ENZYMY METABOLISMU CIZORODÝCH LÁTEK A CHEMICKÝCH REGULÁTORŮ SIGNÁLNÍ TRANSDUKCE: Enzymy 1. fáze biotransformace xenobiotik, steroidních hormonů a mastných kyselin -oxygenázy (CYP, AKR, FMO, COX, LOX), reduktázy (AKR, NQO), hydrolázy (esterázy, epoxidhydrolázy). 2. fáze biotransformace (GST, UDPGT, SULF aj.). 3. fáze biotransformace (ABC transportéry) Enzymy signální transdukce: Proteinkinazy („moduly" mitogen-aktivovaných proteinkinaz ERK, p38, JNK), fosfatázy; další enzymy biotransformace lipidů (fosfolipázy, další enzymy biosyntézy/transformace lipidních signálních molekul - dihydroceramid-desaturáza, sfingomyelináza aj.). MRP1,3 (bilateral) MRP2 (apical) 1. FÁZE BIOTRANSFORMACE: monooxygenázové reakce CYP enzymy R-H NADPH R-OH NADP suDstrat) (produkt) - Přenos elektronů z NADPH na CYP enzym - Aktivace molekuly kyslíku, „roztržení" vazby - Oxidace substrátu (hydroxylace, N-demethylace, epoxidace....) R-H R-OH N-H +HCHO MONOOXYGENACE A AKTIVACE KYSLÍKU ©, Přenos elektronů: NADPH ■ T NADPH:P450 oxido-reduktáza cytochrom P450 (substrát RH, produkt ROH, produkce ROS) Aktivace kyslíku: ROS = vedlejší produkty >ROi Fe3+ ROH K p»® Fe" , RH ® FeOH3* R* Fe RH NADPHP450 reductase \Y^-» NADPH-P45Q reductase" Fe2* RH NADPH*P450 reductase'9** NADPH-P45Ü reductase0* SPECIFICKÉ SUBSTRÁTY CYP ENZYMŮ ™ŮH rHOH Testosterone ^\ř"ji ^ P rr <~S^~~-S _W50arBm^_ ^ YT O 0^^Ky H0^ J^J Estradiol CK5I JL/ 6 B -0 H-Teslostenone 0*^*^^^ OH O II Steroids (testosterone. R * -OH androstenetfione, R - «O progesterone, R - -COCH3 (4-PregnBne-3.20-dione)) (2C1 2a-H 0 (3A) H-6ß (2A1) OH H-7ct (2A1) ,17-0X0 (2C11.2B1) H-16ß(2B1) 16a (2C11.2B1) SPECIFICKÉ SUBSTRÁTY CYP1 ENZYMŮ "VCO° Alkylresorufins (alkoxyphenoxazones) CH3 Caffeine (1 t3lP7-trimethyíxanth.ine) EROD/MROD BaP-hydroxyláza Kofeindemethylázy EPOXIDHYDROLAZ V METABOLICKÉ AKTIVACI POLYCYKLICKÝCH AROMATICKÝCH UHLOVODÍKŮ P450 P450 OH i+í-wUP-7.*-dtol HO OH (+)- and (-1- R(i]F-7.ft-tiol- 9 10-woidde P45Q Oh l-l-KtíM.I-dW vi aíil-WI M ^ LIKl SM VrM M J tftlYil ť k M BIFENYLŮ (PCB) - příklad 1. fáze metabolismu persistentních organických sloučenin *Q -o \-—/ bphfi, CV^ ^A \L/ in/^C« l"C :□ i_____MAO* ^-----»-NADH + H* ^ >3 X=/ HO OH bphC v^Šfe %a' -/~\ U/" HO bpfcD ^-~KiO 4 '' COOH i COOH Mikrobiální degradace Metabolismus u vyšších VB VB I O živočichu: oxidatívni metab. (hl. cesta C, D; alternat. A, D); NIH posun chlóru Persistetní arom. sloučeniny: Cl v sousedních pozicích X* xfc' X.1 . X '" xn (4) K*, ■ ■I MJkľril 'Lm ilálUl*A%á W/ilľláJIi li'ilMf'i-l^J^ |iMvJ«lHr:i ESTRADIOLU (lidské CYP enzymy byly exprimovány v hmyzích buňkách infikovaných baculovirovým expresním systémem) KXJjAß (hydroxylače E2 lidskými jaterními mikrosomy) (Conney et al., 2001, 2003) E, ÍAI.IAJ.IIU ITW.JJľl.aľl.X^HLltÄ, JAI,3*M,iľ ---------s~ I. lAMňl IMÍAI.Hai l\:. :!1:. 