1 Vstup pro syntézu oligonukleotidů a kontrola čistoty Úloha do laboratorního cvičení - Speciální metody pro 4. ročník odborné chemie, jarní semestr 2007/2008 1. Historie kapalinové chromatografie 1903 - Botanik Cvet dělí na sloupci sorbentu listová barviva 1952 - Nobelova cena Martin, Synge v oboru chromatografie V té době se používají kolony s rozměrem částic dp = 100 - 200 jim, tok vlivem gravitační síly, odebírání frakcí eluátu a stanovení obsahu dělených látek ve frakcích se děje nej častěj i kolorimetricky Nevýhody - pracnost, zdlouhavost a malá účinnost V té době se také rozvíjí plynová chromatografie (GC), jak v technice tak i v teorii. Převzetí poznatků z plynové chromatografie a uplatnění současného stavu přístrojové techniky znamenaly revoluční změnu, jejíž počátek se klade do konce let šedesátých a začátku sedmdesátých: - účinnost kolon se zvyšuje zmenšením částic až po nejčastěji i dnes užívané 7 - 10 jim, současný trend jde až na 1.5 jim, rozměry se úměrně zmenšují na nejobvyklejší 4mm x 150 -250 mm pro konvenční chromatografii, 0,5mm x 60 mm pro pikochromatografii. - vývojem prošla čerpadla na dopravu mobilní fáze pod tlakem skrze kolony, naplněné malými částicemi s rostoucím odporem proti toku mobilní fáze - konstrukce detektorů umožňuje citlivé sledování změn fyzikálních vlastností v toku mobilní fáze, vyvolaných přítomností eluovaných látek (např. spektrofotometrický UV-VIS detektor pro konvenční chromatografii s objemem optické cely 4 lil měří absorpci světla, v moderním provedení s diodovým mostem (PDA) umožňuje analyzovat spektrofotometricky právě eluovanou látku, elektrochemické detektory zaznamenávají elektrochemickou redukovatelnost roztoku nebo změnu vodivosti prostředí, mají zabudovaná čidla přímo v kapiláře, kterou proudí mobilní fáze.) V současné době se bez kapalinové kolonové chromatografie provozované pod tlakem (HPLC, jinak též vysokoúčinné kapalinové chromatografie) neobejde žádná laboratoř. HPLC si stále udržuje svůj význam - umožňuje analyzovat prakticky veškeré organické látky v množstvích od desítek procent do 0,00001 % a v rozpětí relativních molekulových hmotností od stovek u iontů až po několik set tisíc u makromolekul až částic. 2 2. Základní schéma kapalinového chromatografu Požadavky na chromatografické zařízení: a) umožnit pravidelný a konstantní tok mobilní fáze stacionární fází b) zajistit kvantitativní a časově co nejkratší nadávkování analyzované směsi na stacionární fázi c) vytvořit podmínky k co největšímu počtu opakování sorpčních a desorpčních procesů jako výsledku vzájemných vztahů mezi stacionární fází, molekulami složek mobilní fáze a molekulami solutů v analyzované směsi. d) uskutečnit průběžné měření a zaznamenávání změn určitých vlastností tekoucí mobilní fáze, které jsou výsledkem přítomnosti separovaných látek e) být schopné selektivně uvedené změny analyzovat a kvantifikovat Na splnění těchto požadavků jsou konstruovány nebo operátorem voleny jednotlivé části chromatografického zařízení. 