Masarykova univerzita v Brně Přírodovědecká fakulta Učební text Molekulární fyziologie genomu Katedra fyziologie živočichů RNDr. Eva Bártová, Ph.D. Biofyzikálni ústav Akademie věd České republiky, v.v.i. Laboratoř molekulární cytologie a cytometric Brno 2009 Genom je sbírkou přesně organizovaných smyček. strana Obsah Zkratky........................................................................................................................... 4 1. Úvod............................................................................................................................ 5 1.1. Základní poznatky o struktuře genomu.............................................................. 5 2. Struktura a funkce chromatinu............................................................................... 8 2.1. Historie studia organizace chromozómů a dalších jaderných kompartmentu........ 8 2.2. Uspořádání chromatinu a dynamická architektura buněčného jádra..................... 11 2.3. Změny chromatinu ve vztahu k reparaci DNA...................................................... 22 2.4. Vybrané jaderné kompartmenty, které se podílí na regulaci transkripce a post-transkripčních úpravách................................................................................ 24 2.5. Změna ve struktuře chromatinu během buněčné diferenciace a apoptózy.......... 27 2.6. Epigenetické charakteristiky genomu................................................................... 31 2.7. Vliv proteinů intermediálních filament na strukturu genomu a epigenomu......... 37 2.8. Struktura chromatinu nádorových buněk.............................................................. 40 2.9. Kvantitativní analýza struktur buněčného jádra.................................................... 42 3. Metodická část.......................................................................................................... 45 3.1. Kultivace a diferenciace buněk............................................................................. 45 3.2. Imunofluorescenční značení interfázních jader.................................................... 46 3.3. Izolace DNA z BAC/PAC klonů a "nick" translace.............................................. 47 3.4. Fluorescenční in situ hybridizace (FISH).............................................................. 47 3.5. RNA-FISH............................................................................................................. 48 3.6. Analýzy pomocí western blotů............................................................................... 50 3.7. Průtoková cytometrie............................................................................................. 50 3.8. Analýza a zpracování obrazu................................................................................. 51 3.9. Izolace RNA a RT-PCR......................................................................................... 52 3.10. Konvenční chromatinová imunoprecipitace (ChlP).............................................. 52 3.11. "ChIP-on-chip" analýza......................................................................................... 53 4. Závěr.......................................................................................................................... 54 5. Seznam použité literatury........................................................................................ 55 Zkratky APL: Akutní promyelocytická leukémie Aza-dC: 5-aza-2'-deoxycytidin bFGF: "basic Fibroblast Growth Factor", růstový faktor pro fibroblasty 53BP1: vazebný protein 1 pro p53 nádorový supresor CTs: Chromozomální teritoria CENP-A: Varianta histonu H3 v centromerických oblastech DEPC: Diethylpyrokarbonát DMSO: Dimethylsulfoxid Dnmts: DNA methyltrasferázy DSBs: "Double strand breaks", dvouřetězcové zlomy FISH: Fluorescenční in situ hybridizace FITC: Fluorescein isothiokyanát GFP: "Green Fluorescein Protein", zelený fluorescenční protein H3K9 (K4, K27, K36, K79): Histon H3 a jeho specifické modifikace na lysinech (K) H3S10: Histon H3 a jeho specifická modifikace na serinu (S) v pozici 10 HAT: Histonové acetyltransferázy HD AC s: Histonové deacetylázy HDACi: Inhibitory histonových deacetyláz hESCs: "human Embryonic Stem Cells", lidské embryonální kmenové buňky HMTs: Histonové methyltrasferázy HGPS: Hutchinson-Gilford Progeria Syndrom HP1: Heterochromatinový protein 1 HSA: "Homo Sapiens autosome", obecně chromozomální teritorium