3^. w IAI.1A2, 3.^.1*5.3*1 **ľ^ L 1.41. im. *A4 LAI. 1ÄA Ul. I.Jii.llEl, Foreign Chemical ^ Inducers Hormones. Cytokines Growth Factors RECEPTORS and TRANSCRIPTION FACTORS Induction I CYP GENE EXPRESSION i' ' -— *—"------------------ — _________ i (P450 ENZYMES) k' VJ Foreign Chemical Metabolism Metabolism of Endogenous Steroids, Fatty Acids. Prostaglandins XENOBIOTIKA, STEROIDY AJ. LÁTKY INDUKUJÍ VLASTNÍ METABOLISMUS AKTIVACÍ RECEPTORU (TRANSKRIPČNÍCH FAKTORŮ), KTERÉ KONTROLUJÍ EXPRESI BIOTRANSFORMAČNÍCH ENZYMŮ A ABC TRANSPORTÉRŮ - vazba xenobiotika na receptor (aktivace receptoru) - dimerizace receptoru - vazba receptoru na specifické - responsní elementy v promotérových oblastech cílových genů AhR/ARR1 AhR-RF r ľllJSO l Dl-LLg niŕUboJi/.iiif, l'.fit) m« Drugs Chemicals Xenobiotics . Receptor-mediated ľhRFM PXR-R] f*li3se II Drug metabolizing Fnzywes ľPAR/RXR H'AR-RF Other Strew Fjutvnws NUKLEÁRNI A CYTOSOLOVE RECEPTORY nukleární receptory cytosolový receptor a) pecoxisone proliferaíors b} phertobarbttal PP / RA PPABa PB BA RXR wv^ CAR c) dioxin ARNT ligand receptoru dimerizační partner JiiiLiJ^i:^j|fi¥HÉi#Ki#jMriaN3#iaai#jrv KONTROLUJÍCÍ EXPRESI CYP ENZYMŮ CYP Induction Mediated by Nuclear Receptors P-450 inducing agents Prototyplc responsive rat Liver CYPs Receptor PolycycJUc aromatic hydrocarbons Phenobarbital 1A1. 1A2. iBi 2B1, 2B2 Ah receptor" CAR Dexamcihasone 3AL 3A2« 3A23 PXR Fi brau» drugs Cholesterol 4At. 4A2, 4A3 7A1 PPARíí LXRn Bile acids" 7A1 FXR Thyroid hormone P450 reductase TR " PAS transcription family member, not a nuclear receptor. '" Inhibitors of CYP7AI transcription. Nuclear Receptors: Endogenous Ligands and DNA Response Elemencs in Target CYP Genes Nuclear Representative endogenous ACCTCA-based DNA receptor lißands' response element* CAK Androslanol, androstenol DR4 PXR Pregnenolone, corticosterone DR3. ER6 PPARfl Linoleic acid, arachidonic acid DR1 LXR« 24{5) -hydroxycholestrrol DR4 FXR Chenodeoxycholic acid IRi TR Thyroid hormone DR4 SEZNAM CYTOCHROMŮ P450 (CYP) ZODPOVĚDNÝCH ZA BIOSYNTÉZU / METABOLISMUS STEROIDŮ A METABOLISMUS XENOBIOTIK □ CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1: genová exprese regulována AhR (indukce dioxiny, PAH; endogenní ligandy?) monooxygenace PAH, estradiolu; □ CYP2B: exprese regulována GR/CAR, indukce steroidy, fenobarbitalem, monooxygenace velké řady xenobiotik, testosteronu aj. □ CYP2A, CYP2C, CYP2D □ CYP2E: indukce především stabilizací proteinu (indukují etanol, pyrazol aj.), monooxygenace