Analýza obrazuAnalýza obrazu
BARVENBARVENÍÍ PROTEINPROTEINŮŮ
ObecnObecnéé popožžadavky na vizualizaci proteinadavky na vizualizaci proteinůů::
vysokvysokáá citlivostcitlivost
šširoký lineiroký lineáárnrníí rozsah zrozsah záávislosti intenzityvislosti intenzity
barvibarviččky na mnoky na množžstvstvíí proteinu v geluproteinu v gelu
kompatibilita s nkompatibilita s nááslednými analýzamislednými analýzami
BarvenBarveníí proteinproteinůů popo gelovgelovéé
elektroforelektroforéézeze
R250R250
CoomassieCoomassie brilliantbrilliant blueblue
G250G250
kyselkyseláá varianta barvenvarianta barveníí
StStřřííbrobro
amoniakamoniakáálnlníí varianta barvenvarianta barveníí
FluorescenFluorescenččnníí barvibarviččkyky ­­ SyproSypro RubyRuby
DeepDeep PurplePurple
FlamingoFlamingo SYPRO Ruby
BarvenBarveníí -- citlivostcitlivost
barvení stříbrem je 10-50x citlivější než Comassie brilliant blue R-250
Citlivost barvenCitlivost barveníí ­­ 2D elektrofor2D elektroforéézaza
Flamingo
celkový protein E. coli
množství proteinu: 10 g/gel
Citlivost barvenCitlivost barveníí ­­ 1D SDS1D SDS--PAGEPAGE
ngng BSA / jamkaBSA / jamka
BarvenBarveníí ­­ rozsah linerozsah lineáárnrníí zzáávislosti intenzityvislosti intenzity
barvibarviččky na koncentraci proteinuky na koncentraci proteinu
Lineární dynamický rozsah
= graf závislosti intenzity barvičky (osa y)
na koncentraci proteinu (osa x)
Barvení stříbrem ­ lineární závislost pouze
v rozmezí do 100ng proteinu.
Při vyšších množstvích odklon od linearity.
PozadPozadíí -- 3D pohled3D pohled
Charakter pozadí
Coomassie blue ­ čisté pozadí s drobnými
skvrnami barvičky
Stříbro ­ čisté pozadí často s horizontálními pruhy
Fluorescenční barvičky ­ obvykle hrubší pozadí
s výraznějšími skvrnami barvičky
(lze snadno odfiltrovat)
Proteinový spotProteinový spot ­­ 3D pohled3D pohled
Charakter píku
Při analýze obrazu pracujeme s intenzitou
(hustotou) barvičky, která je úměrná
množství proteinu.
DetekceDetekce
ViditelnViditelnéé barvibarviččky (CB,ky (CB, AgAg):):
DenzitometryDenzitometry
GS800 BioGS800 Bio--RadRad
FluorescenFluorescenččnníí barvibarviččky (ky (SyproSypro Ruby):Ruby):
FluorescenFluorescenččnníí scanneryscannery
--Ex/Em spektrum se musEx/Em spektrum se musíí shodovatshodovat
s Ex/Em charakteristikami ps Ex/Em charakteristikami přříístrojestroje
StormStorm 840840 MolecularMolecular DynamicsDynamics
(Ex/Em: 450/520(Ex/Em: 450/520 nmnm longpasslongpass))
VyVyřřííznutznutíí spotu z geluspotu z gelu
1) Manu1) Manuáálnlněě (nap(napřř. skalpelem). skalpelem)
-- fluorescenfluorescenččnněě barvenbarvenéé proteinyproteiny je tje třřeba pro manueba pro manuáálnlníí řřezezáánníí zviditelnitzviditelnit..
