Funkce proteinů 8 Enzymatická/enzymy/ Receptorová/ Přepravní/transportní/ Strukturní/zpevňovací/ i Aktivní pohyb/kontrakční/motor-proteiny Hormonální/hormony/regulace Obranná/specializovaná/imunitní systém/transkripční regulace Zásobní IV. Enzymy Protein-interakce s ligandem Protein-interakce s dalším proteinem nebo DNA Zásobní - zdroj energie, uhlíku nebo dusíku. B2D Postranslační modifikace proteinů. ((S,T,Y,H,D,K,R) ■Glyki (pentosy, deoxyhexosy, hexosaminy, hexosy, N-acetylhexosaminy, kyselina sialová) astnými kyselinami (myristoylace, stearoylacejarnesylace, palmitoylace, geranylgeranylace, kyselina lipoová). itrosylace (C) (C) - disulfidové můstky Methylace, formylace, acetylace Deamidace (Q,N)/carboxylace (E/D) -p Biotinylace Pyroglutamová kyselina (QQ) -p Chemická stabilita fosforylovaných aminokyselin +,stabilní fosfoaminokyseliny; - labilní fosfoaminokyseliny. Fosfoaminokyseliny Stabilita - prostředí Kyselé Zásadité Fosfoserine + _ Fosfothreonine + ± Fosfotyrosine + + Fosfoarginine - - Fosfohistidine - + Fosfolysin - + Fosfát kyseliny asparagové - - Klumpp, S.; Krieglstein, J. Eur. J. Biochem. 2002, 269, 1067. 8 Funkce proteinů Enzymatická/enzymy/ Receptorová/ Přepravní/transportní/ Strukturní/zpevňovací/ i Aktivní pohyb/kontrakční/motor-proteiny Hormonální/hormony/regulace Obranná/specializovaná/imunitní systém/transkripční regulace Zásobní IV. Enzymy Protein-interakce s ligandem Protein-interakce s dalším proteinem nebo DNA Zásobní - zdroj energie, uhlíku nebo dusíku. B2D Terpeny Látky tvořící aroma vína a ovocných extraktů Linalool Flavonoidy Látky přítomné v ovoci s léčivými účinky Quercetin, Naringenin, Daidzein, Resveratrol, Luteolin Nová metoda pro studium kinetických parametrů vzácných glukozidů Velmi rychlá procedura (doba měření 3s) Citlivost 100 nM glukóza Malá spotřeba vzorku (reakční objem 150 jáJ) '-cca' Amplex Red ^oh Peroxidase ho Resorufin C CH, N tŕ n H202 ■;;., CH^OH l4l> — O -*- Glucose Oxidase ho OH C H „OH OH Comparison of metods for determining catalytic rates ■ Absorbance ■ Fluorescence 200 400 600 800 1000 3000 10000 c PNPG (uM) Pavel Mazura Schéma metody Fluorimeter Amplex Ultra Red Resorufin Pavel Mazura 'rogram Origii 4- 3- co 1 - 0 Vyhodnocení kinetických parametrů hydrolýzy zeatin-O-glukozidu E + P • Km = Michaelisova konstan Kcat = rychlost katalýzy (číslo přeměny) Kcat/Km = konstanta specificity Model: Km,kcat ChiA2/DoF = 0.06605 RA2 = 0.95738 Km 697.4338 ±41.30139 kcat 4.58546 ±0.08916 tu T T T T 0 2000 4000 6000 IE = enzym S = substrát ( C ZOG (JVI) ES = enzyme-substrát komplex (přechodný stav) P = produkt 8000 —I— 10000 Pavel Mazura P2 (F193A, F200K, W373K, F461L) P3 (F193A, F200K, W373K, F461L, T189V, D256S, M258A, A462D) P4 (F193A, F200K, W373K, F461L, T189V, D256S, M258A, A462D, Q188W, R331F, P372A, E466A) F193A, F200K, W373K, F461L Jiří Damborský a Pavel Mazura Vícenásobná mutantní analýza enzymu -15 185 200 215 230 wavelength [nm] 245 260 Vzdálená-UV spektra cirkulárního dichroismu divokého typu a jeho mutant P2, P3 andP4. P2 (F193A, F200K, W373K, F461L) P3 (F193A, F200K, W373K, F461L, T189V, D256S, M258A, A462D) P4 (F193A, F200K, W373K, F461L, F189V, D256S, M258A, A462D, Q188W, R331F, P372A, E466A) Radka Fohlerová Cil odelování enzym-substrát komplexu R33 W373 Pohled do aktivního místa mutantu F193A (a) s produktivní a (b) ne-produktivní vazbou substrátu (v tomto případě se jedná o MUG). Petr Jeřábek Kinetické parametery původní ß-glukosidazy a jejích mutantů pNPGlc Enzyme Km «xat "xat/^m relative efficiency WT 0.68 ±0.03 42.80 ±0.56 63.0 100.0 This work F200K 3.50 ±0.22 2.43 ±0.05 0.7 1.1 This work W373K 2.10±0.21 0.63 ± 0.02 0.3 0.5 This work F461L 0.65 ±0.05 49.27 ± 1.15 75.8 120.3 This work F193A 0.045±0.0035 0.22 ±0.003 4.9 7.8 This work F193V 0 0 0 0 Verdoucq et al. 2003 F193I 1.76±0.06 0.84 0.48 1 Zouhar et al. 2001 F193Y 1.29±0.01 17.3 13.6 21.5 Zouhar et al. 2001 F193W 1.61±0.17 31 19.5 30.9 Zouhar et al. 2001 MUG WT 0.148 ±0.013 53.60 ± 1.09 362.16 100.000 This work F200K 1.510± 0.101 1.87 ±0.05 1.24 0.342 This work W373K 1.736± 0.125 0.22 ±0.01 0.127 0.035 This work F461L 0.164 ±0.019 70.88 ±2.16 432.19 119.337 This work F193A 0.120 ±0.012 1.29 ±0.04 10.75 2.968 This work F193V 0.23±0.1 3.4±0.8 14.8 4.1 Verdoucq et al. 2003 F193I 1.23±0.08 23.2±0.86 18.9 5.2 Rotrekl et al, unpublished result F193Y 1.22±0.24 68.4±4.9 56.1 15.5 Rotrekl et al, unpublished result F193W 1.34±0.015 34±1.78 25.4 7.0 Rotrekl et al, unpublished result zená evoluce - vícenásobné mutanty Studium změn stability a substrátové specifity Pokus o obnovení struktury a funkce některých mutovaných enzymů p^^( J ') %JBĚ W£%ätm (jth Tíi w _^^ri ^^ ^ ^rF^flyfi !_> I ■ ■»■ r-j___ I «VDLUTIQn 1 Pavel Mazura E. coli indukované IPTG lOOuM Pavel Mazura Detekce aktivity enzymu na gelu — Dimer - modifikace? — Monomer-nemodifikovaný? Divoký typ a mutanty byly analyzovány na dvou paralelních gelech 10% nativním PAGE. První gel (A) byl barven pomocí Commassie modře. Radka Fohlerová Je to dimer????? Activity in gel staining 10% NATIVE PAGE Native western blot Dimerova forma 120 kDa Monomerni forma 60 kDa iDIMER I MONOMER 66 kDa > Radka Fohlerová írovnání rostliných beta-glukosidáz maize LLENGIEPYV TIF WDVPQA LEEKYGGFLD KSHKSIVED Dhurrinase