Kapilární elektroforéza

   

   Stacking

   On-line zakoncentrování vzorku přímo v kapiláře, tzv „stacking“, hraje důležitou roli při
   stanovení velmi zředěných analytů. Během stacking procesu dochází k zakoncentrování vzorku,
   kdy nadávkovaná dlouhá zóna s nízkou koncentrací vzorku je fokusována do zóny krátké o
   koncentraci podstatně vyšší. Pak následuje separace individuálních zón a jejich detekce.

   Stacking proces může být založen na různých principech, v tomto cvičení se seznámíme se
   základním principem, kde v každém bodě kapiláry platí  Kohlrauschova regulační funkce

                             S c[i]/m[i] = konst.

   kde c[i ] je analytická koncentrace a m[i] iontová mobilita komponenty i .

   Po nástřiku dlouhé zředěné zóny o nízké koncentraci vzorku a tudíž o nízké vodivosti dané zóny
   a vložení separačního napětí na kapiláru, je intenzita elektrického pole na této zóně mnohem
   vyšší než na zbytku kapiláry. Tam je vodivost dána složením základního elektrolytu (BGE) a je
   podstatně vyšší. Vlivem vyšší intenzity elektrického pole nadávkované zóny migrují ionty
   analytu rychleji, než by migrovaly v základním elektrolytu až k rozhraní analyt-základní
   elektrolyt, kde jsou po průchodu rozhraním vlivem nižší intenzity el. pole v BGE zpomaleny a
   zakoncentrovány v úzkou zónu a dále migrují a separují se dle principů klasické zónové
   elektroforézy.

   Tento proces budeme sledovat a) na počítači pomocí simulačního programu Simul 5

                                                    b) při analýze na komerčním přístroji
   BioFocus 3000 fy BioRad

   

   

   A) Simulace pomocí programu Simul 5

   Simulační program SIMUL 5 (prof. Gaš, www.natur.cuni.cz/gas) umožňuje sledování koncentračního
   profilu každé ze složek zvoleného elektrolytového systému (BGE i vzorek), pH a vodivosti
   v každém bodě migrační dráhy v závislosti na čase. Na základě toho lze předpovědět průběh
   reálné analýzy a zvolit její optimální podmínky.

   

   1. Seznámení s programem, parametry důležité pro výpočty – iontová mobilita, disociační
   konstanta, koncentrace, délka kapiláry, délka nástřiku, separační napětí

   2. Simulace pro systém : vzorek – kyselina benzoová + kyselina salicylová

                                            BGE – 0.05M kyslina octová + Na^+ , pH=5

   Úkol : popište a srovnejte průběh některých z provedených simulací a přiložte vybrané záznamy

   

   

   B) Analýza směsi kyseliny benzoové a pikrové

   

   Podmínky : měření budou prováděna na komerčním přístroji BioFocus 3000 fy BioRad
   s absorbančním detektorem umožňujícím práci s jednou vlnovou délkou nebo snímat současně celé
   spektrum v rozmezí 190-300nm. Separační křemenná kapilára ( celková délka 24.6cm, 20cm
   k detektoru, vnitřní průměr 75 mm) je umístěna v termostatované kartridži a její vnitřní
   povrch je modifikován vrstvičkou polyakrylamidu pro eliminaci elektroosmózy.

   Vzorek bude dávkován tlakem.

   BGE – 0.05M kyslina octová + Na^+ , pH=5

   

   Úkol

   1) Podle spekter vyberte nejvhodnější vlnovou délku pro analýzu

   2) Ze zásobního roztoku připravte vzorky směsí kyselina benzoová + kyselina salicylová o konc.
   10^-4,

   10^-5, 10^-6 M

   3) Provedťe analýzy a optimalizujte dobu nástřiku a separační napětí

   4) Vypočítejte separační účinnost kapiláry pro vybrané měření vyjádřenou v počtu teoretických
   pater

    N = 5.54 (t/w[1/2])^2

   kde t = doba migrace,  w[1/2] je šířka píku v polovině jeho výšky

   5) K protokolu přiložte popsané elektroferogramy