Molecular Biology of the Cell Fifth Edition Alberts, Johnson, Lewis, Raff, Roberts, Walter Garland Science Publ. 2008 Principles of Genetics Fifth Edition Snustad, Simmons John Wiley and Sons, Inc., 2009 • společné vlastnosti živých systémů • u zrodu molekulární biologie byla genetika • milníky v molekulární biologii a genetice • DNA jako genetický materiál • dědičnost a evoluce • úrovně genetických analýz • současné aplikace molekulární biologie a genetiky Genom obsahuje instrukce pro organizaci buněk - "srdce" buňky: knihovna informací o tom, jak buňku zorganizovat tak, aby mohla žít - rozhoduje o tom, jak bude vypadat buňka i celý mnohobuněčný organizmus - obsahuje veškerou genetickou informaci buňky/organizmu - je tvořen DNA - DNA se před dělením buněk replikuje, aby se v nezměněné podobě mohla objevit v dceřiných buňkách - studium DNA umožňuje pochopit buňku a v širším smyslu i celý organizmus Tyto zásadní objevy přinesly výzkumu v oboru genetiky Tři milníky v genetice Gregor Mendel: zákony dědičnosti James Watson a Francis Crick: struktura DNA Human Genome Project: podrobná analýza lidské DNA Johan Gregor Mendel: Geny a zákony dědičnosti (1866) Geny—faktory, které se dědí a zodpovídají za vlastnosti organizmu Alely—různé formy genu Zákony dědičnosti Alely stejného genu se oddělují při tvorbě gamet Alely různých genů se dědí nezávisle Co je gen? Chemicky jsou geny tvořeny nukleovými kyselinami Nukleové kyseliny jsou sestaveny ze strukturních jednotek zvaných nukleotidy Nukleotidy mají tři složky Molekulu cukru (ribóza nebo deoxyribóza) Molekulu fosfátu molekulu obsahující dusík, tzv. bázi (adenin, guanin, cytozin, tymin, uracil) RNA značí kyselinu ribonukleovou DNA značí kyselinu deoxyribonukleovou většina organizmů využívá DNA jako genetický materiál, jen některé viry používají RNA Způsob uložení instrukcí v genomu Jak může nukleová kyselina nést informaci? • je uložena v pořadí (tzv. sekvenci) nukleotidů A, G, C, T • genetický kód: lineární pořadí monomerů A, G, C, T v polymeru dvouřetězcové DNA • stejný kód používají všechny buňky na Zemi • informace bakteriální DNA může být přenesena do lidské buňky (nebo naopak) a bude novou hostitelskou buňkou správně kopírována, přečtena a interpretována • stálost během evoluce (3.5 miliard let) Watson a Crick: Struktura DNA (1953) • objev způsobu organizace nukleotidů v DNA • nukleotidy jsou spojeny do řetězců tím, že se mezi cukry a fosfáty vytvářejí kovalentní vazby • molekuly DNA jsou tvořeny dvěma řetězci nukleotidů, které se kolem sebe obtáčí a vytvářejí šroubovici • řetězce k sobě vážou vazby mezi páry bází A se páruje s T G se páruje s C Vlastnosti dvouvláknové DNA (tzv. duplexu DNA) • pravidla párování bází způsobují, že sekvence nukleotidů jednoho řetězce dvoušroubovicové DNA předurčuje nukleotidovou sekvenci druhého řetězce DNA: oba řetězce jsou komplementární • pořadí bází v DNA (lineární sekvence) není náhodné, ale představuje základní vlastnost každého řetězce • sekvencemi bází se jednotlivé geny mezi sebou liší • molekuly DNA mohou být obrovské: desítky miliónů párů bází (více než 10 cm) Projekt analýzy lidského genomu: (Human Genome Project - "HUGO"): sekvenování DNA a katalogizace genů první polovina 20. století: snahy a identifikaci látky, ze které jsou geny tvořeny druhá polovina 20. století: snahy o určení pořadí bází v molekulách DNA (sekvenování DNA) konec 20. století: získání informací o sekvencích nukleotidů prvních organizmů Projekt analýzy lidského genomu: (Human Genome Project - "HUGO"): sekvenování DNA a katalogizace genů Genom—soubor všech molekul DNA daného organizmu Genomika-přístup k analýze sekvencí DNA, které tvoří genom Hlavními genomickými přístupy jsou sekvenování DNA, robotizace v kombinaci s počítačovými technologiemi Projekt lidského genomu určil sekvenci cca 3 miliard nukleotidů DNA lidského genomu Milník: prvním sekvenovaným genomem byl genom fága fX174 fX174 je virus, jehož genetický materiál tvoří jednořetězcová DNA druhý řetězec lze syntetizovat in vitro a využít pro zjištění sekvence bází Frederick Sanger sekvenoval genom fX174 (5375 nukleotidů) v roce 1977 Projekt lidského genomu • snaha o určení sekvence cca 3 miliard nukleotidových párů lidské DNA • zapojena řada