LLENGIEPYI TIF WDTPQA LVEAYGGFLD E. .RIIKD Ave n a LIENGIKPYI TLF WDTPQA LADKYNDFLD R. .RIVKD oat LIENGIKPYI TLF WDTPQA LADEYKDFLD R. .RIVKD Secale LIRHGIVPYV TIW WDTPQA LEDKYGGFLD K. .QIVND Prunus LKSNDIEPLV TLF WDVPQA LEEKYGGVLS P. .RIVDD amygdalin ILRNGLKPFV TIY WDLPQA LEDEYGGFLS P. .NIVDH Costus LLKNGIRPMV TLF WDVPQA LEDSYKGFRS S. .EIVND Furost. gly z.26-O-b-gluc Costus LLKNGIRPMV TLF WDVPQA LEDSYKGFRS S. .EIVND Arab. thai. 6-P-beta galact. LLSKGIKPFA TIF WDTPQD LEDAYGGFRG A. .EIVND Arab. thai. put b-glucosid LLSKGIKPFA TIF WDTPQD LEDAYGGFRG A. .EIVND Arab. thai. b-glucosid 1 LLSKGIKPFA TIF WDTPQS LEDAYGGFFG A. .EIVND Arab. thai. b-glucosid 2 LLSKGIKPFA TIF WDTPQS LEDAYGGFLG A. .EIVND Arab. thai. b-glucosid 3 LLSKGIKPFA TMF WDTPQA LEDAYGGFRG A. .EIVND Arab. thai. b-glucosid like prot LISKGVKPFV TLF WDLPDA LENAYGGLLG D. .EFVND Arab. thai. amygdalin like prot LISNGIRPLV TLF WDTPQA LEDEYGGFLN P. .QIVKD Arab. thai. b-glucosid 4 LVANGIEPSM TLY WDHPQS LEDEYGGFLS P. .QIVED Arab. thai. b-glucosid 5 LIANGIQPSV TLY WDHPQA LEDEYGGFLN P. .QIIED Ar thai hyd r.O-glycosyl comp. LIENGIKPFV TIY WDIPQA LDDEYGSFLS P. .RIIDD Arab. thai. 6-P-beta galact LLANEITPLV TIF WDIPQD LEDEYGGFLS E. .QIIDD Arab. thai. amygdalin like prot LLAKGIEPYV TLY WDLPQA LHDRYLGWLN P. .QIIND Předpokládaná úloha of Arg83, His119, Arg170, a His176 při G6Pázovém reakčním mechanismu Arg 1/ü Arg 17G Arg' ;;- A:g( S3 176 Arg 170 HO ■% f OH OH "> Arg ,83 176 Hi; 119 .119 Ghosh, A. et al. J. Biol. Chem. 2002;277:32837-32842 Funkce proteinů IV. 1. Enzymatická/enzymy/ 2. Receptorová/ 3. Přepravní/transportní/ Strukturní/zpevňovací/ Aktivní pohyb/kontrakční/motor-proteiny Hormonální/hormony/regulace Obranná/specializovaná/imunitní systém/transkripční regulace Zásobní Enzymy Protein-interakce s ligandem Protein-interakce s dalším proteinem nebo DNA Zásobní - zdroj energie, uhlíku nebo dusíku. B2D chase Kinase recdvtt garp danain ttntaln dcroafn d«nain i jun ':(H ni n a ut efcejy Extracelulární doména SexA t CQSDÖäfc *EC SNWRTTTENLVKEVASFTEDLRTSLVSEIENIGKFTYAKTNLSTIGLARVIDSYITNNDTGFTEIQTQIAP LLFVAYSTILQVSQVSYISRDGLMFSYIAESNTSVAVFANSSSNSSRGDYTWYTQTVDQLTGRLNGN STKSQSLDVTHTDWFQAAQSNNYTTAFVGTSLGGEDNETLIQSWSLYSKKGLVSLGFPVKTLTEVL NSLNLHGEELYMWTKDGTVLVREGSLNDSFFISNGSICFGRESNSLWSQCIPENCSSSGYEVEIKRL RYQAFCSVIEVSGVPLRYTLMFPNKGGATRIKHQAEKAKY Ligand • Vazba radioaktivně značených cytokininu na NC membránu, na kterou jsou přeneseny elektroforeticky dělené proteiny z E.coli exprimujícíCKM "CHASE" doménu. • trans-zeatin, cis-zeatin, N6benzyladenin, meta-topolin nevážou extracelulární CKI1 doménu. CHASE domain Cyclases/histidine kinases associated