Rostlinné explantáty
(kultury in vitro)
Jaroslava Dubová
Ústav experimentální biologie
Oddělení fyziologie a anatomie rostlin a
Laboratoř molekulární fyziologie rostlin
Přírodovědecká fakulta
Masarykova univerzita
Cyclamen Malus Lilium
Příklady kultur
z katalogu
firmy
Duchefa
Definice termínů
l Explantát (Bauer 1939) je každý fragment živého
pletiva, celý orgán nebo soubor orgánů, který je
vytržen z korelačních vztahů celku a je pěstován
v umělých podmínkách.
Definice termínů
l ex plantare = pěstovat mimo
l in vitro = ve skle, v umělých podmínkách
l aseptická kultura = bez infekce (bakterie,
kvasinky, plísně)
l axenická kultura = kultura jednoho organismu
l tkáňová kultura = historický pojem, přeneseno z
oblasti fyziologie živočichů
houbová infekce v kultuře
z katalogu
firmy
Duchefa
Kultura infikovaná kvasinkami
a bakteriemi
Kultury infikované houbami
Příklady infikovaných
kultur
Úrovně organizace explantátu
l rostlina (klíční rostlina, embryo)
l orgán (kořen, list, řapík, pupen)
l pletivo (dřeňový parenchym,
endosperm, kambium - ,,tkáňové
kultury")
l buňka (mikrospory, pyl. zrna,
buněčné suspenze)
l izolovaný protoplast
kalusová kultura
suspenze buněk vojtěšky rostlinné protoplasty mezofylu
tabáku
mikropropagace jabloně prašníková kultura tabáku
Příklady různých typů kultur
zkumavky, Petriho misky, Erlenmayerovy baňky,
zavařovací lahve, Magenta boxy
Kultivační nádoby
pro kultury in vitro
(sklo i plasty)
média ztužená agarem
laboratorní bioreaktorlaboratorní třepačka
Suspenzní kultury
tekutá média
Systém RITA
dočasně zaplavované kultury
technická
modifikace pro
pěstování
explantátů v
tekutém médiu
www.vitropic.fr
Rostlinné explantáty
l zpočátku obor rostlinné fyziologie odlišující se svou
vlastní metodologií
l v současnosti jsou metodickou základnou rostlinných
biotechnologií
l později četné aplikace v genetice a šlechtitelství
l mají využití i v molekulární biologii ­ jsou součástí
metod množení rostlin, transformace, selekce ...
Využití explantátů
A. Získání teoretických poznatků
q buněčné dělení
q totipotence rostlinné buňky
q diferenciace rostlinné buňky a pletiva
q metabolismus
q regulační mechanismy
q transformace a mutageneze
Využití explantátů
B. Praktické aplikace
q rychlé množení ve velkých kvantech
q urychlování šlechtitelských cyklů
q získávání vzdálených hybridů (,,embryo
rescue", opylení in vitro)
q získávání haploidů a dihaploidů
q ozdravování od virů
q umělá semena
q genové banky, kryoprezervace
Department of Plant Production
Horticulture University
Horticulture, Univ. Gent
Coupure links 653
653 9000 Gent
Belgium
Prof. Dr. Pierre Debergh
Dr. Johan Van Huylenbroeck
Dr. Stefaan Werbrouck
http://users.ugent.be/~pdebergh/content.htm
Department of Botany
University of Natal
Pietermaritzburg
Scottsville
Pietermaritzburg 3209
Republic of South Africa
Prof. Dr. Johannes Van Staden
Dr. Jeff Finnie
Dr. Anna Jäger
cd-ROM bylo vytvořeno jako pomůcka pro studenty pro kurzy
kultur rostlinných buněk a pletiv i biotechnologie.
Podle autorů to není kompletní kurz, ale poskytuje hypertextové
stránky s množstvím obrázků a krátkých textů. 