etanolu, (co-l)-hydroxylace mastných kyselin □ CYP3A: exprese regulována GR/PXR; indukce dexametazonem aj. steroidy, monooxygenace velké řady xenobiotik (nejdůležitější enzym biotranformace), 6(3-hydroxylace testosteronu □ CYP4A: exprese regulována PPARa, indukce peroxisomálními proliferatory (Clofibrate, dialkylestery kyseliny ftalové), co-hydroxylace mastných kyselin □ CYP7A, CYP11A, CYP17, CYP19 (aromatáza): enzymy steroidogeneze I další důležité CYP metabolismu vitamínu D3 a kyseliny retinové REGULACE EXPRESE BIOTRANSFORMACNICH ENZYMU CYTOSOLOVYAh (aryl hydrocarbon) RECEPTOR CYTOSOLOVE RECEPTORY: AhR (AryI hydrocarbon receptor) biotransformačních enzymů regulátorů bun. cyklu / apoptózy CYP1A1/1A2/1B1, UGT, GST, NQ01 p27, Bax,... přímé interakce (ER?,..) AKTIVACE Ah RECEPTORU A INDUKCE CYP1A1 SUBSTRÁTEM substrát S je ligandem AhR ahr] —M----.—l ARNT AHR ARNT r AHR monooxygenázová reakce CYP1A1 AhR/ARNT nasedá na XRE = DRE = xenobiotic (dioxin) response element LIGANDY AhR Strukturní podobnost (šířka, výška, molekulární objem, planarita molekuly) 2, 3J P8-tetra-ch ío rodib enzodioxin (TCDD) Z ,3,7 h8*tetra-chlo ro dibe nzof uran (TCDF) TCDD = nejsilnější agonista AhR = modelový dioxinový toxikant Nekoplanární látky ■ (např. PCB se dvěma chlóry v pozici ortho) nevykazují planární pozici aromatických jader a nejsou agonisty AhR 3 ,4 ,5,3" A ,"-pentac Morbtfenyi (PCB) CI Cf CI CI 2,2' ř4 ,4', 6.6" - Hexachlor obiphe ny I (Not coplanar) ENDOGENNÍ AGONISTE AhR dosud nejsou známy (deriváty tryptofanu ?) 20000, 15000 t •5 10000? 1 5000 ■ 1 í ^lf¥JWbin{R1) ♦ TCDD / *.l«Jgo(B1) Funkce AhR: nezbytný v řadě proliferačních a vývojových procesů (viz myší AhR-deficientní modely) 0,00t 0.01 0.1 1 10 100 1000 10000 ConconíraSon (nM) AKTIVACE Ah RECEPTORU / AhR-DEPENDENTNÍ GENOVÁ EXPRESE oro Ugánd (TCDO e*c) Produkty genové exprese: -detox./bioaktiv. enzymy - apoptóza; - bun. cyklus; _ 9 ■ + Přímé interakce AhR s transkripč. faktory aj. proteiny Degradace AhR po navázání ligandu AHRR = AhR represor ARYL HYDROCARBON RECEPTOR Negativní regulace AhR: - Ah R represor, - degradace XME = xenobiotic metabolizing enzymes (CYP, UGT,ALDH...) „Toxic genes" = indukce genů, která vede k „dioxinové" toxicitě A^ Ligand Estrogen (üüner Sľ-1 ardC^EB Ľ i ■ 10 i r a Ľcurs LpsíreaTJ (transgenní model - luciferazový reportérovy gen) TCDD and Related Compounds HSP9Í HSP9Í ChSP9jD ChŠp9$) Nuclear Factors AhR ARNT ARNT DRE-Luc ® "Activated" \ / Increased Protein\ Modulation of Gene Phosphorylation Expression Membrane Proteins Cytosolic , Proteins, Luciferase Adapted from Blankenship (1994) REGULACE EXPRESE BIOTRANSFORMACNICH ENZYMU NUKLEÁRNI