lidských autozómu HSRs: Homogenně značená oblast ICD (IC): Interchromozomální kompartment LAPs: "Lamin Associated Polypeptides", polypeptidy jejichž funkce je spojená s laminy LCR: "Locus Control Region", DNA oblast ovlivňující lokusy z hlediska jejich transkripce LIF: "Leukemia Inhibitory Factor", leukemický inhibiční faktor mel; me2; me3: monomethylace, dimethylace, trimethylace Me: Methylace DNA MeCP: Methyl CpG vazebný protein MEF: Myší embryonální fibroblasty MM: Mnohočetný myelom NaBt: "Sodium butyrate", butyrát sodný PBS: Fosfátový pufir PcG: "Polycomb group" proteiny PML: Promyelocytická leukemická tělíska PMA:Phorbol-12-myristát-13-acetát Pol II (RNAPII): Polymeráza II Rb 1: Retinoblastomový protein 1 RA: "all-trans retinoic acid", kyselina retinová RIDGE: "Regions of Increased Gene Expression", oblast se zvýšenou expresí genů SAGE: "Serial Analysis of Gene Expression", několikanásobná analýza exprese genů SC-35: "Nuclear speckles", jaderné skvrny SUMO: sumoylace TEM: Transmisní elektronový mikroskop TSA: Trichostatin A Xi: Inaktivní X chromozóm Xic: X inaktivační centrum 4 1. Úvod 1.1. Základní poznatky o struktuře genomu I přes fakt, že primární struktura genomu řady organismů byla kompletně zmapována, jen málo je známo o prostorovém uspořádání chromatinu v kontextu jaderných procesů jako je replikace, transkripce, sestřih a DNA reparace. Velkým pokrokem ve studiu struktury chromatinu byl objev fluorescenční in situ hybridizace (Pinkel et al., 1988; Lichter et al., 1988; 1990), která v kombinaci s immunofluorescencí a konfokální mikroskopií umožňuje vizualizaci chromozomálních teritorií, jejich jednotlivých domén i proteinů asociovaných s chromatinem. Pomocí zmíněných technik je možné získat reprodukovatelné výsledky, které charakterizují uspořádání chromozómů v rámci interfázních jader, jadernou strukturu transkripčně aktivních i neaktivních lokusů nebo distribuci zajímavých proteinů v buňkách. Zásadním poznatkem v biologii chromatinu je popis interfázních chromozomálních teritorií a formulování funkčního modelu uspořádání interfázních jader (shrnuto v Crem er a Cremer 2001; Lanctôt et al., 2007). Bylo zjištěno, že interfázní chromozómy tvoří vzájemně se nepřekrývající teritoria (CTs), mezi kterými se nachází takzvaný interchromatinový kompartment (IC), jehož funkce je důležitá z hlediska transportu regulačních molekul k cílovým místům DNA (Crem er a Crem er 2001; Lanctôt et al., 2007). Nedávno byl však popsán autory Branco a Pombo (2006) kontroverzní model, který připouští vzájemný překryv teritorií chromozómů, což je velice pravděpodobné především z hlediska případných translokací chromozomálních domén. Navíc, lokální uspořádání chromatinu, jeho epigenetické modifikace a transkripce genů pravděpodobně ovlivňují míru interakce mezi jednotlivými chromozomálními teritorii (Branco a Pombo 2006). Dalším velice zásadním kritériem hodnocení uspořádání chromozómů je jejich radiální poloha v rámci interfázních jader. Významný přínos v této oblasti přinesla lisabonská skupina, která jako první publikovala výsledky o specifickém radiálním uspořádání genů v interfázním jádře (Parreira et al., 1997; Nevěs et al., 1999). Výsledky experimentů této skupiny významně korelují s pracemi Kozubek et al. (1997) a Kozubek et al. (2002). Navíc, analýza radiálních poloh všech lidských chromozómů byla publikována současně v článcích Bártová et al. (2001) a Boyle et al. (2001). Ukázalo se, že radiální uspořádání chromozómů souvisí s genovou hustotou (Boyle et al., 2001) nebo 5 genovou expresí (Croft et al., 1999; Kozubek et al., 2002). Jako velice zajímavé se rovněž jeví změny v uspořádání chrom ozomálních domén během buněčné diferenciace. Z tohoto důvodu jsme se v rámci naší experimentální skupiny začali zabývat aspekty týkající se diferenciačné závislých změn na úrovni chromatinu (Bártová et al., 2000a, 2000b, 2002; Galiová et al., 2004, Harničarová et al., 2006 and Bártová et al., 2008a). Dalším velice významným fenoménem struktury chromatinu je objev transkripčně aktivních genů, které jsou lokalizovány na chromatinových smyčkách vybíhajících mimo vlastní kompaktní chromozomální teritorium (Volpi et al., 2000; Mahy et al., 2002; Williams et al., 2002). Zmíněný jev byl pozorován převážně u genů zodpovědných za pluripotenci embryonálních kmenových buněk a nebo u ontogeneticky významných lokusů. K těmto lokusům patří například gen Oct3/4 nebo skupina Hox genů (Chambeyron et al., 