1) zásobník mobilní fáze a čerpadlo, 2) čerpadlo, 3) měřič tlaku a přetlakový regulátor, 4) předkolona, 5) spojka, 6) pícka (možnost termostatování kolonového prostoru), 7) dávkovací kohout se smyčkou, 8) kolona, 9) detektor (UV-VIS, PDA, elektrochemický), 10) zařízení pro záznam a zpracování dat, r\ O [ř<2 4 5 10 3 3. Provedení HPLC chromatografického stanovení 3.1 Úkoly cvičení: • stanovení mrtvého objemu VM kolony pomocí neinteragující látky (thiomočovina), • testování kolony - analýzou testovací směsi určit základní parametry kolony, •separace a identifikace tří izomerů guanosinmonofosfátu v jejich směsi metodou HPLC v chromatografické soustavě s obrácenou polaritou fází (tzv. reverse phase HPLC), výpočet chromatografického rozlišení, • stanovení příměsi (nečistoty) ve vzorku guanosin 5'-monofosfátu metodou standardního přídavku. 3.2 Experimentální podmínky: 3.2.1 Chromatograf jako stavebnice, složená z částí HPLC systém 10 AVP fy SHIMADZU: - odplyňovač GT-154, - systémová řídící jednotka SCL-10AVP, - pumpa LC-10AVP na dopravu mobilní fáze pod tlakem, - pícka CTO-IOASVP s dávkovacím kohoutem Rheodyne 7120 a dávkovací smyčkou 20 tu na inj ektování vzorku na kolonu, - fotometrický detektor s diodovým polem detektor SPD-M10AVP, řídící software Class-VP 5.02), - chromatografická kolona rozměrů 250 x 4 mm plněná sorbentem Silasorb C-18, zrnění 5 (im (silikagel s chemicky vázanou oktadecylovou skupinou) - injekční stříkačka se speciálně upravenou jehlou pro dávkování vzorků - ultrazvuková lázeň - odměrné baňky a další běžné laboratorní zařízení 3.2.2 Chemikálie: • mobilní fáze: 25 mM fosfátový pufr, pH 7.0 • zásobní roztoky: guanosin 5'-monofosfát (5'GMP) guanosin 3'-monofosfát (3'GMP) guanosin 2'-monofosfát (2'GMP) 4 3.3 Příprava chromatografu 3.3.1 Příprava mobilní fáze Mobilní fáze musí být čirá, bez zákalu a mechanických nečistot. Opominutí tohoto kroku způsobí, že pod tlakem pístu v čerpadle se vzduch uvolní a bubliny naruší kontinuitu toku mobilní fáze. Pozorujte proto bedlivě, zda ve výtokové kapiláře z detektoru nejdou bubliny. Pokud jsou přítomny je záznam detektoru bezcenný. Mobilní fáze se předem filtruje na speciálním zařízení přes filtr definovaných dimenzí pórů. K odvzdušnení mobilní fáze slouží odplyňovač. Obsahuje-li mobilní fáze vysoký podíl takových organických rozpouštědel, která snadno rozpouštějí vzduch (např. metanol), je třeba mobilní fázi předem odvzdušnit v ultrazvukové lázni. Zásadou postupu před napojením toku mobilní fáze na kolonu je zbavit vedení v kapiláře vzduchu. Na panelu čerpadla, nebo softwarově, se nastaví průtok mobilní fáze přes kolonu na hodnotu 0,20 ml/min. 3.3.2 Ekvilibrace kolony Spustí se čerpadlo stiskem příslušné ikony ovládacího softwaru nebo tlačítka „PUMP" na čerpadle, asi po 10 min ekvilibrace kolony se průtok přepne na hodnotu 0,50 ml/min. Dávkování vzorku a měření je možno zahájit po ustálení tlaku, zpravidla asi za půl hodiny. 3.3.3 Sběr dat Sběr dat se provede dle návodu vedoucího cvičení. 3.3.4 Dávkování vzorku dávkovacím kohoutem Před zahájením vlastního měření se doporučuje několikrát nastříknout do dávkovacího kohoutu destilovanou vodu nebo mobilní fázi. Vzorek dávkovaný na kolonu musí být čirý, částice nebo zákal mohou nevratně znehodnotit kolonu. Vzorky obsahující rozpuštěné plyny (např. metanolické roztoky) je třeba před nástřikem důkladně odvzdušnit v ultrazvukové lázni. Naplnění smyčky dávkovače Při plnění dávkovací smyčky o objemu 20 (il se páčka dávkovače přepne do pohotovostní horní polohy, do dávkovacího otvoru se iemně zasune jehla injekční stříkačky (nezasouvat násilím na doraz) a tlakem na píst injekční stříkačky se naplní dávkovací smyčka dávkovače (na konci odpadní kapiláry odkápne 3-5 kapek). Nástřik vzorku na kolonu Jehla se vytáhne a páčka se přepne do pravé spodní polohy. Tím se uvnitř dávkovače přepne směr toku mobilní fáze tak, že prochází smyčkou. 