Mikroskopické techniky a její
praktické využití
Eva Bártová
Biofyzikální ústav Akademie věd ČR
Brno
Princip fluorescenčního mikroskopu
Excitační filtr,
(nastaven na modrou
tj. 450-490 nm ) Bariérový filtr,
(nastaven na zelenou
tj. 520-560 nm )
Dichroické zrcadlo,
odráží světlo pod 510 nm
a propouští nad 510 nm
Zdroj
světla
Okulár
ObjektivPreparát
LSCM mikroskop
laser
vzorek
skenovací
zrcadla
pinhole detektor
Tandem scanning microscopes
based on Nipkow disk
Source of light
Sample
CCD
rotation
pinholes in the disk
Dichroic mirror
Ar/Kr Laser Innova 70 (Coherent)
Laser head
Internal aperture
Light open/closed
AOTF
Fiber coupling
Rear view on the laser
Screws adjusting rear mirror
Inkubační komůrky pro přímý mikroskop
Termistors in short tubes on
the side of the chamber
Partition with opening
on the bottom of the chamber
(for experiments under upright
microscope)
Cover glass 24x50 mm
Glass tubes bent under the upper glass (to enable CO2
to flow above medium in the part II of the chamber)
Part I ­ cells can be grown
on both upper and lower
sides of the chamber; this
part is filled fully with medium
Part II ­ medium reaches
under the glass tubes; cells
are not grown here
Inkubace živých buněk pod mikroskopem
Inkubační komůrky
Termistor
Skleněné trubičky používané pro
plnění komůrky a pro profukování CO2
Přepážka pro experimenty
na přímém mikroskopu
Krycí sklíčka na vrchní
a spodní straně komůrky
Miska pro sterilizaci v autoklávu
SRL pomocí Cy3-dUTP (červená) a segregace
chromosomových teritorií u jader HeLa buněk s
histonem H2B konjugovaným s GFP (zelená)
1st cycle 3rd cycle after at least 6 cycles
Jedná se o rezonanční
přenos energie mezi blízko
se nacházejícími
molekulami fluorochromů
FRET technika
Interakce mezi dvěma proteiny: CFP-NIPP1, YFP-PP1; vpravo FRET
(svítí speckles, kde NIPP1 směruje PP1); dole mutant NIPP1, který
neváže PP1 ­ FRET nefunguje.
Fluorescence inFluorescence in situsitu HybridisationHybridisation (FISH)(FISH)
3D-FISH a konfokální mikroskopie
Maximální obraz
Všech řezů
Galerie optických řezů
3D reconstrukce CT
Weierich et al., (2003) in press
Segmentace FISH signálů
R 1 G 1 R 5 G 5 R 9 G 9
R 2 G 2 R 6 G 6 R 10 G 10
R 3 G 3 R 7 G 7 R 11 G 11
R 4 G 4 R 8 G 8 R max G max
Automatická analýza obrazuAutomatická analýza obrazu
Automatická analýza obrazuAutomatická analýza obrazu
3D obrázek
CGH onCGH on metaphasemetaphase spreadsspreads
(SRL on neuroblastoma cells with Cy3Cy3--dUTPdUTP ´ - fixed 30´ after labelling)
aa bb
Značení buněk metodou SRL (Značení buněk metodou SRL (sscratchcratch replication labeling)replication labeling)
užitím nukleotidů konjugovaných sužitím nukleotidů konjugovaných s fluorochromemfluorochromem
Schermelleh et a. (2001) Chromosome Res. 9:77-80
Schéma kvantové kuličky
Transmisní Elektronový Mikroskop (TEM)
Skenovací (Rastrovací) Elektronový Mikroskop