2004; Wiblin et al., 2005; Bártová et al., 2008a). Na základě popsaných výsledů však není úplně jasné, zda uspořádání chrom ozomálních teritorií je příčinou nebo následkem transkripčních procesů (Chubb et al., 2003). Určité snahy o objasnění podstaty vztahu mezi strukturou chromatinu a genovou expresí byly naznačeny v práci Kurz et al. (1996). Zde bylo zjištěno, že kódující sekvence se preferenčně vyskytují na periferii příslušného chromozomálního teritoria, zatímco anonymní DNA fragment byl umístěn náhodně v rámci daného chromozómu. Stejně tak transkripčně aktivní ANT2 (Xq24-q25) a ANT3 geny (Xp22.3) byly umístěny na periferii relevantního teritoria, v porovnání s transkripčně neaktivním lokusem ANT2 (Dietzel et al., 1999). Navíc bylo pozorováno, že oblasti se zvýšeným obsahem GC párů baží mají větší variabilitu v rámci chromozomálního teritoria než AT bohatá místa (Tajbakhsh et al., 2000). Periferní lokalizace transkripčně aktivního genu c-myc v rámci daného chromozomálního teritoria byla pozorována i v našich experimentech (Harničarová et al., 2006). Navíc jsme zjistili, že radiální distribuce c-myc transkripčních míst není ovlivněná diferenciačními procesy a transkripce a post-transkripční úpravy probíhají v centrálních částech interfázních jader (Harničarová et al., 2006). V případě ontogeneticky důležitých genů, jako je ß-globinovy klastr nebo gen Oct3/4, jsme pozorovali umístění těchto lokusů na chromatinových smyčkách, které opět vybíhali mimo vlastní teritorium daného chromozómu (Galiová et al., 2004; Bártová et al., 2008a). Na druhou stranu existují však práce, které ukazují na možnost transportu transkripčních faktorů do vnitřních částí chromozomálního teritoria, což ukazuje na fenomén takzvané 6 "invaginace" interchromatinových kanálů do nitra interfázních chromozómů (Verschure et al., 1999 a Mahy et al., 2002). Pohled na vzájemné interakce mezi expresí genů a určitým strukturálním seskupením ovlivnila i práce Schübeier et al. (2001), v níž bylo zjištěno, že umlčení genové exprese muže být zprostředkováno přiblížením lokusů k robustním oblastem heterochromatinu, jako jsou například centromery. Tento typ umlčení genové exprese, připomínající poziční PEV ("Position Effect Variegation") efekt u Drosophily melanogaster, je pravděpodobně spojený s deacetylací histonů v daném lokusu. Vliv centromerického heterochromatinu na transkripční aktivitu genů byl rovněž ověřen v práci Bártová et al. (2002), která se zabývá hledáním zákonitostí mezi strukturou a funkcí genomu u leukemických buněk stimulovaných k my el oi dní diferenciaci. V tomto případě bylo zjištěno, že centromerický heterochromatin a X chromozóm významně ovlivňují heterochromatinizaci a transkripční inaktivaci vybraných lokusů. Z hlediska regulace transkripční aktivity genů a formování euchromatinu a heterochromatinu se do popředí zájmu rovněž dostávají studie řešící problematiku epigenetických modifikací jak DNA, tak histonů (Rice a Allis 2001; Lachner a Jenuwein 2002; Lachner et al., 2003; Martin a Zhang 2005; Jenuwein 2006; Kouzarides 2007). Na základě principů modelů kompartmentalizace intefázních jader několik strukturálních studií směřovalo k poznání jaderného uspořádání specificky modifikovaných histonů (Cremer et al., 2004; Zinner et al., 2006; 2007; Skalníkova et al., 2007). Bylo zjištěno, že histonový kód významně ovlivňuje a neboje alespoň asociován s kompartmentalizací genomu do odlišných euchromatinových a heterochromatinových domén. Základní principy kompartmentalizace je možné pozorovat i v interfázních distribucích epigenetických modifikací chromatinu. Významné experimenty byly v tomto směru udělány vídeňskou skupinou profesora Thomase Jenuweina, která kromě jiného zjistila, že H3K9 dimethylace (me2) představuj e významný epigenetický znak centromerického heterochromatinu (Lachner at al., 2003), zatímco H3K27 trimethylace (me3) se uplatňuje v procesech inaktivace chromozómu X (Kohlmaier et al., 2004). Významné změny v epigenomu byly rovněž pozorovány po působení inhibitorů histonových deacetyláz (HDACi) (Taddei et al., 2001; Gilchrist et al., 2004; Bártová et al., 2005a; 2007). Zjistilo se, že histony umístěné na jaderné periferii jsou vystaveny větším změnám v epigenetických profilech než histony umístěné ve vnitřní části interfázních jader (Taddei et al., 2001; Bártová et al., 2005a). 