Obecná biologie ­ Fyziologie živočichů
Oddělení fyziologie a imunologie živočichů
Imunologie: studium obranyschopnosti
Srovnávací a ekologický přístup:
­ živočichové včetně člověka
- širší mezioborový přístup než na LF
Fyziologie: studium funkcí
Výchova k vědecké práci:
* využívání informačních zdrojů
* experimentální laboratorní praxe
* hodnocení výsledků
* prezentace vlastních výsledků
Uplatnění:
* Biomedicínský základní výzkum (AVČR,
Univerzity, ústavy)
* Klinická pracoviště a laboratoře (humánní,
veterinární)
* Zemědělsky orientovaný výzkum
* Soukromé firmy
Skupina imunologie hmyzu
Pavel Hyršl
Skupina imunologie hmyzu
Pavel Hyršl
Oddělení fyziologie a imunologie živočichů
Ústav experimentální biologie
Přírodovědecká fakulta
Masarykova Univerzita v Brně
http://www.sci.muni.cz/ofiz/
- prohemocyty
- plasmatocyty
- granulocyty
- spherulocyty
- oenocyty
- fagocytóza
- enkapsulace
- nodulace
- koagulace
Hmyzí hemocyty:
Imunitní reakce hemocytů:
Obr. 1 : Navržené schema působení indukovaných antibakteriálních proteinů a
peptidů na buněčnou stěnu bakterií (Hultmark 1993)
ˇ gely vznikají polymerací akrylamidu a N',N'-methylenbisakrylamidu
* SDS (sodium dodecylsulfát) se váže shodně na všechny proteiny
v poměru 1,4 g / 1g proteinu a předává jim silný záporný náboj
* mercaptoethanol - rozštěpí disulfidické můstky v molekulách proteinů
Elektroforéza SDS ­ PAGGE
(sodium dodecylsulfat polyacrylamide gradient gel electrophoresis)
* vertikální elektroforéza SE 600 (Hoefer Scientific Instruments)
* 5 % koncentrační gel a separační gel (14 x 10,5 cm) s gradientem
akrylamidu 7,5 ­ 20,0 %
* dělení proteinů probíhalo ve dvou gelech, každý z nich pro 15 vzorků
* standard (SDS-PAGE Molecular Weight Standard Broad Range,
Bio-Rad; 6,5 - 200 kDa)
* gely byly barveny stříbrem podle Kirkeby et al. (1993)
- videodensitometr GS-670 a software Molecular Analyst (Bio-Rad)
Vyhodnocování gelů:
Profilová analýza:
* kvalitativní:
MW jednotlivých proteinových frakcí hemolymfy
* kvantitativní:
poměr zastoupení jednotlivých proteinových frakcí
mezi samci a samicemi během vývoje
ˇ rozdělené vzorky na polyakrylamidovém gelu
* absorbční křivka (osa x ­ vzdálenost od startu, osa y ­ optická hustota)
* tabulka s určenou molekulovou hmotností frakcí (MW) a plochou píku
Profilová analýza:
Proteinové spektrum hemolymfy
bource morušového (Bombyx mori )
Proteinové spektrum hemolymfy
bource morušového (Bombyx mori )
Bombyx mori (Lepidoptera, Bombycidae)
bulharský monovoltinní hybrid AS x KK
Životní cyklus bource morušového B. mori, upraveno podle Lim et al., 1990.
Bombyx mori ­ samice
S ­ standard; 1. - 9. den V. instaru; PR ­ prepupa 1. den;
Z ­ kukla začátek; S ­ kukla střed; K ­ kukla konec.
Z S K
Proteinové spektrum hemolymfy
zavíječe voskového (Galleria mellonella )
Proteinové spektrum hemolymfy
zavíječe voskového (Galleria mellonella )
Galleria mellonella (Lepidoptera, Pyralidae)
RESULTS
1 2 3 4 5 6 7 8 9 S
ApoLpI 230 - 250 kDa
Storage proteins
72 - 84 kDa
45 kDa
ApoLp III 14 - 18 kDa
Protein Profiles
Fig. 1. Acrylamide gradient gel of proteins extracted from last instar larvae (samples 1-5) and
pupae (samples 6-9) hemolymph of G. mellonella. Samples with increasing concentration of boric
acid: 0.00 ppm (1, 6); 156 ppm (2, 7); 620 ppm (3, 8); 1250 ppm (4, 9) and 2500 ppm (5).
Main protein groups of proteins are described on the left margin as well as 45 kDa protein
fraction according to protein standards (S).
Aktivita lysozymu v hemolymfěAktivita lysozymu v hemolymfě
y = 7,245x + 88,087
0
50
100
150
200
250
300
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
lysozym mg/ml
radiální difúze v agaróze
Reactive oxygen metabolites
detection:
- chemiluminiscence
- spectrophotometry
- NBT test
- cytochrome c reduction
- fluorometry
- DHR 123 staining
- HE staining
- total radical-trapping antioxidative
potential (TRAP)
EntomopatogennEntomopatogenníí hlhlíístovkystovky (EPN)(EPN)
třída: Nematoda (Nematoda)
řád: Háďata (Anguilata)
čeleď: Steinernematidae
Heterorhabditidae
* vyskytují se volně v půdě
* selektivita - výhradně entomopatogenní
* nízké teplotní optimum - do 20°C
* využívají se jako prostředek biologického boje
EntomopatogennEntomopatogenníí hlhlíístovkystovky (EPN)(EPN)
Kultivace hlístovek na náhradním hostiteli:
METODY
1. Přirozená invaze EPN:
- larvy G. mellonella nebo larvy Amphimallon sp., Hoplia sp. + 25 EPN, 10% vlhkost
- inkubace 20 ­ 24 hodin za laboratorní teploty
- celkem bylo použito 70 ks G. mellonella, 23 ks Amphimallon sp. a 23 ks Hoplia sp.
Témata bakalářských a diplomových prací týkajících se
entomopatogenních hlístovek jsou zaměřena na:
* testy patogenicity jednotlivých EPN
* srovnání invaze EPN do hostitele v různých prostředích
* obrana hostitele vůči EPN
* možnosti biologického boje s hmyzími škůdci
Výsledkem jsou:
- bakalářské a diplomové práce
- postery a přednášky na konferencích
- publikace