sensory extracellular domain to 14 adenine: + uldtľydť 15N-HSQC spectra 9 A (i)j - 'H (ppm; Červeně: samotný protein Zeleně: protein + BeF MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASTD SESETRVKSVRGRKPIGNPEDEQETS KPSDDEFLRGKRVLVVDDNFISRKVA TGKLKKMGVSEVQCDSGKEALRLVTE GLTQREEQGSVDKLPFDYIFMDCQMP EMDGYEATREIRKVEKSGRTPIIAVSG HDPGSEEARETIQAGMDAFLDKSLNQ LANVIREIESKRHLEHHHHHH 0.5 mM CKI1 RD byla inkubována s 15 mM MgCl2, 3 mM NaF, a s 0.6 mM BeCl2 Funkce proteinů 1. Enzymatická/enzymy/ 2. Receptorová/ 3. Přepravní/transportní/ • Strukturní/zpevňovací/ 1. Aktivní pohyb/kontrakční/motor-proteiny 2. Hormonální/hormony/regulace 3. Obranná/specializovaná/imunitní systém/transkripční regulace 4. Zásobní I. Enzymy II. Protein-interakce s ligandem III. Protein-interakce s dalším proteinem nebo DNA IV. Zásobní - zdroj energie, uhlíku nebo dusíku. B2D Hemoglobin a jeho funkce v transportu kyslíku • C02 + H20 -► H2C03 -► HCO3- + H+ Proteiny AHP z Arabidopsis thaliana HELIX 1 AHPZM AHPR AHP2 AHP3 AHP5 AHP4 1AHP AHP6 AHPZM AHPR AHP2 AHP3 AHP5 AHP4 1AHP AHP6 ~ZTT L1 HELIX 2 L2 -t HELIX 3 L3 MAAA---AL ■AAA---AL mIal-iaqlq m|tl-iaqlq mntivvaqlq QLNALLSSMFASGLVI QLTALLSSMFSQGLvI qf|dytislyqqgfl[ fcdftisly|qgfl| |qfq|yivslyqqgfl| MTNI--------------GjÍMQGYLl m|lv---q|qís l q|yt|s l flíg i l| m 1 1 A s G 6D QF i HELIX 4 •k ^Ě *~^ 1 •\ (\(\ HELIX 5 F qfqqlqmlq qfqqlqmlq |qfmelee|lq| iSQFLQLQQLQľ |q|lqlqqlq 2L LQd Mt S IggtpgfvaI IggtpgfvsÍ |g-sp|fvs| ■ s pIfvai g-tp|fva| ■NPNFVl ArTLFC ArTLFC rLSLFFBD|CV| rVSLFFBDCS ^salyfídsa ■aHiisIi :IaHiin|] I ~T0 " 5T7 iisblaall iin|iatll lisnmaIal lis nma§al|qt gnv lintmsisle|pdnv linni|qalH-gsf S-NP|FVSQVVTLFFQjsBlLN|LSLSLDQ-QVVgF ~|fs|y vl5 ™y n q-piv|f| q-pvvnf| ttgtvIfsqvg |lvg |t-spnfvy|viniyfdese|ll|nl|lllm| PFV V 65fd 466 GSSASVGAQ GSSASVGAQ GSSSSVGAl gs sssvga gssssvga) gsstsigas gssssigaq nqlvgssssiga| felkGSS S6GA QL QL QL QL ql| qf| ql| ft|mq| FTCMQF TLBVSF glIvtl NVCISF AECTTF naIvvf nv§va| 4V4 C f4 qlcqd|n|dg qfcqd|s|dg eccea|nyeg ECCDSQNYEGCVl eccdvqn|egcl eyc§agnaegcl sfcIqqnvT sasJlsnJpgil c n gC TTÖ I MALAWI LMALAW Jlqqv ■LQQV Ilqqv| ITFQQL Jlqqvi gl|w| HELIX 6 --------9F------- FQTMLQL FQTMLQL LQÍMFNL lqIlfnl lq|lfnl L 160 QQ-IQA----QQ------ qq-iqay|p|qq----- Q-IIQAGGIVPQV|lN- QQ-IVQAGG|lPQvIl-- Q-ILQAGGTIPQv|lN- YFQASQ------------------- lf|l|qq-iva|ggmipav|lg| jim | ,e|yfqasc ,pLF|L|C í|elfql|c AHP1 17.6 kDa AHP2 17.4 kDa AHP3 17.5 kDa NMM^L FQl|qq|I LAAGV|Y PM f leqq AHP4 14.7 kDa AHP5 17.9 kDa AHP6 17.8 kDa 76 76 7: 7: 79 64 75 79 145 149 156 155 157 127 154 154 Podobnost AHP proteinů se pohybuje mezi 60-80% Výsledky exprese AHP