3.4 Provedení analýzy 3.4.1 Stanovení mrtvého objemu kolony Nastříknutím látky, která není zadržovaná sorbentem, se stanoví tzv. mrtvý čas tM, tj. doba, za kterou kolonou projde látka zcela inertní vůči sorbentu. Při znalosti průtokové 5 objemové rychlosti (F, ml/min), lze vypočítat VM mrtvý objem kolony. Odečteme čas tMas použitím údaje F se vypočte mrtvý objem kolony VM 3.4.2 Testování kolony Před použitím kolony pro chromatografickou analýzu, ať v rutinní analytice v průmyslu nebo i ve vědeckém výzkumu, se doporučuje testování kolony. Při testování se nezajímáme o schopnost kolony separovat a rozlišit určitou směs solutů, ani o to, proč píky některých solutů se více rozmývají než jiné. Toto hodnocení vychází z termodynamického aspektu separačního procesu a tyto parametry lze ovlivnit změnou buď složení jen mobilní nebo jen stacionární fáze nebo obou najednou. Od testování kolony očekáváme její charakteristiku z hlediska transportní funkce, z hledisek kinetiky distribučního procesu mezi stacionární a mobilní fází. Postup testování má být univerzální, parametry kolony se mají porovnávat s určitým standardem, který má být volen tak, aby bylo možné ho použít na kolony, aniž by byl ovlivněn jejich rozměrem, druhem solutů a použitou mobilní fází. Pro testování se volí standardní vzorek - testovací směs - jejíž složky se chovají ideálně z hledisek termodynamiky procesu, mají symetrické píky. Jsou to směsi jednoduchých organických látek - ve cvičení bude analyzována testovací směs aceton, benzen, toluen. Testování provádí i výrobci kolon a atest je ke koloně přiložen, obsahuje údaje: typ kolony, výrobní šarže, složení testovací směsi, objem dávkovaného vzorku, složení mobilní fáze, objemová průtoková rychlost mobilní fáze ml/min, způsob detekce (k a rozsah měření AU) a vzorový chromatogram. Provedení pokusu Připravíme testovací směs, obsahující 4 ml acetonu, 1 ml benzenu a 1 ml toluenu v 44 ml methanolu Na kolonu nadávkujeme 10 |ll1 testovací směsi a zaznamenáme chromatogram, analýzu poté zopakujeme. Z chromatogramů vyhodnotíme údaje (pro každý pík) - dR a Y0.5. Srovnáme hodnotu n (počet teoretických pater), H (výšku ekvivalentu teoretického patra) a redukované veličiny (h= H/dp) vypočtenou na základě těchto hodnot a hodnoty vypočtené softwarem. 3.4.3 Stanovení retenčních časů pro analyzované soluty a) připravíme pracovní roztoky měřených standardů izomerů guanosinmonofosfátu, b) provedeme dva nástřiky každého z těchto roztoků na kolonu. 3.4.4 Analýza směsi izomerů guanosinmonofosfátu a) nastříkneme vzorek směsi a provedeme analýzu, nástřik opakujeme dvakrát. 3.4.5 Stanovení obsahu nečistoty ve vzorku 5'GMT a) připravíme si pracovní roztok vzorku guanosin 5'-monofosfátu dle pokynu vedoucího cvičení, b) tento pracovní roztok nastříkneme a zanalyzujeme, c) k pracovnímu roztoku přidáme dvakrát standardní přídavek identifikované nečistoty a proměříme, 6 d) každou analýzu provedeme 2x. 7 3.5 Vyhodnocení: a) vypočítáme mrtvý objem kolony VM b) pro všechny píky v testovací směsi stanovíme jejich šířku Y0.5 v polovině výšky v mm, z hodnot jejich tR a Y0.5 vypočítáme počet pater N, přepočteme na výšku teoretického patra a získáme údaj pro hodnocení účinnosti kolony c) stanovíme retenční