laboratoří po celém světě (soukromé i státní) • v roce 2001 publikovány dva články popisující sekvenci 2,7 miliónů nukleotidových párů • počítačová analýza této DNA naznačila, že lidský genom obsahuje 30.000 - 40.000 genů • pozdější upřesňující studie ukázaly, že lidský genom obsahuje 20.000 - 25.000 genů • tyto geny byly katalogizovány podle umístění, struktury a potenciální funkce • současné snahy jsou zaměřeny na pochopení jejich funkcí Take home message • Gregor Mendel předpověděl existenci speciálních faktorů - dnes zvaných geny-které vysvětlují způsob, jakým se znaky organizmů dědí • alely, tj. alternativní formy genů, vysvětlují dědičné rozdíly mezi jednotlivci • James Watson a Francis Crick popsali strukturu DNA jako makromolekulu složenou ze dvou komplementárních řetězců nukleotidů • DNA představuje genetický materiál všech forem života, s výjimkou několika virů,u kterých má dědičný materiál povahu RNA • projekt lidského genomu určil sekvenci nukleotidů DNA lidského genomu • sekvenování DNA genomu poskytuje údaje nutné pro identifikaci a katalogizaci všech genů organizmu DNA jako genetický materiál • tok genetické informace: DNA RNA protein (genová exprese) • všechny buněčné organizmy používají jako genetický materiál DNA • požadavky na genetický materiál: - schopnost replikace (přenos na potomstvo v nezměněné podobě) - schopnost obsáhnout informaci (řídit aktivitu buněk, vývoj, fungování a vlastnosti organizmu) - schopnost přijímat změny (adaptace organizmů) Replikace DNA • propagace genetické informace • podmínka přenosu informace z jedné buňky na druhou při buněčném dělení • typická vysokou přesností (několik málo chyb na stovky miliónů replikovaných nukleotidů) Replikace DNA probíhá přesným kopírováním předlohy - templátu • životodárný mechanismus replikace DNA vyplývá z její dvouřetězcové struktury: • polymer DNA se skládá z monomerů, tzv. nukleotidů • každý nukleotid má 3 složky: - cukr (deoxyribózu) - fosfátovou skupinu navázanou na cukr - postranní bázi obsahující dusík (adenin, tymin, cytozin nebo guanin) • každá cukerná složka je připojena k sousední přes fosfátovou skupinu silnou kovalentní vazbou • důsledkem je vznik polymeru složeného z opakujícího se motivu „cukr-fosfát-cukr-fosfát-…“ a postraních bází • pravidla párování bází způsobují, že sekvence nukleotidů jednoho řetězce dvoušroubovicové DNA předurčuje nukleotidovou sekvenci druhého řetězce DNA: oba řetězce jsou komplementární Replikace DNA probíhá přesným kopírováním předlohy - templátu • polymer DNA se zvětšuje přidáváním monomerů k jednomu konci podle templátu v podobě dříve vytvořeného řetězce DNA • báze vyčnívající z existujícího řetězce vážou báze nově se tvořícího řetězce na základě přísných pravidel komplementarity (A se páruje s T, G s C) nekovalentními vodíkovými vazbami • vzniká dvouřetězcová DNA složená ze dvou zcela komplementárních řetězců, které se kolem sebe obtáčí a tvoří dvoušroubovici Replikace DNA: 1. krok - separace řetězců • řetězce dvoušroubovice DNA mají komplementární povahu a drží pohromadě vodíkovými vazbami mezi bázemi • vodíkové vazby mezi páry bází jsou mnohem slabší než kovalentní vazby v cukr-fosfátové kostře • porušením vodíkových vazeb se řetězce oddělují • proto je možné oddělení řetězců od sebe, aniž by byla cukr-fosfátová kostra poškozena • každý řetězec pak může sloužit jako templát pro syntézu komplementárního vlákna, tj. pro vytvoření kopie dědičné informace Replikace DNA: 2.krok - syntéza komplementárních vláken • oddělené řetěze slouží jako templáty pro syntézu nových vláken (diktují pořadí nukleotidů v nově syntetizovaných vláknech na základě pravidel o párování bází) • proces replikace neprobíhá spontánně, ale vyžaduje účast speciálních enzymů • po skončení replikace je každé templátové vlákno spárováno s nově vytvořeným partnerských vláknem Archea • často žijí v nehostinných podmínkách pro člověka: močálech, hloubkách oceánů, horkých pramenech, apod. • byly nalezeny i v jezerech, v půdě nebo žaludcích dobytka • morfologicky jsou podobné eubaktériím • z hlediska metabolismu a způsobu přeměny energie jsou bližší eubaktériím • ve způsobu, jakým provádějí procesy replikace, transkripce a translace jsou bližší eukaryotům Genetika a evoluce • během