proteinů v E. coli Procenta proteinu AHP v rozpustné formě t(°C) růst/indukce AHP1 AHP2 AHP3 AHP4 AHP5 AHP6 37°C/28°C 8% 85% 100% 0 76% 0 37°C/22°C 82% 73% 100% 0 81 % 51 % 22°C/22°C 71 % 78% 100% 30% 81 % 73% 1. Afinitní chromatografie 50 mM Tris pH7,9 0,5M Naci 500 m M imidazol 20 mM imidazol mM Tris pH7,9 0,5M Naci 500 mM imidazol 20 mM imidazol kace AHP5 proteinu Čistota: 4,5% Čistota: 15% Výsledky purifikace AHP5 proteinu 1 . Afinitní chromatografie- His trap kolona ;0 mM Tris pH7,9 300mMNaCI, 10%glycerol, 3,5 mM mercapthoethanol 500 mM imidazol 20 CV 20 mM imidazol Čistota: 78 % IV. Funkce proteinů Enzymatická/enzymy/ Receptorová/ Přepravní/transportní/ Strukturní/zpevňovací/ _ omponenty/ Aktivní pohyb/kontrakční/motor-proteiny Hormonální/hormony/regulace Obranná/specializovaná/imunitní systém/transkripční regulace Zásobní Enzymy Protein-interakce s ligandem Protein-interakce s dalším proteinem nebo DNA Zásobní - zdroj energie, uhlíku nebo dusíku. B2D G-actin minus end plus end F-actin actin molecule minus end I 37 nm l___ 50 n m plus end Polar coiled-coil dimer (0.05 \vm length) Intermediate tilament (10 nm diameter) Intermediární fílamenta: Vimentin N-term. C Rod domain >0í^>nDíiw C-term 3 Plectin Intermediate ííiaments Microtubules Actin filaments Myosin filaments Plectín GN rod i/i o G5 o O o o ö ^- " GR323 Exonlc-21 GR 329 Exon 16-24 GR 330 Exon 16-24QEA GR 331 Exon 20-21 GSTGR326 Exon 8-18 GSTGR331 Exon 20-21 •«Ex.y n ■^-ľX-lli" ° Měření turbidity Plectin16-24 MAP2C Plectin16-24 + MAP2c ..vA-^/^A/ ■MTPS+ 16-24 (0.15 mg/ml) MTPS+ 16-24 (0.6 mg/ml) 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Kosedimentace MAPs s mikrotubuly za přítomnosti plektinu ■ r 2.5 uM MAP2C + Tub + SH3 6+7.3.2006 -MAP2C in sup -Tub in pel 0 0.5 1 2.5 0.5 uM MAP2C + Tub +SH3 7+9.5.2006 100 90 80 70 60 50 40 -30 -20 -10 -0 -MAP2C sup -Tubulin pel 10 20 50 ■O. " > MAP2C -/- ■ Microtubule Tubulin sutmnit \ Crosslinking protein Cytoplasmic dynein Katanin Cenlrosome TFEW^ ti Cr" lj';ilc(v MAP - mikrotubul asociovaný protein redukuje frekvenci se kterou mohou molekulární motory interagovat s mikrotubulární mřížkou a frekvenci se kterou katanin může tvořit hexamery, které rozkládají mikrotubuly. Nature Reviews I Molecutar Cell Biology Analýza IF domény Plektinu - bioinformatika Plectin N-terminal domain rod C-terminal domain 315 ABD MTSD 848-905 Ml domain 1392 Tau1 Tau2 Tau3 MAP2^1 MAP2Ö MAP2/3 Pledc Kd of Ptectin (Ex 1-24) for actin Kd of Plectin (R5) for vimentin (IF) Kd of Plectin (Ex 2-8) for integrin beta 4 2518 4589 2739 3067 IFBD o {s RDs Linker Module 6 25 5 PlecMouse 