Buněčný cyklus „When a cell arises, there must be a previous cell, just as animals can only arise from animals and plant from plants“. (Rudolf Wirchow, 1858) Jediným způsobem jak může vzniknou nová buňka je duplikace již buňky existující • kontinuita života od jeho vzniku Buněčný cyklus • jak buňky dosáhnou zdvojnásobení svého obsahu? • jak dosáhnou přesného rozdělení svého obsahu do dvou smysluplných celků? • jak vzájemně koordinují tyto procesy? • uspořádání životních procesů buňky do logického sledu tak, aby mohlo dojít k duplikaci chromozomů a buněčnému dělení za vzniku přesných kopií buňky rodičovské • podmínka tvorby vícebuněčných struktur, aktivně probíhá i v dospělých mnohobuněčných organismech (nahrazování buněk odumírajících, milióny nových buněk za vteřinu, podmínka přežití) • principy řízení replikace a segregace chromozomů jsou obdobné ve všech buňkách Periodické proměny buněk byly nejdříve zaznamenány světelnou mikroskopií • mitóza (rozdělení chromozomů) • cytokineze (rozdělení cytoplazmy) • interfáze (období růstu buňky a replikace DNA) Fáze M (mitóza + cytokineze) • buňka je zaměřena na funkce související s buněčným dělením • metabolická aktivita slabá • rozpad jaderné membrány (do ER) • tvorba mitotického vřeténka • kondenzace chromozomů do kompaktních chromatid • sesterské chromatidy drží pohromadě („sister-chromatid cohesion“) • sestavení kinetochorů, připojení chromatid k mitotickému vřeténku • rozložení kohezívních molekul mezi chromatidami, separace chromatid k opačným pólům • rozpad vřeténka, • dekondenzace segregovaných chromozomů • obnovení jaderné membrány (spojení s ER zůstává) Metafázový kontrolní bod • kontrola segregace chromozomů: oddaluje začátek separace sesterských chromatid, dokud nejsou všechny chromozomy správně napojeny na mitotické vřeténko Interfáze • tvoří většinu cyklu: hodiny, dny, týdny nebo delší období podle buněčného typu • růst buňky • výrazná metabolická aktivita • rozdělena do fáze G[1] (”first gap“), S (“synthesis”), G[2] (“second gap“) • jaderná membrána je spojena s ER Fáze G1 • nejdelší a nejvariabilnější fáze cyklu • poskytuje čas pro biosyntetické procesy, sestavování organel a pro monitorování vnějších a vnitřních podmínek před zahájení S fáze • dostatek živin a růstových faktorů: růst buňky, vysoká metabolická aktivita • nedostatek živin nebo anti-proliferační signál: zpomalení postupu fází G1 nebo opuštění cyklu do fáze G0, ve kterém může setrvat dny, týdny, měsíce... • postup fází G1 je řízen dvěma kontrolními body: bodem restrikce a kontrolním bodem sledujícím stav DNA (oba body bývají defektní u nádorových buněk) Fáze G0 • fáze, ve které se nachází většina buněk mnohobuněčných organismů: jsou diferencované a specializované k výkonu určité funkce, nedělí se • není to klidová fáze: aktivní proteosyntéza, sekrece, pohyblivost • možnost opětného vstupu do buněčného cyklu po přijetí určitého signálu Fáze S • část interfáze, při které dochází k replikaci DNA Fáze S • k iniciaci replikace dochází na místech ori– problém koordinace: - nutnost zajištění úplné replikace každého chromozomu - nesmí dojít k opakované iniciaci ze stejného ori v rámci jednoho replikačního cyklu • výsledkem fáze S jsou molekuly DNA v každém z párů duplikovaných chromozomů, které pohromadě drží speciální proteinové vazby Princip kontroly fáze S: • Během fáze G1 se chromozomy modifikují navázáním proteinu RLF („replication licensing factor“) do oblasti ori, což představuje signál, že replikace dané oblasti chromozomu může proběhnout (pre-replikační komplex). Během replikace RLF místo