generací se v DNA hromadí mutace a způsobují odlišnosti mezi organizmy • variabilita sekvencí DNA umožňuje druhům vývoj v čase • organizmy s podobnými sekvencemi DNA pocházejí ze společného předka Genetika a evoluce • výzkum biologické evoluce nastartovalo znovuobjevení Mendlových zákonů na začátku 20. století a později po zavedení technologie sekvenování DNA koncem 20. století • pomocí sekvenování DNA můžeme zviditelnit podobnosti a odlišnosti genetického materiálu různých organizmů • za přepodkladu, že sekvence nukleotidů DNA se proměňují v čase, lze podobnosti a odlišnosti interpretovat v časovém rámci • organizmy s velmi podobnými sekvencemi DNA se vyvinuly ze společného předka relativně nedávno, organizmy s méně podobnými DNA pocházejí ze vzdálenějšího společného předka: možnost stanovení historických vztahů mezi organizmy (tzv. fylogenetické vztahy) Různé části genomu se liší v ochotě přijímat změny • část DNA, která nemá kódující ani regulační funkci se může volně měnit a hromadit mutace • gen, kódující důležitý protein nebo RNA se nemůže libovolně měnit – je „evolučně konzervativní“ • během evoluce se mnohé úseky DNA změnily k nepoznání, ale konzervativní geny si svou strukturu udržují ve všech organizmech bez podstatných změn Konzervativní geny se využívají při studiích zaměřených na příbuznost organizmů • studie vedoucí ke klasifikaci organismů na eubakterie, archebakterie a eukaryota byly založeny na srovnání struktur jedné ze dvou hlavních RNA složek ribozomů (rRNA malé ribozomální podjednotky) • translace je esenciální proces probíhající ve všech živých buňkách, proto tato rRNA si uchovává svou strukturu v zásadě nezměněnou po celou dobu evoluce • fylogenetické stromy se sestavují na základě sekvenčních dat a znázorňují historické vztahy mezi organizmy Většina eubakterií a archebakterií má 1000-6000 genů • u prokaryotických organizmů selekce favorizuje rychlost: rychlý příjem živin (velký povrch jednobuněčného organizmu), rychlá reprodukce • proto jen genom prokaryotických buněk kompaktní: malý, geny následují jeden za druhým s malým prostorem pro regulační elementy • lze relativně snadno sekvenovat a najít geny, které se jsou společné pro všechny 3 větve stromu života a které jsou typické jen některé z nich Evoluce genů • nové geny vznikají z dříve existujících genů • inovace starých sekvencí mohou nastat několika způsoby: - intragenovou mutací (většinou v důsledku chyby při replikaci) - genovou duplikací (vzniká pár původně identických genů v jedné buňce, který usnadňuje divergenci v průběhu evoluce) - přestavbou úseků DNA (dva nebo více genů může být přerušeno zlomem a znovu spojeno za vzniku fúzních, tj. hybridních genů) - horizontálním přenosem části DNA z jedné buňky do druhé Geny se mohou přenášet mezi organizmy (přirozeně i uměle) • viry nejsou živé, ale fungují jako vektory pro přenos genů: parazitují na reprodukčním a biosyntetickém systému hostitelské buňky • infikují buňku, uvnitř replikují svou DNA, sestaví nové virové částice, buňku opustí a infikují jinou • napadená buňka většinou infekci virem nepřežije • může však dojít i k situaci, kdy virová DNA se nepoužívá k okamžité produkci nových virových částic, ale perzistuje v hostiteli po několik generací jako neškodný cestující: buď se stává součástí genomu hostitele nebo jako samostatný fragment DNA • viry mohou náhodně přenést část genomu jednoho hostitele do druhého Horizontální přenos genů • horizontální přenos genů mezi eukaryontními buňkami různých druhů je velmi vzácný, zřejmě není podstatný pro evoluci eukaryot • přenosy genů z bakteriálních do eukaryotických genomů byl významný při evoluci mitochondrií a chloroplastů • přenos mezi různými druhy prokaryot je běžný vzhledem k jejich pozoruhodné schopnosti přijmout cizorodou (i nevirovou) DNA ze svého okolí • geny zajišťující rezistenci k antibiotikům nebo produkci toxinů se šíří, protože hostitelům poskytují selekční výhodu • horizontální přenos genů může vést ke vzniku nebezpečných bakterií např. během 40 let se rozšířily druhy Neisseria gonorrheae (původce kapavky) rezistentní k penicilinu • odhaduje se, že alespoň 18% všech genů E.coli bylo přeneseno horizontálním přenosem z jiných druhů Úrovně genetické analýzy • založená na