNA • rozsah renaturace odpovídá rozsahu komplementarity sekvencí Faktory ovlivňující tvorbu hybridů • teplota • koncentrace solí • stupeň komplementarity • délka fragmentů Využití hybridizace nukleových kyselin • test komplementarity sekvencí (ve směsi mnoha molekul DNA budou hybridizovat jen ty, které jsou dostatečně komplementární) • detekce molekul DNA a RNA, které jsou komplementární k jakékoliv izolované nukleové kyselině • základem hybridizace je obvykle značená sonda o známé nukleotidové sekvenci Faktory ovlivňující rychlost hybridizace • velikost sondy • teplota • iontová síla roztoku • stupeň komplementarity DNA a sondy • koncentrace sondy • komplexita sondy (přítomnost autokomplementárních sekvencí) • nukleotidové složení sondy • přítomnost denaturačních činidel (formamid) • viskozita • pH Uspořádání hybridizačního experimentu je rozmanité podle povahy prostředí, ve kterém probíhá Typický hybridizační experiment – Southernův přenos • technika vyvinuta E.M. Southernem Běžné použití: • detekce přítomnosti určitých genů v buněčné DNA • sledování evoluční příbuznosti vzorků DNA z různých organismů Southernův přenos - postup • příprava a značení sondy • rozdělení restrikčních fragmentů DNA daného vzorku gelovou elektroforézou • denaturace DNA a přenos jednořetězcových fragmentů DNA na nylonový filtr („blotting“ - přesávka) • inkubace filtru se značenou jednořetězcovou sondou: hybridizace sondy s komplementární sekvencí imobilizovanou na filtru • odmytí nenavázané sondy • detekce navázané sondy - vizualizace hybridů (autoradiografie) Typy sond • restrikční fragmenty dvouřetězcové DNA • mRNA izolovaná z buněk nebo tkání • RNA transkripty in vitro • syntetické oligonukleotidy (připravené podle sekvence aminokyselin) Způsoby značení sond • prostřednictvím náhodných hexanukleotidů („random primer DNA labeling“) • posunem jednořetězcového zlomu („nick translation“) • koncovým značením • značením vektoru s naklonovanou sondou • značením transkriptů in vitro Značení konců DNA fragmentů Značení 3´konců DNA T4-DNA-polymerázou Příprava sondy značením vektoru Příprava značených transkriptů Značení syntetických oligonukleotidů Radioaktivita • vyplývá z nestabilní kombinace protonů a neutronů v izotopech • atom má tendenci se rozpadnout a dostat se do stabilnější konfigurace • rozpad radioaktivních izotopů vede k uvolnění energie ve formě záření, které lze monitorovat Detekce radioizotopů • kvalitativní: autoradiografie • kvantitativní: - počítače Geiger - tekutá scintilační spektrometrie Neradioaktivní značení sond DNA • digoxineninem • biotinem • fluorescenčními značkami Neradioaktivní značení nukleových kyselin digoxigeninem Detekce digoxigeninu Neradioaktivní značení nukleových kyselin biotinem K značení NK se používá např. biotin-16-dUTP (analog TTP) Detekce DNA značené bio-dUTP: 1. avidin (streptavidin) - AP konjugát • chromogenní substrát (X-fosfát + NBT) • barevná reakce 2. avidin (streptavidin) - luciferáza • substrát (luciferin) • emise světla 3. avidin (streptavidin) – křenová peroxidáza • substrát (luminol) • emise světla Neradioaktivní značení nukleových kyselin biotinem Typy filtrů pro přenos nukleových kyselin • nitrocelulózové filtry (0,1-0,45 mm) • nylonové membrány (0,1-0,45 mm) • chemicky modifikovaný papír nebo celulóza (DBM - diazobenzyloxymetyl, APT-aminofenyltioester) Způsoby přenosu („blotingu“) • kapilární přenos • elektroforetický přenos • vakuový přenos Kapilární přenos Vakuový přenos Imobilizace nukleových kyselin na filtrech • zapékání • „UV-crosslinking“ Hybridizační postup 1. Prehybridizace - zabránění nespecifické vazbě sondy na membránu (Denhardtův roztok, BLOTTO, heparin, heterologní DNA) 2. Hybridizace - navázání sondy na komplementární sekvence (68^oC, 42^oC s formamidem) - lze volit různé podmínky („stringence“) Hybridizační postup 3. Promývání - odstranění nenavázané sondy (účinnost je ovlivněna teplotou, koncentrací solí) 4. Detekce navázané sondy - autoradiografie - imunologická reakce - barvení - luminiscence - fluoroscence Hybridizační postup 5. Rehybridizace - odmytí navázané sondy - aplikace další sondy Stupeň stringence Blot je hybridizován při podmínkách vysoké stringence pro detekci nukleových kyselin, které jsou vysoce homologní nebo identické se sondou. Typy přenosu („blotingu“) podle typu analyzovaných molekul • Southernův přenos - DNA (Dr. Edwin Southern) • northernový přenos - RNA • westernový přenos - proteiny • southwesternový přenos - proteiny vážoucí DNA (sondou je DNA) • northwesternový přenos - proteiny vážoucí RNA (sondou je RNA) Tečková hybridizace („dot blot“) Postup: • sonikace nebo restrikce genomové DNA; linearizace plazmidové DNA • denaturace • vzorky DNA naneseny na podložku v podobě teček • hybridizace se sondou • hodnocení hybridizace (vizuálně, denzitometrem, b-spektrometrem) Hybridizace in situ Detekce DNA nebo RNA v intaktních buňkách radioaktivními nebo fluorescenčními sondami. Využití: • prostorová lokalizace nukleových kyselin v buňkách a tkáních (hybridizace buněčné RNA) • lokalizace genů (sekvencí) na chromozómech (hybridizace jaderné DNA) Postup hybridizace in situ při studiu chromozómů • příprava cytologického preparátu • fixace objektu na podložním sklíčku • inkubace za přítomnosti ribonukleázy a NaOH (degradace RNA a denaturace DNA, chromozómy se částečně rozbalí a odhalí tak struktury DNA běžně skryté uvnitř chromozómů) • hybridizace se značenou sondou • autoradiografie nebo stanovení fluorescence • barvení preparátu • světelná nebo fluorescenční mikroskopie Obvyklá fluorescenční barviva • fluorescein (zelená fluorescence) • rhodamin (červená fluorescence) • kumarin (modrá fluorescence) Využití hybridizačních technik v praxi Detekce rekombinantních klonů - v bakteriích - ve fágách Postup: • výsev na plotnu (100-1000 CFU/PFU) • růst do velikosti 0,1-0,2 mm • přenos na 1 - 2 filtry • růst na filtru • denaturace DNA • neutralizace • hybridizace • autoradiografie • vyhledání odpovídajících kolonií (plak) obsahujících hledanou sekvenci DNA Používání oligonukleotidových sond odvozených ze struktury proteinů Lokalizace specifických sekvencí v genomové DNA Southernova analýza potomků heterozygotních rodičů (RFLP) Sledování transkripce elektronovou mikroskopií Sledování transkripce elektronovou mikroskopií