ori opouští a může se na něj znovu navázat až po dokončení fáze M. Fáze G2 • je fází, ve které buňky provádějí kontrolu DNA a připravují se na mitózu • v případě, že je nalezena nereplikovaná nebo poškozená DNA, nebo nedošlo k duplikaci centrozomu (kontrolní body v G2), dochází ke spuštění protein kinázové kaskády, která znemožní zahájení mitózy • poškození těchto kontrolních bodů může přispět k vzniku rakoviny Časové odlišnosti buněčného cyklu Existují • buňky s výraznou strukturní a funkční specializací, které nemají schopnost dělení (nervové buňky, svalové buňky, červené krvinky) • buňky, které se normálně nedělí, ale za určitých okolností se dělit mohou (jaterní buňky, lymfocyty) • buňky, které se přirozeně dělí velmi rychle (epiteliální buňky, krevní kmenové buňky) Časové nároky buněčného cyklu velmi variabilní, podle typu tkáně • méně než 30 minut u některých embryí (obojživelníci) • kvasinky 1,5 - 3 hod. • buňky střevního epitelu 12 hod. • savčí fibroblasty v kultuře 20 hod. • savčí játra cca 1 rok • typická rychle rostoucí lidská buňka má 24. hod. cyklus (G1/11 hod., S/8 hod., G2/4 hod., M/1 hod.) Variabilita fází buněčného cyklu • nejvíce variabilní je fáze G[1] • většina buněk, které se přestanou dělit zůstává ve fázi G[0] Syntéza makromolekul během buněčného cyklu • během interfáze je syntéza RNA a proteinů relativně konstantní • během mitózy klesá syntéza proteinů a zastavuje se syntéza RNA • všechny druhy proteinů s výjimkou histonů se tvoří průběžně během interfáze • histony se tvoří výlučně ve fázi S Buněčný cyklus a kvasinky Výhody kvasinkového modelu: • dostupnost údajů o sekvenci (usnadnění charakterizace nových genových produktů) • haploidní status, možnost přenosu cizorodé DNA, začlenění této DNA do chromozomu homologní rekombinací (usnadnění genetických analýz) • snadná kultivace, vysoká rychlost cyklu • možnost jednoduchého vyhodnocení fáze buněčného cyklu mikroskopickou analýzou morfologie buněk: - u pučících kvasinek (Saccharomyces cerevisiae) nepřítomnost pupene – značí fázi G1, přítomnost pupene menšího než u rodičovské buňky – značí fázi S, přítomnost pupene podobné velikosti jako u rodičovské buňky – značí fázi G2 - u štěpících se kvasinek (Schizosaccharomyces pombe) lze na fázi cyklu usuzovat z délky buněk Buněčný cyklus je sled navazujících fází Principy řízení cyklu • poškozená DNA se nesmí replikovat • mitóza nesmí začít před dokončením replikace • poškozená DNA nesmí být předána do dceřinných buněk • chybně spárované chromozomy nesmí dokončit mitózu Principy regulace buněčného cyklu • Posttranslační modifikace - fosforylace - proteolýza II. Řízení buněčného cyklu III. Kontrolní body buněčného cyklu Principy regulace buněčného cyklu • Posttranslační modifikace - fosforylace - proteolýza II. Řízení buněčného cyklu III. Kontrolní body buněčného cyklu Přehled chemických modifikací • kovalentní vazba chemické skupiny k aminokyselině proteinu • typy modifikací: - acetylace (obvykle na 1. aminokyselině) - fosforylace (obvykle spojena s regulacemi) - lipidace (připojení k membráně) - glykosylace (obvykle vně buňky) Modifikace proteinů fosforylací • fosfátové skupiny jsou připojeny protein kinázami • fosfátové skupiny jsou odstraněny fosfatázami Proč je fosforylace tak běžným mechanismem regulujícím aktivitu proteinů? • je reverzibilní • velké negativní náboje fosfátové skupiny mohou způsobit významné změny ve struktuře proteinů, které ovlivní jejich funkci Proteinové kinázy • katalyzují vazbu fosfátových skupin k proteinům (tzv. fosforylaci) • fosfátové skupiny přenášejí z ATP (za