'AAAQSSKGYYSPYSVSGSGSTAGSRTGSRTGSRAGSRRGSFDATGSGFSMTFSSSSYSSSGYGRRYASGPSASLGGPESAVA1 PlecHamSt AAAQS5KGYYSPY5V5GSGSTTG5RTGSRTGSRAG5RRGSFDATG5GFSMTF5SSSY5S5GYGRRYA5GPPASLGGPESAVA PlecHuman AAAQSTKGYYSPYSVSGSGSTTGSRTGSRTGSRAGSRRGSFDATGSGFSMTFSSSSYSSSGYGRRYASSPPASIGGPESAVA 320 nM 100 nM 170nM (Ex 2-8) 25uM Kd for microtubules in case of MAP2 1 -3 uM t I A« L L D P VWH R Y KB P Y T « E in Ifflwi UM 1 2 J6 17(0 M111215HW1(l1ľ1(ín£Uria20*Ha2r»2fl»Jia»54»» LLLKPTHEKLIVYTALOR4LLIPITALILLEAQAAIQF fLPflfl L L D P V|fi T H D F Y T ■ I V D P B L fl y y p p p t d P V [»A T K D P K D P Y t T V N E A V|E| V I 1 L F ÖA■■KIL Vfl P I V R D H ELHNKLL1AE I R L L E A O í?í: L T T L q L V P P V T ■ A ■ ■ A A q A »■■"' IJTK_DA h s h - p A R m L VIKIL um h 1 p I I T D P Q T R LlClL 1 P L________ VDR IŤIQTl L BA Q Aß] T Q I V D K I ■ V D R I E L A R K A r®« LTTIAlQllPLlVqTLTQf K Y I 1 Ti LIL L P * P i - - t 12 *n* * * JUfc-1 4 ■ A D A A T B < JUfc* 41 H R H B L R B MfcJ » TIIINTAi **4 i» 4 Ů K • F T P MM W TEDIFTP ArM 1» V R L P A . 6 1 tt • r LH. • L H L . • L H 1 i LYV •LAV ■ L H 1 . • A AHftflN L . • a b|b m H V > A A L Alfll -U4EHHL < AL 4Ů4 HB • A A ■ H B D T < 1l192CÍlC23í425aŕQ • - 0 KA L D|L R N B • -1IVVILLHKI . ' lEWIiLYNT 1 < -EVVKFLLEN* - H V VA H L 1 M Y 6 •-RTAAVLLOND. ftaioaiBíai • V 0 1 N T[5] • 1 1 L B T 7 ■ A N V H A ft • A H Ů H V A • T K 0 K •PMHVL «7 z» tKTÍFTP MM z» PŮ N B I T P MM w TKDELTP M*-li n TKNILIP **-11 no T L D H L T P ■ Mfc-11 m A L N R F T P ■ •LHI LH 1 • t M[B' • IHM-•LHV L M 1 • A A|Y|n L ■ • Ai|rin y. • A aIníhv . • A A a OD H L < • AAllt« Hi ■ • AlSl'K IHT • - H ¥AOL L L N R R --IIVRLLLDRO • -RIIEILLDHO • - DGĚJV ■ L L L O Y D . • - IVAK V L L D H R •-RVMELLLKTR' AIYNFT •AaiETK A P 1 Ů A K A e 1 D D 1 - A K P H B R - A B 1 D A V SCTJ «í T E B 0 L T P -M*-U 4» N V K V E T P Mtl5 4*T A K D D a T P ŕrt-11 p» T T A 0 H T P M*-1T TO TKIÍFTP. A**-1l I» O K N 0 L T P . LHV' L H H • L H[E' LH 1 »LHV .LHV A fl T B* H L - A A R A« H T < • A All 4 H T • A A|e4H ¥ ■ • A A|Y| K ¥ . • A V H H H N L , «PIV KTTETTiTT»" • - C VAK YLUNK •-H1VKLLLENM - C T V L A L L C K E • -IVAEULERD . .-D ! VILLLPRQ nmnrvT A KV N A K A N P N L A - A B Q ABO» > A M P M A A • 0 ■ P M B P MM9 *tf IVQIVTP JUtíl p» NK1ILTF MS m TIIIYTP JWfcJJ m T K L B Y B P Affcdt m B B D R ľ T P LH 1 • L H L . • L H L . »LHV LH« • LAI > * A A Q B ■ H A . - v a a r • h v - a b h f m N 1 , * a a a r m h t * Al IlIt i . - -IIVALLLIKQ . i-PVADVLIKHB ZMOHLI * V II V 0 A T • -DI VTLLUNI - . B V T D V LHV V T . • A B r H B V .