ExistujExistujíí 2 mo2 možžnosti:nosti:
UVUV--transilumintransilumináátortor ­­ ttřřeba chreba chráánit pokonit pokožžku a oku a oččii
DarkDark ReaderReader transilumintransilumináátortor ­­ UV zUV záářřeneníí je pomocje pomocíí filtru konvertovfiltru konvertovááno nano na
modrmodréé svsvěětlo, ktertlo, kteréé se vyuse využžíívváá pro excitaci (pozadpro excitaci (pozadíí se odfiltruje oranse odfiltruje oranžž. brýlemi). brýlemi)
2) Automaticky2) Automaticky ­­ automatický Spotautomatický Spot CutterCutter napojený na software obrazovnapojený na software obrazovéé analýzyanalýzy
EXQuest Spot Cutter
BARVENBARVENÍÍ ­­ shrnutshrnutíí
EndEnd--point barvenpoint barveníí
Citlivost barvenCitlivost barveníí
KvantifikaceKvantifikace ­­ linelineáárnrníí rozsahrozsah
Charakter pozadCharakter pozadíí
Charakter pCharakter pííkuku
VizualizaceVizualizace
Identifikace / Kompatibilita s nIdentifikace / Kompatibilita s nááslednými analýzami (MS analýza)slednými analýzami (MS analýza)
CenaCena
PDQuestPDQuest
PDQuestPDQuest ­­ obrazovobrazováá analýzaanalýza
NaskenovNaskenováánníí gelugelu (p(přři velki velkéém rozlim rozliššeneníí))
ÚÚpravaprava naskenovannaskenovanééhoho obrobráázkuzku
Detekce spotDetekce spotůů a analýza pozada analýza pozadíí
(vyhled(vyhledáávváánníí spotspotůů a odfiltrova odfiltrováánníí pozadpozadíí))
MatchingMatching ­­ vytvovytvořřeneníí Master geluMaster gelu
-- ppřřiiřřazenazeníí spotspotůů
Editace spotEditace spotůů (vytvo(vytvořřeneníí replikativnreplikativnííchch skupin)skupin)
NormalizaceNormalizace
AnalytickAnalytickéé sety = vyhledsety = vyhledáánníí rozdrozdíílných spotlných spotůů
(kvalitativn(kvalitativníí, kvantitativn, kvantitativníí rozdrozdííly, statistickly, statistickáá analýza)analýza)
ÚÚpravaprava naskenovannaskenovanééhoho obrobráázku geluzku gelu
-- verticalvertical//horizontalhorizontal flipflip
-- rotationrotation
-- croppingcropping imageimage
-- transformtransform
cropping
image
transform
Detekce spotDetekce spotůů a filtrace pozada filtrace pozadíí
nastavennastaveníí parametrparametrůů pro vyhledpro vyhledáánníí spotspotůů a odfiltrova odfiltrováánníí pozadpozadíí
pomocpomocíí SpotSpot DetectionDetection ParameterParameter WizardWizard
výsledkem je tzv.výsledkem je tzv. ScansetScanset ­­ 3 podoby ka3 podoby kažžddéého gelu:ho gelu:
ppůůvodnvodníí scanscan ((RawRaw 22--DD scanscan))
filtrovaný obrazfiltrovaný obraz (odfiltrovan(odfiltrovanéé pozadpozadíí))
gaussovskýgaussovský obrazobraz
gaussovskýgaussovský obraz:obraz:
-- umuměělý obrazlý obraz
-- gaussovskgaussovskéé modelovmodelováánníí = spoty jsou p= spoty jsou přřepoepoččííttáány na ideny na ideáálnlníí
spoty s profilemspoty s profilem gaussovskgaussovskéé kkřřivky, kterivky, kteréé jsou snadnojsou snadno
kvantifikovkvantifikováányny
-- tuto formu obrazu program poututo formu obrazu program použžíívváá pro dalpro dalšíší analýzuanalýzu
MatchSetMatchSet
Soubor gelSoubor gelůů, kter, kteréé se mezi sebou navzse mezi sebou navzáájem porovnjem porovnáávajvajíí v rv ráámci experimentu.mci experimentu.
Jeho nezbytnou souJeho nezbytnou souččááststíí jeje tzv.Master geltzv.Master gel = um= uměěle vytvole vytvořřený gel, který v koneený gel, který v koneččnnéé
ffáázi muszi musíí obsahovat vobsahovat vššechny spoty ze vechny spoty ze vššech gelech gelůů vv MatchSetuMatchSetu..
ProstProstřřednictvednictvíím Master gelu jsou gely srovnm Master gelu jsou gely srovnáávváány mezi sebou.ny mezi sebou.
Members
of MatchSet
Master gel
MatchingMatching spotsspots
PPřřiiřřazenazeníí identických spotidentických spotůů mezi jednotlivými gely. Gely se pmezi jednotlivými gely. Gely se přřiklikláádajdajíí
((strestreččujujíí) na sebe a spoty se automaticky) na sebe a spoty se automaticky matchujmatchujíí s vytvos vytvořřeným Mastereným Master
gelem podle zadangelem podle zadanéé mmííry pry přřesnosti.esnosti.