vzniku ADP) • řídí aktivitu mnoha buněčných proteinů • proteiny mohou být fosforylovány na mnoha místech • hlavní regulátory buněčného cyklu a buněčných signalizací Rozklad proteinů • nepotřebné proteiny se rozkládají proteázami (proteolýzou) na aminokyseliny • často se využívá proteáz soustředěných do proteazomu • regulace buněčného cyklu zahrnuje proteolýzu regulačních proteinů, což zajišťuje ireverzibilitu jednotlivých fází Principy regulace buněčného cyklu • Posttranslační modifikace - fosforylace - proteolýza II. Řízení buněčného cyklu A. Kontrolní body cyklu B. Komplexy Cdk („cyclin-dependent kinase“) C. APC („anaphase-promoting complex“) Sledování celistvosti DNA • buňky s poškozenou nebo částečně replikovanou DNA zastavují svůj postup cyklem v pozdní fázi G1 nebo G2 • porucha je před obnovením cyklování buď odstraněna nebo buňka odumírá apoptózou Metafázový kontrolní bod • kontroluje sestavení mitotického vřeténka • oddaluje okamžik separace chromatid, dokud nejsou všechny chromozomy řádně připojeny k vřeténku To divide or not to divide: that is the question • buňky kvasinek se rozhodují podle své velikosti, která odráží dostupnost živin • buňky savců se rozhodují podle přítomnosti růstových faktorů, zvaných mitogeny, které stimulují růst buněk, resp. anti-mitogeny, které růst tlumí Biochemie buněčného cyklu • průběh každou fází buněčného cyklu zajišťuje soubor specifických proteinů, jejichž aktivita je závislá na stupni fosforylace • přechod mezi jednotlivými fázemi je řízen protein kinázami a fosfatázami • klíčovými enzymy jsou protein kinázy aktivované cykliny specifickými pro danou fázi cyklu Komplexy Cdk („cyclin-dependent kinases“) a cyklinů Cykliny Čtyři hlavní druhy cyklinů Funkce cyklinů Cyklin-dependentní kinázy Cdk • katalytické podjednotky komplexů Cdk-cyklin • jejich aktivita se zapíná spojením s cykliny • jejich aktivita (nikoliv koncentrace) pravidelně kolísá během cyklu • fosforylují proteiny zodpovědné za průběh a regulaci buněčného cyklu Inhibice cyklu fosforylací Cdk • oscilace cyklinů primárně určuje aktivitu Cdk • pomocné mechanismy přispívají jemné regulaci aktivity Cdk: - fosforylace dvojice aminokyselin v blízkosti aktivního místa kinázou Wee1 inhibuje aktivitu komplexu cyklin/Cdk - defosforylace těchto aminokyselin fosfatázou Cdc25 zvyšuje aktivitu komplexu cyklin/Cdk Inhibice cyklu inhibičními proteiny CKI • vážou se na komplexy cyklin/Cdk: změna struktury aktivního místa Cdk • využívají se především při řízení aktivity komplexů cyklinů/Cdk fází G1/S a S Řízení cyklu cyklickou proteolýzou • likvidace cyklinů • přechod z metafáze do anafáze Anaphase-promoting complex (APC/C) • zajišťuje likvidaci 2 důležitých typů proteinů: sekurinu a cyklinů S a M fáze • k aktivaci dochází uprostřed M fáze, aktivovaný stav přetrvává až do fáze G1 až do okamžiku, kdy dojde k akumulaci komplexů cyklinů G1/S a Cdk Anaphase-promoting complex (APC/C) • APC/C se aktivuje v mitóze připojením aktivační podjednotky Cdc20 (během anafáze) nebo Cdh1 (v pozdní M a rané G1 fázi) • tyto podjednotky se podílejí na rozeznání substrátů • s pomocí proteinů E1 a E2 APC/C přenáší molekuly ubikvitinu na cílový protein, např. cyklin B • následuje rozklad označeného proteinu proteazomem Komplexy Cdk/cyc a jednotlivé fáze cyklu - komplexy fáze G1: Cdk4 nebo Cdk6 a cykliny D (D1, D2, D3) - komplexy přechodu fází G1/S: Cdk2 a cykliny E (E1, E2) - komplexy fáze S: Cdk2 a cykliny A (A1, A2) - komplexy pozdní fáze S a fáze G2: Cdc2/Cdk1 a cykliny A - mitotické komplexy Cdk (MPF): Cdc2/Cdk1 a cykliny B (B1,B2) Hladina cyklinu