Stanovení cholesterolu Teorie: cholesterol je sloučenina lipidové povahy, patří mezi steroidy. Přítomen je ve všech živočišných tkáních, v krvi, ve žluči. Je důležitou součástí buněčných membrán. Zdrojem je potrava živočišného původu, ale existuje i endogenní syntéza cholesterolu. V krevní plazmě se vyskytuje volný (cca 30 ­ 40%) nebo v podobě esterů s mastnými kyselinami. Aby mohl být transportován k cílovým místům v organismu, je nutná jeho vazba na bílkoviny, které plní funkci nosičů, potom hovoříme o lipoproteinech. Lipoproteiny jsou částice s komplikovanou stavbou, v centru se nacházejí triacylglyceroly a estery cholesterolu a toto jádro je nepolární, tedy nerozpustné ve vodě. Obal částice je potom tvořen fosfolipidy, neesterifikovaným cholesterolem a apoproteiny. Lipoproteiny vznikají ve střevě a v játrech. Lipoproteiny krevní plasmy tvoří velice heterogenní skupinu, lze je třídit podle několika kritérií. Nejčastěji se používá dělení lipoproteidů v analytické centrifuze podle tzv. hydratované hustoty. Rozlišují se tyto frakce: VLDL (lipoproteiny o velmi nízké hustotě) 0,95 ­ 1,006 g/ml LDL (lipoproteiny o nízké hustotě) 1,019 ­ 1,063 g/ml HDL (lipoproteiny o vysoké hustotě) 1,063 ­ 1,210 g/ml Tzv. ,,dobrý a špatný cholesterol": LDL cholesterol: lipoproteinové částice tohoto typu transportují cholesterol do tkání, obsahují převážně aterogenní (aterosklerózu podporující) typ cholesterolu. HDL cholesterol: tyto lipoproteinové částice obsahují méně cholesterolu a více bílkovin, transportují přebytečný cholesterol z tkání zpět do jater, odkud je vylučován do žluče. Toto je tedy příznivě působící cholesterol. Norma pro celkový cholesterol: 3,87 ­ 5,2 mmol/l Norma pro HDL: 1,25 ­ 2,59 mmol/l Pro posouzení rizika aterosklerózy je nutné komplexní vyšetření celého lipidového profilu krevní plasmy, včetně posouzení rodinné zátěže, životosprávy, stravovacích návyků apod. Jako hrubý orientační znak může sloužit tzv. aterogenní index: Celkový cholesterol / HDL U trénovaných osob: 3,5 Standardní riziko 5,0 Výrazně vyšší riziko vzniku aterosklerózy: 20 Postup stanovení celkového cholesterolu a HDL cholesterolu: Stanovení se provádí se pomocí komerčně dodávaného setu výrobce Pliva Lachema. Chemický princip stanovení: enzymatické stanovení cholesterolu pomocí cholesteroloxidázy a oxidační kopulaci 4-aminoantipyrinu a fenolu peroxidem vodíku, katalyzované peroxidasou. Vlastní stanovení se provádí spektrofotometricky. Pracovní roztok obsahující reakční složky je již připraven Plasmu pro stanovení získáme odběrem kapilární krve z prstu do 4 ks hematokritových kapilár, které jsou už od výrobce zevnitř potaženy heparinem. Konce kapilárek zatavíme a kapilárky centrifugujeme jako při stanovení hematokritu. Poté velmi jemnou kapilárkou stáhneme plasmu ze všech kapilár od jednoho dárce do Eppendorfovy zkumavky. Z tohoto množství plasmy budeme používat: 25 l pro stanovení HDL cholesterolu 2 x 10 l pro stanovení celkového cholesterolu, stanoví se dva paralelní vzorky, pokud není plasmy dostatek, potom pouze jeden vzorek. Stanovení celkového cholesterolu: do označených zkumavek pipetujeme: Blank: 10 l dest. vody + 1 ml pracovního roztoku Vzorek 2 paralelky: 10 l plasmy + 1 ml pracovního roztoku Standard: 10 l standardu (od výrobce) + 1 ml pracovního roztoku Obsah zkumavek protřepeme a inkubujeme při 37°C, inkubační směs nutno chránit před přímým světlem Do 10 minut po skončení inkubace změříme absorbanci vzorku a standardu oproti blanku při 480 nm. Výpočet: celkový cholesterol (mmol/l) = 5,17 . A vzorku / A standardu Stanovení HDL cholesterolu: Nejprve je nutno vysrážet v plazmě chylomikrony, VLDL a LDL lipoproteiny. Postup při srážení: Do Eppendorf, zkumavek napipetujeme 25 l plazmy a 50 l srážecího roztoku. Promícháme a po 10 minutové inkubaci při pokojové teplotě centrifugujeme 2 minuty při 3 000 ot. Pro stanovení HDL použijeme supernatant. Do označených zkumavek pipetujeme: Blank: 50 l dest. vody + 1 ml pracovního roztoku Vzorek: 50 l supernatantu + 1 ml pracovního roztoku Standard: 5 l standardu + 45 l dest. vody + 1 ml pracovního roztok (standard je stejný jako v případě celkového cholesterolu) Obsah zkumavek protřepeme a inkubujeme při 37°C, inkubační směs nutno chránit před přímým světlem Do 10 minut po skončení inkubace změříme absorbanci vzorku a standardu oproti blanku při 480 nm. Výpočet: HDL cholesterol (mmol/l) = 1,537 . A vzorku /A standardu