objemy separovaných standardů izomerů guanosinmonofosfátu d) stanovíme kapacitní poměry k separovaných látek jako retenční charakteristiku, sloužící k porovnávání chromatogramu při změně experimentálních podmínek (změna složení mobilní fáze aj.) e) dle měření standardů (retenční časy, spektra) provedeme identifikaci látek v analyzované směsi izomerů guanosinmonofosfátu. f) identifikujeme nečistotu ve vzorku guanosin 5'-monofosfátu. g) pro píky v chromatogramu směsi izomerů stanovíme chromatografické rozlišení. h) ze sady chromatogramu měření standardního přídavku určíme obsah nečistoty ve vzorku guanosin 5'-monofosfátu. 8 Vyhodnocení chromatografického záznamu ti« .. „mrtvý" čas, retence inertní látky tRX.. eluční čas solutu X (min:sec) Vrx vzdálenost píku na záznamu od startu v mm Yo.s(X) šířka v polovině výšky píku Yo.s(2) Charakteristickou veličinou pro každou chromatografovanou látku je eluční (retenční objem) VR. Existuje vztah mezi eluční dobou tR, která uplyne od nástřiku vzorku do dosažení maxima eluční křivky a elučním (retenčním) objemem, tj. objemem mobilní fáze, který za tu dobu proteče => R t R X^M kde FM, je objem mobilní fáze, protekla kolonou za jednotku času (objemová rychlost toku ml/min). Eluční čas tM odečteme na vytištěném chromatogramu, eventuelně jej lze získat ze záznamu zapisovače přepočtem z hodnot vzdálenosti dR maxima píku od linie nástřiku (v mm) s použitím údaje o posunu papíru s (v mm/min). Hodnota elučního časuje v minutách. tR = d R Eluční objem VR je součtem dvou objemových veličin vR=vR+vM kde VM je mrtvý objem a "VR je redukovaný eluční objem. Pro hodnocení rozdílů v retencích látek se často používá pojmu retenční poměr r1;2. Jeho hodnota se počítá z poměru redukovaných retenčních objemů rl,2 Ä2 Ä1 9 V literatuře se retence látek, zvláště při optimalizaci podmínek a hodnocení trendů změn retence, často vyjadřují pojmem kapacitní poměr k. Ten je definován vM Je vyjadřován jako poměr celkového množství separované látky ve stacionární fázi k jejímu celkovému množství ve fázi mobilní k = KD VM KD je distribuční konstanta, Vs objem stacionární fáze, VM mrtvý objem. Základním údajem o rozmývání složek vzorku při transportu kolonou (které se projevuje šířkou píku) je počet teoretických pater kolony n. Tento údaj slouží k hodnocení účinnosti kolony podobně jako odvozená veličina výškový ekvivalent teoretického patra H. Počet teoretických pater se zjistí experimentálně dosazením naměřených parametrů do vztahu n = 5,545 x kde Yo.5 je šířka píku v polovině výšky v mm, dR vzdálenost maxima píku od linie nástřiku v mm, tR je eluční čas v sekundách a Ys0.5 je šířka píku v polovině výšky vyjádřená také v časových jednotkách (sekundy). Výškový ekvivalent výškového patra H (v mm) se vypočítá z délky kolony (v pokusu 150mm) a vypočteného počtu pater n n Pro hodnocení, jak jsou píky od sebe odděleny, se používá veličiny rozlišení. Rozlišení Ri,2 se vypočítá z rozdílu elučních objemů separovaných látek 1 a 2, a hodnot šířek obou elučních křivek v poloviční výšce _ l,177(^2-^i) Ki2 —------------------------- ^0.5(1) + ^0.5(2) Z hodnoty Ri 2 lze odhadnout míru překrývání sousedících píku, při hodnotě R=l jsou píky překryty z 2% plochy, dokonale odděleny jsou při hodnotě > 1,5 Doporučená literatura: J. Churáček, P. Jandera: Úvod do vysokoúčinné kapalinové kolonové chromatografie. SNTL, Praha 1984.