B určuje aktivitu MPF • vysoká hladina cyklinu B ð vysoká aktivita MPF • nízká hladina cyklinu B nízká aktivita MPF • syntéza cyklinu B začíná během interáze (fáze S a G[2]) Řízení mitózy: 2 fáze 1. skokové zvýšení aktivity MPF v kontrolním bodě G2/M: zahájení procesů rané mitózy (profáze, prometafáze, metafáze): MPF a další kinázy fosforylují proteiny zapojené do sestavování mitotického vřeténka a jeho připojení k párům sesterských chromatid 2. aktivace APC na rozhraní metafáze a telofáze: - rozložení sekurinu, čímž se uvolní proteáza štěpící kohezin a nastane separace sesterských chromatid - rozložení cyklinů, inaktivace Cdk, defosforylace substrátů: podmínka zahájení pozdní M fáze (dokončení anafáze, rozložení vřeténka, cytokineze) MPF posunuje buňku do M fáze MPF zajišťuje všechny procesy, které se odehrávají v rané mitóze: - indukce sestavení dělícího vřeténka - indukuje kondenzaci chromozomů - zodpovídá za rozložení jaderné membrány, změny aktinového cytoskeletu a Golgiho aparátu MPF napomáhají 2 další rodiny proteinových kináz: "Polo-like kinases" a "Aurora kinases" Jejich aktivita závisí na MPF Přítomnost cyklinu B není jedinou podmínkou aktivace MPF Podmínky aktivity MPF u kvasinek S. cerevisiae • fosforylace Thr-161 proteinu Cdc2 (kinázou CAK) • defosforylace Thr-14 a Tyr-15 proteinu Cdc2 (fosfatázou Cdc25) Čtyři úrovně regulací cyklin-dependentních kináz 1. Regulace Cdk interakcí s Cykliny určující je míra syntézy a degradace cyklinů 3. Aktivace Cdk defosforylací • fosforylace Thr 14 a Tyr 15 (zajištěná kinázami Wee1 a Myt1) inaktivuje Cdk 2 • defosforylaci zajišťují fosfatázy rodiny Cdc25 Absence funkčního p53 • nemožnost pozastavení buněčného cyklu • replikace neopravené DNA • hromadění mutací • riziko vzniku rakoviny Mutace v genu p53 se objevují ve více než 50% lidských zhoubných nádorů. Živočišné buňky vyžadují mimobuněčné signály pro dělení, růst a přežití Signální molekuly jsou produkovány jinými buňkami téhož organismu. Klasifikace do tří hlavních skupin: • Mitogeny – stimulují buněčné dělení tím, že překonávají přirozené brzdící mechanismy buněčného cyklu • Růstové faktory – stimulují růst buněk vedoucí k navýšení buněčné hmoty tím, že indukují syntézu a inhibují degradaci proteinů a jiných makromolekul • Faktory pro přežívání („survival factors“) – zvyšují životaschopnost buněk supresí programované buněčné smrti Mitogeny stimulují buněčné dělení • vážou se na povrchové receptory a aktivují je • aktivované receptory stimulují různé buněčné signální dráhy, které zajistí zvýšenou proliferaci tím, že uvolní nitrobuněčné molekulární „brzdy“, které blokují přechod z fáze G1 do fáze S Typickou brzdou buněčného cyklu je protein Rb („retinoblastoma protein“) Protein Rb • původně nalezen při studiu dětského očního nádoru – retinoblastomu: u postižených dětí protein Rb chybí nebo je defektní • objevuje se ve vysoké míře v jádrech zdravých buněk všech obratlovců • spolu s rodinou transkripčních faktorů E2F řídí kontrolní bod restrikce • interakce E2F a Rb s promotory řady cílových genů nutných pro proliferaci vypíná jejich expresi: cyklus se v bodu restrikce zastaví • fosforylace Rb vyvolá jeho disociaci od E2F, což aktivuje expresi příslušných proliferačních genů: průchod bodem restrikce obnoven Mitogeny uvolňují brzdící účinek Rb • mitogeny aktivují signální dráhy, které vedou k tvorbě aktivních komplexů cyklinu D a Cdk 4 ve fázi G1 • komplex Cdk4/cyklin D fosforyluje protein Rb • fosforylovaný Rb mění konformaci a uvolňuje E2F, který pak může aktivovat expresi genů nutných pro buněčnou proliferaci