Zeleně označené
­ zmatchované spoty
Červeně označené
­ nezmatchované spoty
ReplikativnReplikativníí skupinyskupiny
PouPoužžititíí :: mmáámeme--li 2 a vli 2 a vííce gelce gelůů od jednoho vzorku.od jednoho vzorku.
UmoUmožňžňujujíí seskupit kopie gelseskupit kopie gelůů dandanéého vzorku a urho vzorku a urččit prit průůmměěrnou kvantiturnou kvantitu
kakažžddéého spotu.ho spotu.
Analýza gelAnalýza gelůů v replikv replikáách je podmch je podmíínkou pro aplikaci statistických nnkou pro aplikaci statistických náástrojstrojůů
(nap(napřř. Student T. Student T--test).test).
kvantity spotů
v jednotlivých gelech
kvantity spotů
v replikativních skupinách,
které jsou odlišeny barevně
každý spot má
svůj histogram
číslo spotu
NormalizaceNormalizace
SlouSloužžíí k vyrovnk vyrovnáánníí intenzit jednotlivých gelintenzit jednotlivých gelůů, aby mohlo být provedeno kvantitativn, aby mohlo být provedeno kvantitativníí srovnsrovnáánníí..
NejNejččastastěějjšíší zpzpůůsoby normalizace:soby normalizace:
-- surovsurováá kvantita kakvantita kažžddéého spotu na gelu je dho spotu na gelu je děělena celkovou kvantitou vlena celkovou kvantitou vššech spotech spotůů, kter, kteréé bylybyly
zahrnuty do Master gelu tzv.zahrnuty do Master gelu tzv. validovanýchvalidovaných spotspotůů
-- surovsurováá kvantita kakvantita kažžddéého spotu je dho spotu je děělena hodnotou celkovlena hodnotou celkovéé intenzity vintenzity vššech pixel na geluech pixel na gelu
Gel se silnGel se silněějjšíším barvenm barveníím lze dm lze děělit faktorem.lit faktorem.
Slabý gel nSlabý gel náásobit faktorem nelze!sobit faktorem nelze!
AnalytickAnalytickéé setysety
skupiny spotskupiny spotůů, kter, kteréé jsou pro njsou pro náás statisticky a biologicky významns statisticky a biologicky významnéé
umoumožňžňuje vyhleduje vyhledáánníí kvalitativnkvalitativníích i kvantitativnch i kvantitativníích rozdch rozdííllůů mezi gely (mezi gely (replikativnreplikativníímimi
skupinami) a statistickou analýzuskupinami) a statistickou analýzu
KvantitativnKvantitativníí vyhodnocovvyhodnocováánníí::
chyba vyhodnocenchyba vyhodnoceníí softwaru jesoftwaru je 5%5% smodchsmodch,, chyba elektroforchyba elektroforéézy jezy je 30%30%smodchsmodch
v praxi vyhledv praxi vyhledáávváámeme dvojdvoj-- a va víícencenáásobnsobnéé zmzměěny v kvantitny v kvantitěě
SpotSpot reviewreview
vyhledání rozdílných vyřezání spotů z gelu MS-analýza
spotů + digesce
PPřřííklady pouklady použžititíí
SledovSledováánníí vlivu exogennvlivu exogennííhoho cytokininucytokininu (BA) na zastoupen(BA) na zastoupeníí
proteinproteinůů v semenv semenááččccííchch ArabidopsisArabidopsis thalianathaliana
ppřřenos semenenos semenááččkkůů na urna urččitýitý ččasový interval (15, 30, 120 minut) do masový interval (15, 30, 120 minut) do méédia s obsahemdia s obsahem
benzyladeninubenzyladeninu
sbsběěr materir materiáálu kolu kořřeny (eny (rootroot))
nadzemnnadzemníí ččáást (st (shootshoot))
extrakce proteinextrakce proteinůů z rostlinnz rostlinnéého materiho materiáálulu
2D2D elfoelfo
vyhodnocenvyhodnoceníí gelgelůů pomocpomocíí PDQuestuPDQuestu ­­ vyhledvyhledáánníí rozdrozdíílných proteinlných proteinůů
vzhledem ke kontrolevzhledem ke kontrole
vyvyřřezezáánníí spotspotůů + digesce+ digesce
MS analýzaMS analýza