RECEPTORY NUKLEÁRNÍ RECEPTORY (NR) Gene Repression No ligand Antagonist Gene Activation Model for gene activation and gene repression by NRs NUKLEÁRNI RECEPTORY: struktura domén receptoru hKKu IjgRB A/B I) ■L4 transcription a motivation tiiiclcur translocation dimcri/ation DNA binding hsp9U bindinj^ Coactivator binding Coreprcssor binding 58 595 530 iJi-COOH vazba Ugandu *a^_u^B. 2025 NUKLEÁRNI RECEPTORY .Vbťiŕjw HůfiKotir Rťctpiorí ist a&tff^Trf* W. 4fjl A A, '-■, ^ ~j& ľv |*hu Fatty acids Ekosanoids Thíaiolidinediorws J CYP4B1 T ALBP/aP2 T H-FA&P (?) Liver X receptors LXRn.H Oxysterols T CYP7A1 OSBPi? ÍABCA1, T ABCG1. ABCG4 f ABCG5. ABCCB Farneiokl X i^ceptOf FXft Bile acids ÍCYP7A1 ICYPB61 t IBABP '■ Aßcen Xenobiotk receptors SXR/PXR CAR XenobiOtics Steroids Xenobfotícs PtienobarbitaL t CYP3A ÍCYP2C fCYPZB t CYP2C (?) í?) T ABCB1, ABCC2 fAflCC? Ecft 20(OH) ecdysone Ecdyüone receptor 1 2&-tOH)ase Hexameríns TE23 Retinoie acid RAftů^-y Retínok acids receptors Vitarrňn D VOR receptor 1,Z5(0H)2-vitamín Ds fCYP26Al * CYP24 i CYP27B1 T CRABP1I (?) T CRBPI (?) (?) CYP2B ľ) Ret in o íc Acids í Diet Xenarjiotics Steroids • Acetyl CoA Ja Isoprenoids * PPAR Fatty Acids t I Diet LanosteroJ 7-Dehydro-Cholesterol iCYP27B1 I 1.26-Dihydrojty-Vitamin O3 4 Cholesterol rftsate 2Ei5v?S3ľ" ♦ *CYP7A1 Qxy sterols V f ABCAI.GI.G^Gfl Bile Acids sm tCVP4A fABCB4;D2104 ■ CYP7A1 CYP8B1 fABCBll Ligand-independentní modulace transkripčního faktoru (MAPK, PKA,..) lilie Xenobíoiic Hyíirophilic Xcnobiotic Cellular Events Cell cycle reguhmon Enzyme induct ion Target Genets) R |g AF2 Ml- _____. ♦ + ♦ + Agonist |H)/^ \^hAntagonist (AH) I H ..... R§ R *♦* n 4 A/B J C >p T£* _C_ _A/B_f mi *nj AJB ♦ **W t*** X- A/b REGULACE GR / PXR / CAR aktivace nízkou vs. vysokou koncentrací ligandu Dex {"low" do«) i GR Dex («high" dose), PCN, RU486 i PXR/iUÍR (-2M™:—*6a k« r / HNF-4 USF-1 . GGCACAn3TGTTAT (GRE) TTAACTnóAGGTCA TGAACTn3TGAACT GTACCAAAGTCCACGTG (Imperfect ERó) (DR-3) REGULACE GR / PXR / CAR (více úrovní regulace) JM. Pascussi et at. / Biochimica et Biophysica Acta í 619 (2003) 243-253 NUCLEUS ------- GRE ---- XcnobiotiC! CYP2C9 |~^ Jt CAR, PXR, ^_RXR J CYP3A4 CYP2B6 CAR/RXR PXR/RXR GR/GR PXR/RXR OOGTCAKhAGTACA _ M4 WH 1--------L^ V TGAACTsaaTCTTTT CYF2B6 DR* - DÄ* TGAAATíalflcOGTrCA I? - DR* - Lkf> GGTTCA«i*AGTC CAAACTctlcTtíACí.T TGAACTtfcTGACCC ¥Kt> CTP3A4 TG A ACTcu**í * AGGTC A » ---------> CAR/RXR PXR/RXR VDR/RXR Enhanceosome Complex Historie Deacetviase C o repressors PB ŕ NF 1 »matin Remodeling CARRxRa Ooartivators PBREM Hist o no Acetyl Transferase / Accessory Complexes HAT Transcriptional Activation • Ceil Growth • Cell Communication • Tumor Promotion • Induction of Genes a1-Acid Glycoprotein • Glucose Metabolism (NADPHT, UDP-GAt) • Intracellular Redox Potential • Hepatic ER Proliferation • Heme Synthesis and Metabohsm PPARoc (Peroxisomal Proliferator-Activated Receptor alpha) kontroluje expresi CYP4A1 a enzymů metabolismu lipidů PeťOxi&om« - proliferates CH] a -^ZaO -c -cooc7h5 environ. látky (ftaláty) 7 ^_____ff x Farmaka (hypolimidemika) Environmentálni kontaminanty CH3 I CH, I C-0-CH2-CH-CH2-CH2-CH-CH3 C-0-CH2-CH-CH2-CH2-CH-CH3 CH2 I CH, Di(2-ethylhexyl)ftalát (DEHP) CJ i H N O HA Wy 14.643 , J V Clofibrate Arachidonic Acid Prostaglandin J2 cis9 transe 1 conjugated Iinoieic acid (Endogenní) lipidy Nerovnoměrná indukce CYP4A (vedl. produkt: H202) a dalších enzymů (např. CAT) dependentních na PPARalfa Ligiind Regulation ■I ipici homeostasis "Cľancer (Rodents only?) •A therosclcroäis 'Unidentified functions REGULACE DALŠÍCH ENZYMU 1.FAZE BIOTRASFORMACE KLASICKY POHLED NA INDUKCI GENOVÉ EXPRESE KONTROLOVANOU XRE A ARE ^il'Liru'lional induct1 ľ Monofímct h mu L iniliio: r ARE = antioxidant response element Bifunkční induktory = xenobiotika induk. AhR a Nrf2 3 Cil I ■•lYil OXIDATIVNIM STRESEM / ELEKTROFILNIMI METABOLITY A TAKÉ AKTIVACÍ AhR fe1 \!-| ftü.Qiiilr*gai or + " i." ^ + MlUI/[ nvíM CVTIDk llÜLlllLÜJlC iii.LdliillĽ? T**táťJdui>iíbJ X NúbH.iiLi :■ Ľ.iii. Miao et al., JBC, 2005 INDUKCE BIOTRANSFORMACNICH ENZYMŮ A REGULÁTORŮ ADAPTAČNÍCH ODPOVĚDÍ MŮŽE BÝT MODULOVÁNA INTRACELULÁRNÍ SIGNÁLNÍ TRANSDUKCÍ (příklad MAPkinaz a indukce enzymů 2. fáze biotransformace, některých enzymů 1. fáze (AKR, NQO) a antioxidačních enzymů; ARE/EpRE = antidační/elektrofilní response element, specifická sekvence DNA v promotérech genů) Drugs, Chemicals, Xecobtoiics Non-recepto r-medtated NrK/Maf ALDOKETOREDUKTAZY -většinou monomencke NAD(P)(H)-dependentni oxidoreduktazy - konvertují karbonyl . ■ alkohol - dosud 115 enzymů ve 14 „genových rodinách" - substrátová specifita: cukerné aldehydy; steroidní hormony; prostaglandiny a lipidové aldehydy; chemické karcinogény (NNK, PAH-rrans-dihydrodioly, aflatoxindialdehyd) Příklady lidských AKR: AKR1A1 (aldehydreduktáza) AKR1B1 (aldosareduktáza) AKR1C1-1C4 (20a-, 3a-, 3a/17a-, 3a-HSD) AKR1D1 (5ß-reduktaza) aze DioíransTormace účast CYP1A1/1A2/1B1 (monooxygenaza), EH (hydroláza) a AKR (reduktáza) Detoxikace versus bioaktivace C Y P~Pŕ roxi d a a« ct2?