studiu křížení různých druhů organizmů (dlouhodobý proces provázející lidstvo od počátku civilizace: šlechtění kulturních plodin, křížení dobytka, atd.) • zahrnuje studium struktury a funkce chromozomů • zahrnuje transmisní genetiku a studie povahy genetického materiálu Úrovně genetické analýzy • proniká do klasických principů šlechtění v zemědělství od 80. let 20. století • studie replikace, exprese a mutace genů na molekulární úrovni • základem jsou studie sekvencí DNA a manipulace s molekulami DNA • po identifikaci genů zodpovědných za důležité vlastnosti (odolnost k nemocem, prudkce zrna, apod.) snahy o přenos příslušných alel do zemědělských plodin Úrovně genetické analýzy • jednotlivci uvnitř populace mohou být nositeli různých alel • populační genetika je založena na studiu frekvencí alel v populaci a určení, zda jsou tyto frekvence v čase stálé nebo proměnlivé • populační genetika zahrnuje studium evoluce a dědičnost komplexních znaků Take home message • klasická genetika: studium genů podle přenosu znaků křížených organizmů • molekulární genetika: studium genů po izolaci, sekvenování a manipulaci DNA a sledování produktů genové exprese • populační genetika: studium genů na základě sledování variability mezi jednotlivci uvnitř skupin organizmů Současná genetika v zemědělství: Geneticky modifikované organizmy • Geneticky modifikované organizmy (GMO) byly pozměněny tím, že přijaly cizorodé geny • např. v USA je rozšířená kukuřice s uměle vneseným genem z Bacillus thuringiensis, který kóduje protein toxický pro hmyz (plodina produkuje svůj vlastní insekticid) Současná mol. genetika v lékařství • Existuje mnoho nemocí způsobených mutantními geny • jejich studium začalo krátce po znovuobjevení Mendlovy práce • v r. 1909 britský lékař Sir Archibald Garrod publikoval knihu Inborn Errors of Metabolism • význam: - poprvé prokázáno, že poruchy metabolismu mohou být způsobeny mutantními alelami - vyprovokován další výzkum, kterým se během několika dalších desetiletí podařilo odhalit velký počet dědičných poruch člověka - lékaři se naučili diagnostikovat dědičné choroby studiem rodin a předpovídat jejich výskyt u potomků - i dnes mají nemocnice genetické poradce, kteří mají za úkol informovat o rizicích přenosu dědičných poruch Současná mol. genetika v lékařství • nové způsoby detekce mutantních genů - diagnostické testy pro analýzu DNA, např. z krevního vzorku nebo stěru sliznice lze snadno zjistit přítomnost mutantní alely genu BRCA1, která signalizuje vysokou pravděpodobnost vzniku rakoviny prsu • nové způsoby léčby chorob (dříve se pro léčbu cukrovky používal inzulin izolovaný z prasat, dnes je k dispozici lidský vyráběný bakteriálními buňkami, které nesou lidský gen kódující tento protein) Současná mol. genetika v biotechnologiích - lidský růstový hormon se dříve získával z mrtvol, nyní je rovněž produkován bakteriálními buňkami – léčba dětí, které nemají dost hormonu, protože nesou mutantní alelu příslušného genu – bez aplikace hormonu - dwarfismus – biotechnologicky z baterií se získává mnoho proteinů, které jsou pro medicínu důležité Genové terapie jiný způsob aplikace technologií molekulární genetiky – začlenění zdravé (funkční kopie) určitého genu do buněk člověka, který nese jeho mutantní (nefunkční) variantu – nový gen kompenzuje nedostatečnou funkci vlastního genu – dosavadní výsledky nejsou ideální (např. se nezdařila léčba cystické fibrózy přenosem genu CF do plicních buněk) – úspěšnější jsou výsledky léčby poruch imunitního systému a nemocí krve přenosem genů do buněk kostní dřeně Společenské a hospodářské aspekty aplikací mol. biol. • ekonomický: biotechnologický a farmaceutický průmysl přispívají k zajištění potravy a lékařské péče • právní: pomocí DNA lze dosáhnou jednoznačné identifikace člověka: testy otcovství, kriminalistika, identifikace mrtvých, spory o dědictví, apod. • filozofický: DNA je součástí každého z nás, provokuje otázky: kdo jsme? odkud pocházíme? do jaké míry je naše povaha zděděna a tak determinována ? ovlivňuje způsob, jakým organizujeme svou společnost? Take home message • objevy mol. genetiky mění postupy v zemědělství a lékařství • pokroky v mol. genetice provokují etické, právnické, politické, společenské a filozofické otázky