Zajímavá adresa:
Historický přehled - počátky
l Gottlieb Haberlandt
l * 1854 Altenburg
považovaný za otce kultur
rostlinných explantátů
Kultivoval explantáty:
l parenchym listů
l dřeň stonku
l svěrací buňky průduchů
neznalost výživy, nesterilní kultura,
vysoce diferencované buňky v kultuře
krátkodobé přežívání kultur
přesto Haberlandt věřil v budoucnost kultur in vitro
a formuloval 1902 teorii o totipotenci rostlinné buňky
(Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen)
1922 Knudson - výsevy orchidejí in vitro
1925 Laibach ­ izolovaná embrya lnu (Linum)
Totipotence rostlinné buňky
totipotence diferencovaných
rostlinných buněk byla
předpovězena v roce 1902
Gottliebem Haberlandtem
(1854 ­ 1945)
a v roce 1958 experimentálně
potvrzena Reinertem a Stewardem
somatickou embryogenezí u mrkve
Haberlandtova socha na jeho pomníku v rodišti v Altenburgu
americký rostlinný fyziolog P.R.White
První pravé ,,tkáňové kultury"
První pravé ,,tkáňové kultury"
1935 P.R.White - izolované kořeny rajčat
produkce fytohormonů
 cukry
 vitamíny - B1, B6, kyselina nikotinová
 glycin
 meristem kořenové špičky
1939 Gautheret - kalus mrkve,
Nobecourt - kalus tabáku, White - nádory tabáku
Kalusové kultury
Meristémové kultury
l 1944 - Ernest Ball - regenerace
rostliny z izolovaného meristému
(Lupinus)
l 1949 - Limmaset a Cornuet - rozdílné
koncentrace virových částic v
rostlinných orgánech, meristémy
téměř viruprosté
l 1952 - Morrel a Martin - ozdravování
virózních jiřin (Dahlia)
meriklonové množení
Suspenzní kultury
1958 - Steward, Reinert - tekuté médium, třepané
kultury buněk a buněčných shluků
somatická embryogeneze
Po 100 letech pokusné potvrzení platnosti buněčné
teorie Schleidena a Schwannaa i Haberladtovy
teorie o totipotenci somatických buněk.
kalusy i regenerace rostlin
České začátky používání metodik
rostlinných explantátů
Prof. Zdeněk Sladký, DrSc.
Foto: J. Dubová
Rudolf Řetovský, Eva Petrů ­ AV ČR
Praha
Zdeněk Opatrný ­AV ČR, VÚRVRuzyně
(Výzkumný ústav rostlinné
výroby), UK Praha
Boris Vyskot ­ BFÚ AV ČR Brno
František J. Novák ­ AV ČR
Olomouc, AA Seibersdorf
Jiří Vagera - AV ČR Olomouc
Zdeněk Sladký ­ MU Brno
III. Dny rostlinné fyziologie
VŠZ Praha-Suchdol 1983
J. Vagera
UEB Olomouc
Z. Sladký
MU Brno
O. Erdelská
SAV Bratislava
K. Erdelský
UKom Bratislava
V. Kozinka
SAV Bratislava
T. Murashige Z. Sladký
Olomouc 1984
Foto: M. Griga
F. K. Skoog
objevitel kinetinu
F. K. Skoog
Brno 1985
Regulation of Plant Integrity
Galston
L. Čulafič
Slovenské začátky
rostlinných explantátů
Karol Erdelský ­ UKom
Bratislava
Anna Preťová ­ SAV
Nitra
Eva Čellárová ­ UJPŠ
Košice
Foto: J. Dubová
Aurélie Kamenická Arboretum
Mlyňany
Opylení a oplození in vitro
1960 - indická škola: Kanta, Maheshwari, Rangaswami
různé metody aplikace pylu na explantát
1965 - polská škola: Zenkteler
1965 - české pokusy:
Tupý, Balatková (ČSAV Praha), Sladký (MU Brno)
P. Maheshwari
Představitel indické
školy experimentální
embryologie
1966 prašníkové kultury
a odvození haploidních
rostlin (Datura)
Profesor Maciej Zenkteler
Univerzita A. Mickiewicza
Poznaň, Polsko
Foto: J. Dubová
Experimentální embryologie,
opylování in vitro
Smolenice 2001 ­ s prof. M. Zenktelerem
z exkurze na X. embryologické konferenci Nitra 2001
M. Griga
Prašníkové kultury
manipulace se stupněm ploidie:
1. regenerace haploidních rostlin
z mikrospor nebo pylových zrn:
prašníkové nebo mikrosporové kultury
2. zdvojení haploidního genomu regenerantů
= dihaploidizace
získání homozygotního materiálu v kratší době
Rostlinné protoplasty
1970 - Takebe a Nagata - regenerace rostlinek
tabáku z izolovaných protoplastů
Rostlinné protoplasty
l Carlson
l Butěnko, Gleba
l Dudits
l Potrykus
l Coocking
fůze protoplastů - somatická hybridizace - cybridy
Transformace rostlinného genomu
1974 - důkaz integrace Ti plasmidu do rostlinného
genomu
1984 - přímý přenos DNA do rostlinného protoplastu
(mikro-injekce)
1986 - přímý přenos DNA do rostlinných buněk
Geneticky modifikované organismy = GMO
,,Biotrend" BIOTRIN
je česká nezisková organizace
vytvořená vědeckými pracovníky pro šíření
informací o moderních biotechnologiích
http://www.biotrin.cz/
informace nejen o českých biotechnologiích
http://www.gate2biotech.cz/
Zajímavé webové adresy
http://users.ugent.be/~pdebergh/ind/content.htm
Přehledné a názorné výukové stránky
http://www.liv.ac.uk/~sd21/tisscult/case_study_3.htm
ukázka didaktiky rostlinných explantátů
http://www.home.turbonet.com/kitchenculture/begin.htm
jednoduché postupy
Doporučená literatura
l DROBNÍK, J. et ŠTĚPÁNKOVÁ, H. /eds./ (1997):
Harmonizace pravidel práce v biologii a chemii. I.
Bezpečnost biotechnologií. Series in Natural
History, 6, PERES, Praha. (Skriptum UK).
l ONDŘEJ, M. (1985): Cytogenetika a molekulární
genetika rostlin. - Academia, Praha.
l ONDŘEJ, M. (1992): Genové inženýrství kulturních
rostlin.- Academia, Praha.
Doporučená literatura
l GAMBORG, O. L. et PHILLIPS, G. C. (1995):
Plant cell, tissue and organ culture.
Fundamental methods, Springer Berlin.
Heidelberg.
l PIERIK, R.L.M. (1987): In vitro culture of
higher plants. - Martinus Nijhoff Publishers,
Dordrecht, Boston, Lancaster.
l REINERT, J. et BAJAJ, Y.P.S./eds./ (1977 ):
Applied and fundamental aspects of plant cell,
tissue and organ culture.- Springer Verlag, Berlin,
Heidelberg, New York.
Doporučená literatura - skripta
l KOVÁČ, J. (1992): Explantátové kultury rostlin. Ústí
n. Labem (Skriptum UJEP).
l VOTRUBA, M. et al. (1987): Explantátové techniky
(pro biotechnology a šlechtitele).- Praha (Skriptum
VŠZ Praha).
l ŠEBÁNEK, J. et SLADKÝ, Z. (1988): Biotechnologie
rostlinných explantátů.- Brno (Skriptum VŠZ). (nyní
MZLU)
Časopisy
Plant Cell, Tissue and Organ Culture
Springer Netherlands
Plant Cell Reports
Springer Berlin / Heidelberg
Adresa stránek kurzu (v úpravě)
Bi6120 Rostlinné explantáty
http://www.sci.muni.cz/explantaty/
Od rostlinné kultury ,,in vitro" k biotechnologiím
J. Dubová, A. Smíšková
http://svp.muni.cz/mapa-webu.php
Školní vzdělávací programy MU
3. Střední školy,
3.3. Člověk a příroda,
3.3.3. Biologie