- Bľ CVP1A1/CYP1B1 K poií de H yd rola a e Radien) Calíon llepui mutiny UNA Adrlurl. DP-7.8-Dione DrpiirinifinE katecholy = - metabolity PAHs, - podobně metabolity steroidů (E2) PUFAhs (e.g. lino I ei c seid and arachidonit acid) | ROS Lipid ROOH (e.g. 1 J^HPODE and 1 5-HPETE) Bifunctional elcctrophik ■J-H>drti%y-ľ-nonenai AKRlAl AKR1B1 AKIO-AKRlO AKRIBl ,OH H H 1,4-Dihydro\y -2 -noncnr Biotransformace aldehydů lipidní peroxidace m Nicotin« (tobacco Smoke) CYP2A&/3A4 (tl-hydroxylalion) DNA-adductt SO C'jrhy n> I Reduclion N-CH, HP USD Type 1 AKRICI AKRIC2 AKRIC4 NNAL-gluCuronidc ixeretion Osmotic Stress Reactive v^xy gen Species Electrophilic Stress — AKRIBi AKR1CI AKRlCi AKR?A} J [*!• H J Til • J J \\1M\ WWčWA\n*lZil*WiM¥& (DT-DIAFORÁZY) Cf NAD' NADH Tetrachforohydfoquinone (TCHQJ Tetrachlorabenzoquinone (TCBQ) EPOXIDHYDROLAZY Funkce: - metabolismus lipidů (epoxidů) v živočišných a rostlinných buňkách - metabolismus intermediátů xenobiotik s epoxidovou skupinou celkem 7 forem EH: - savčí solubilní (cytosolova) EH - mikrosomální EH - leukotrien A4 hydroláza etc. Regulace? EPOXIDHYDROLAZ V METABOLICKÉ AKTIVACI POLYCYKLICKÝCH AROMATICKÝCH UHLOVODÍKŮ BlaJP 11 1 ti tt OH l+í-WUP-7.*-dtol OH (+)- and (-1- R(tiF-7.ft-tiol- 9 10-woidde [+}- and [-]-Bia»P-I.S-aiMe HO qH l-J-BU)P-J,8 The catalytic cycle of F.MO KFAtJH-t>dh){NADP*]i] IIFAĎH-ÚHXNADP4:)! HjO Xxff lIFADH3)rJADPHJ| ■ ŕ llFADKkrlDP-*]] >> NADPH FAD KM .h - r Some characteristics of FMO Isoforms most relevant lor drug níĽtalwlisni Substrátu ĽhuiíietiíriatiCi > ľ'MUl (fcCaJ biunan liver, adult kidney, intestine, liver of nonhuman mammals ř ' FM02 (lung) ■ FM03 (adult liver) * Soft nuckupbJlťs (basic amities. sulFides, Se- en P-conlgininfj; compouridEř ■ Favorable: neutral or with single positive cliarue ■ Unfavorable; zwitterionB, anion». dicatioriB Typical reactions Formation of JV-onides (.aliphatic, heterocyclic amines), i-onidcs, i'ť-oxLdcs. pbosphine oxides. No direct dealkylationa or deamüiations by C-liydioxylaiioti as witliCYFs Typical drug Kubstnateü Albendazole, benzvdaniirte, chluropneiiiramiiie, Cimetidine. climÍpmyĽin, fenbendazvie, itopridc. olopatadine, pargyline, ranitidine, sulindac sulfide, thioridazine. &nnomc!ineh zimeldlne Endogenous substrates Cysteamine, cysteine conjugates, lipoic acid. itiííhiůJiittJĚ, trimielbylaniiiK f FM03) Ei LzymcMi belass jud ünb-eulKlJüs .l-f: 'J\i JufdJkiflaýji *.:tiiíĽ cín paired dunort. will] iiiĽnrpťiMiifiň Ar röhrtHon flf mol*f ular ttQtgan rV ĽC 1.14.U: WH* NADH w NAl>PH ffeä* donor, und řncůrpwjiiíoii öf one Ů-aiům S>HCcin:iliL tiJiiK' jY.A'-Drmdhyl iuiilinehN ADPI I'jtaygsp oxictonediictäKc (.V.nxidMuiriTiiiM;} Gene rent, istiforiiií l'MO, fite functional liuman OByrHfříFMOI to PMC!?) ['njilhclic ^rcup hbivin-adenine dimicIctniLlc {f-'AD) Crďnctw NADFM-ä Subcellular toculi7uticn Mirrihnme or vrruwrh endoplasmic reticulum Chrysin^ (higíicsi levels Liver, h m b*. kldnyyn