■b t b p v B5EIR . . i . * t . - 1 1 h . ■ h • t 1 p • . * ~ p h h p h 1 1 p • 1 . • - p B t - - C-koncová doména Plektinu c i II ci -, t st I • šest modulů C-koncové domény Plektinu, které jsou spojeny méně konzervativním spojovací sekvencí • modul samotný je tvořen 38 aminokyselinami (2x19) opakovaně pět krát. Plectin Intermediate ííiaments Microtubules Actin filaments Myosin filaments Elcctronova mikroskopie: Vimentin+R5/ 1000:1 Elcctronova mikroskopie : Vimentin+R5/ 100:1 Elcctronova mikroskopie : Vimcntin+R5/ 1:1 # ■^■HmnKMHRI Značení Europiem: R5wt -©- -DTT 0,05 KD= 312,20743 nM Bound [nl\ 10 12 Bound [nl\ CD Spektroskopie: R5wt a R5mutant v různém pH sekundární struktura 12000 mutpH7.5 mutpH9 mutpH11 o E T3 rsi E o O) 30 - 90 krát silnější než iontová síla nebo vazba vodíkových můstků). (2) Cysteiny jsou v uvnitř buňky v redukovaném stavu. Přesto není neobvyklé najít disulfidové můstky odolné k redukujícím činidlům jako je DTT nebo cysteiny citlivé na nitrosylaci. Pokud je přítomen takový radikál, jako je peroxynitrit, thiolové skupiny jsou přednostně oxidovány (103 až 106 krát více než nukleové kyseliny a další aminokyseliny). Také reakce peroxynitritu je velice rychlá (rychlostní konstanta je 10'3 M'1, což je 1 000 krát rychleji než při reakci s H202). (3) Peroxynitrite je vytvářen z NO, což je produkt nitrid oxid syntázy, která katalyzuje reakci argininu na citrulin a oxid dusnatý (NO). Tento produk se může dále oxidovat za vzniku peroxynitritu - velice silného radikálu. ). Neurální NOS je součástí utrophin/dystrophin-vázaného glycoprotein complex, který je součástí sarkolemy u svalových buněk. Peroxynitrit is 70 krát více solubilní v nepolárním prostředí a 90% jeho reakce s Q2 se odehrává na membráně. Proto tedy vysoce reaktivní oxidační činidlo jako je peroxynitrit, který se vytváří v aktivně pracuj ícíh svalech může v místní oblasti velice efektivně vést k uvnitř i vně molekuly tvořených disulfidových můstků přes oxidaci cysteinů v plektinu i v příbuzných spojníků kostry buňky. Funkce proteinů i 2 3 4 IV. Enzymatická/enzymy/ Receptorová/ Přepravní/transportní/ Strukturní/zpevňovací/ enty/ 5. Aktivní pohyb/kontrakční/ tor-proteiny 6. Hormonální/hormony/regulace 7. Obranná/specializovaná/imunitní systém/transkripční regulace 8. Zásobní Enzymy Protein-interakce s ligandem Protein-interakce s dalším proteinem nebo DNA Zásobní - zdroj energie, uhlíku nebo dusíku. B2D Kinesin se pohybuje striktně podél mikrotubulu směrem k periferii buňky (anterográdní směr). Dynein má tendenci se otáčet kolem mikrotubulu po povrchu směrem od periferie buňky (retrográdní směr). V í_______________/ I O Ô •-i o D + i? Cy*op*nnte n AKON o Ü \1 1(a) Kinesin (KIF5) KIF1A KIF2 ■.■■&v*tw, ^•«W^Ä;« V*W1*<-',' ..