EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY 2009, RECETOX Test inhibice růstu zelené řasy Raphidocelis subcapitata Úvod Tento růstový test je modifikací OECD 201 (ISO 8692) normovaného růstového testu. Odpověď organismu na danou koncentraci látky je hodnocena ve srovnání s průměrným růstem kontroly. Test byl optimalizován pro provedení v 96ti jamkových mikrotitračních destičkách. Exponovaným organismem je zelená řasa Raphidocelis subcapitata (Syn. Pseudokirchneriella subcapitata, Selenastrum subcapitata), která bude vystavena požadovaným koncentracím dvojchromanu draselného (K2 Cr2 O7 ). Každá testovaná varianta bude provedena v 5 opakováních. Po zahájení a ukončení expozice je nutno změřit absorbanci (680 nm) pomocí spektrofotometru pro každou jamku a variantu. Vyhodnocení je provedeno na základě rozdílu absorbancí na konci testu a na začátku testu (KONEC-START). Materiál a reagencie - Řasová kultura kultivovaná ve standardním médiu ( 50% ZBB médium) o určité absorbanci - Mikrodestičky, automatické pipety, špičky k pipetám, nádoby pro vyředění odpovídajících koncentrací testované látky - Destilovaná voda, nesterilní 50% ZBB médium Průběh experimentu: * Příprava ředící řady: testovanou látku K2 Cr2 O7 vyředíme ze zásobního roztoku o konc 200 mg/L na požadované koncentrace (100, 50, 25, 12.5, 6.25 mg/L) ­5 mikrozkumavek - do první přeneste 200 uL zásobního roztoku a přidejte 200 uL destilované vody do všech 5 mikrozkumavek (vialky popište). Z roztoku o nejvyšší koncentraci 200mg/L přeneste 200 uL do první vialky s vodou a důkladně promíchejte (výsledná koncentrace 100mg/L), stejným způsobem připravte seriovým ředěním nižší koncentrace. * Příprava inokula řas: řasové inokulum vyřeďujeme kultivačním médiem (50% ZBB) na požadovanou hodnotu b/ml a odpovídající objem. Výchozí množství buněk /ml řasového inokula pro založení experimentu je 4*105 (přibližně odpovídající optická hustota v rozmezí 0,03-0,04 při 680 nm). Počty buněk na ml zjistíme pomocí počítání na Bürkerově komůrce. * Počítání na Bürkerově komůrce: Umístění krycího skla-viz obr.2.1, 2.2. Krycí sklíčko by mělo být svorkami uchyceno dostatečně pevně (duhové okraje skla kolem svorek). Ke hraně uchyceného skla přiložíme pipetu obsahující 10 l vzorku a lehce pouštíme-celá počítací plocha by měla být pokryta vzorkem. Samotné počítání probíhá ve čtverci o velikosti 12*12 malých čtverečků (dvojitá čára), nebo 3*3 velkých čtverců (trojité ohraničení) (obr.2.3-1). V našem případě budeme počítat 1 malý čtvereček v každém velkém čtverci (9)-zprůměrujeme a převedeme na plochu 1 velkého čtverce-vynásobením 16 (počet malých čtverců)-dostaneme počet buněk v 0,1 l-násobením 10 000 ­dostaneme počet buněk a 1ml. (POZOR:počítají se pouze buňky uvnitř čtverce nebo hraničící napravo a nahoře (viz obr 2.3-3) EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY 2009, RECETOX Výpočet: (počet buněk (napočítáno)/ 9)*16* 10000)= výsledek počet buněk/ml * Doba expozice: 3 dny * Podmínky expozice: - teplota 23°C - osvětlení 2080 lx (použití klasické halogenové zářivky a zářivky Aqua Glo fialová, 40W) Do jamky napipetujeme 225 l suspenze řas o požadované absorbanci + 25 l testované látky (do kontroly dáme 25 l destilované vody). Testovaná látka je zředěna inokulem řas 1:9 (10x) na námi požadované koncentrace. Schéma mikrodestičky: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A H 2O H 2O H 2O H 2O H 2O H 2O H 2O H 2O B H 2O C1 C2 C3 C4 C5 H 2O H 2O C H 2O C1 C2 C3 C4 C5 H 2O H 2O D H 2O C1 C2 C3 C4 C5 H 2O H 2O E H 2O K K K K K H 2O H 2O F H 2O C1 C2 C3 C4 C5 H 2O H 2O G H 2O C1 C2 C3 C4 C5 H 2O H 2O H H 2O H 2O H 2O H 2O H 2O H 2O H 2O H 2O EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY 2009, RECETOX H 2O destilovaná voda C1 koncentrace dvojchromanu draselného 0.625 mg/L C2 koncentrace dvojchromanu draselného 1.25 mg/L C3 koncentrace dvojchromanu draselného 2.5 mg/L C4 koncentrace dvojchromanu draselného 5 mg/L C5 koncentrace dvojchromanu draselného 10 mg/L * Měření absorbance: Absorbanci měříme při vlnové délce 680 nm. Před každým měřením nutno jednotlivé jamky promíchat pipetou!!!! Získaný soubor (ve formátu MS-Excel) uložte na pevný disk počítače do adresáře "C:/biotesty-cviceni/ pod názvem START-vaše zkratka.xls, kde zkratka je musí být jasná a dobře rozpoznatelná všem osobám ve vaší pracovní skupině. * Mikrodestičku přikryjeme víčkem a exponujeme v inkubační místnosti s řízeným světelným režimem. Vyhodnocení inhibice * Po ukončení expozice spočítáme mikroskopicky (kontrolu a 2 koncentrace dvojchromanu-kolem EC50-odhadneme okem) / změříme absorbanci jednotlivých jamek ve spektrofotometru při vlnové délce 680 nm. Získaný soubor opět uložíme podobně jako předchozí soubor (C:/biotesty-cviceni/ KONEC-zkratka.xls). * Hodnoty absorbance u kontroly zprůměrujeme a následně dosadíme veličiny dle vzorce: AK - Av %I= ----------- * 100 AK AK průměr absorbance kontroly Av průměr absorbance jednotlivých variant koncentrací dvojchromanu draselného * Výpočet IC50: Vyneseme získanou inhibici v % do grafu v excelu. Inhibici, která se pohybuje kolem 50% vyneseme do samostatného grafu (má 2 hodnoty nad a pod 50% inhibicí), proložíme lineární regresní přímkou a dle rovnice regrese odečteme z osy x koncentraci dvojchromanu draselného, ve které došlo k 50% inhibici růstu. EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY 2009, RECETOX Protokol k růstovému biotestu se zelenou řasou R. subcapitata: Jména členů skupiny: Datum založení expozice: Datum hodnocení: -> délka expozice (počet dní): Koncentrace (mg/L) Kontrola (0) 0.625 1.25 2.5 5 10 A680 START (průměr) SMODCH Počet buněk/ml A680 KONEC (průměr) SMODCH Počet buněk/ml % inhibice SMODCH EC 50 (mg/L) Graf: Závěr: