Proteomický experiment





                                           PŘÍPRAVA VZORKU
                                                   
                   solubilizace                  močovina, thiomočovina, detergenty
                               redukce                         DTT, TBP
               inhibice                         inhibitory proteáz, fosfatáz, gykosyláz
                                        odstranění kontaminant

                                             DETERGENTY



žádný celkový náboj

0.5 – 4%

použitelné ve vysokých koncentracích močoviny



•            neionogenní

•            zwitterointové



SDS jen v nízkých koncentracích (do 0.25%)







                                         ZÁKLADNÍ PRAVIDLA

§    zabránit proteolýze

§    jednoduchý postup

§    čerstvé reagencie

§    čerstvý vzorek

§    odstranit pevné částice - centrifugace

§    odstranit kontaminanty

                                            KONTAMINANTY

§    soli, zbytky pufrů

§    malé endogenní molekuly

§    iontové detergenty

§    nukleové kyseliny

§    polysacharidy

§    lipidy

§    fenolické látky







                                                2-DE

                                           ROZSAH STRIPU
                                           ROZMĚR STRIPU



                             1. ROZMĚR      IZOELEKTRICKÁ  FOKUSACE    
                                                  

                     migrace nabitých částic v gradientu pH v elektrickém poli





                                         EKVILIBRACE STRIPU

                                      2. ROZMĚR      SDS-PAGE

                            migrace aniontů v elektrickém poli podle MW





                                      BARVENÍ PROTEINU V GELU

                                          BARVENÍ PROTEINU
                                             LINEARITA





                                      ANALÝZA OBRAZU         



                                     Biomarkery v lidské plasmě











                                           2D or not 2D ?

•             rozlišení

•             vizuální aspekty

•             multigelové jednotky

•             dynamický rozsah

•             extrémní proteiny (membránové,basické...)

•             reprodukovatelnost, image analýza

•             citlivost barvení

•             pracnost

•             nesnadná automatizace

•             postdigesční extrakce







                                 Tak by měla vypadat vaše separace…

                                 KERATINY ! ! !  Potlačení ionizace





                                             LITERATURA







                                           PREFRAKCIONACE

                                           PREFRAKCIONACE
                                           MIKRO ROZSAHY 



                                              Deplece