-*>' 5^íte íft»;-iíä. -vs-*^^ ^*ľr& &*?£&;*? ;#í&!.c-ía /TO>*; ^íí'i'ííŕS ■'$;' ^ t*~fc:í í:W^-f P£4$ V^^IÍ ° ^■r^í--: &fe& to^ai c&té&áž DENDRITE Aktivní pohyb/kontrakční/mol proteiny RF1A "- j Mil« rrfWtdrki CŮN Cůlgl Tf.H i : v LYSWomc dpwln Mptuďfl ftflinflmfs | tJwroKltnc« Funkce proteinů i 2 3 4 5 IV. Enzymatická/enzymy/ Receptorová/ Přepravní/transportní/ Strukturní/zpevňovací/ i Aktivní pohyb/kontrakční/motor-proteiny 6. Hormonální/hormony/requlace 7. Obranná/specializovaná/imunitní systém/transkripční regulace 8. Zásobní Enzymy Protein-interakce s ligandem Protein-interakce s dalším proteinem nebo DNA Zásobní -zdroj energie, uhlíku nebo dusíku. B2D - o glucose C^O insulin transporter-4 -9 insulin receptor ^ 4 / CV "-----w—f glycogen ^-^^^ f£> O O / O ^ / ^ V O pyruvate ejntrjcd>Řá3f ö subunit----- [hormone-binding domains] j6 subunit------- (AT P-bin ding and tyrosine kinase domami:] Ľľŕrt.pŕ?Ä7Atľ acids Funkce proteinů i 2 3 4 5 6 IV. Enzymatická/enzymy/ Receptorová/ Přepravní/transportní/ Strukturní/zpevňovací/ i Aktivní pohyb/kontrakční/motor-proteiny Hormonální/hormony/regulace 7. Obranná/specializovaná/imunitní systém/transkripční regulace 8. Zásobní Enzymy Protein-interakce s ligandem Protein-interakce s dalším proteinem nebo DNA Zásobní -zdroj energie, uhlíku nebo dusíku. Glykosylace protilátek Man V a1.3Fuc y uI.íFlľ Funkce proteinů i 2 3 4 IV. Enzymatická/enzymy/ Receptorová/ Přepravní/transportní/ Strukturní/zpevňovací/ enty/ 5. Aktivní pohyb/kontrakční/ tor-proteiny 6. Hormonální/hormony/regulace 7. Obranná/specializovaná/imunitní systém/transkripční regulace 8. Zásobní Enzymy Protein-interakce s ligandem Protein-interakce s dalším proteinem nebo DNA Zásobní - zdroj energie, uhlíku nebo dusíku. B2D Kasein - funkce zásobní? •Vápník sám o sobě vytváří nerozpustný precipitát neschopný dalšího zpracování. •Vysoký obsah vápníku je svým způsobem nebezpečný. Metody Dostatek znalostí o proteinu Dostatek materiálu Zviditelnění proteinu Kvalita proteinu Hledání interakčního partnera Kvantifikace interakce Detailní popis interakce studia funkce proteinů Metoda Bioinformatika Exprese a purifikace proteinů SDS-PAGE/Western blot/ fluorescenční a elektronová mikroskopie/detekce aktivity enzymu na gelu/MALDI/2D-PAGE CD spektroskopie/měření turbidity Substrátová specificita/Dvojhybridní kvasinkový systém/vrstevní značení Měření kinetických parametrů pomocí spřažených enzymových reakcí/radioaktivně značených látek/ kosedimentace/ Krystalizace/NMR analýza/cílená mutageneze/ řízená evoluce/modifikace proteinů (fosforylace, nitrosylace, glykosylace)/molekulární modelování proteinů.