7 Rovněž zásah do epigenomu pomocí HDACi ovlivňuje jaderné uspořádání klastrů centromer (chromocentra popsaná v Alcobia et al., 2000; 2003) a jejich asociaci s hlavním heterochromatickým proteinem 1 (HP1) (Taddei et al., 2001; Bártová et al., 2005a; 2007). Snahou experimentů, jejichž výsledky jsou uvedeny v dalších odstavcích bylo proniknout do biologie chromatinu, která se významně mění během jaderných a následně i buněčných procesů. Hledání asociací mezi strukturou chromatinu, epigenetickými modifikacemi hi stonů a transkripční aktivitou diferenciačné významných genů se rovněž zabývala autorka této práce a výsledky jsou uvedeny a diskutovány v dalších kapitolách a přiložených publikacích. 2. Struktura a funkce chromatinu. 2.1. Historie studia organizace chromozómů a dalších jaderných kompartmentů Buněčné jádro bylo popsáno před více než 150 lety, přesto studium jeho struktury je v popředí zájmu mnoha renomovaných biologických laboratoří i v současnosti. Buněčné jádro představuje vysoce organizovanou strukturu, jejíž jednotlivé složky začaly být studovány již během 19. století. K prvním autorů, kteří se zabývali touto problematikou, patří Matthias Schieiden (1804-1881) a Theodor Schwan (1810-1882), kteří popsali buněčné jádro jako strukturu skládající se ze směsi prvků jako je dusík, uhlík, fosfor a směs různých minerálů a nutričních komponent. V té době byla buněčná biologie otázkou filozofických pohledů na život a živé systémy. Schleiden jako první poskytl důkaz o buněčném dělení na modelu kvasinek, čili spontánní de novo obnovení buněčných organel. Teorie spontánního množení mikroorganismů byla nahrazena novou teorií Luise Pasteura (1822-1892) o množení mikroorganismů zodpovědných za infekční choroby. Práce Pasteura byly jako první založeny na koncepci vědeckých důkazů, na rozdíl od předešlých teorií, většinou vytvořených na základě odhadů a dedukcí. Je třeba si uvědomit, že všechny zmíněné teorie o spontánním dělení , tzv. "generatio spontanea" z 19. století přispěly k odhalení významu chromozómů jako nositelů dědičné informace. První teorie o dědičné podstatě chromozómů byla vytvořena v roce 1880 a společně s Darwinovou evoluční teorií přestavovala nejvýznamnější zlom v chápání podstaty lidského života. V roce 1873 8 Friedrich Anton Schneider (1831-1890) udělal zajímavé zjištění, že během buněčného dělení jádro podléhá několika specifickým změnám, které byly popsány jako nepřímé buněčné dělení, čili mitóza. V roce 1882 Walter Flemming (1843-1906) popsal ve své knize "Buněčná hmota, jádro a buněčné dělení" přesný model dělení buněk a to z mnoha aspektů. Flemming jako první použil termín chromatin a mitóza a dále pozoroval, že mitotické chromozómy se během buněčného dělení rozkládají do dvou polovin. Flemming však nedokázal vysvětlit přesný význam tohoto jevu. V roce 1888 Wilhelm Waldeyer (1836-1921) definitivně označil chromatinová vlákna za chromozómy. O dva roky později, Emil Heuser (1851-1928) publikoval, že chromatidy každého chromozómu se přesně oddělují na opačné póly jádra. Během 80. let 19. století August Weismann (1834-1914) jako první navrhl chromozomální teorii dědičnosti. Weismann rozlišoval mezi ideální a skutečnou teorií, to je teoriemi, které poskytují nejenom formální pohled na význam chromozómů v jádře, ale objasňují i její funkční důsledky. Weismann uvažoval, že dědičný materiál je umístěn právě v jednotlivých chromozómech, avšak v čase, kdy publikoval svou teorii dědičnosti (Weisman 1892a; 1892b), neznal práci J. G. Mendela (1822-1884), který v roce 1856 zahájil své experimenty s křížením rostlin. Mendel považoval proměnlivost rostlin za doloženou skutečnost. Byl první, kdo udělal významný diagnostický převrat, kdy nehodnotil organismus jako celek, ale rozložil ho na jednotlivé znaky. Jednotlivé znaky, chápal protikladne, jako dvě strany jedné mince. Hodnotil přenos genetických znaků jako přenos vloh. V představách Mendela se u potomka projevily vlohy pro jednotlivé znaky mateřské a otcovské rostliny. Mendelova diagnostická metoda, pravděpodobně předchůdce dnešní biostatistiky, umožnila vyhodnocení výsledků sedmi párů znaků, vypozorovaných při křížení hrachu. Hodnocení bylo založeno na principu dominance a recesivity protikladných parametrů. Mendelovým segregačním poměrům však neodpovídala Weissmanova teorie dědičnosti, která nepředpokládala, že ztráta chromozómů by mohla mít velký letální vliv na vývoj organizmu, což bylo objasněno až později. První teorie, určující uspořádání chromozómů v interfázních jádrech vytvořili Carl Rabi (1858-1917) a Theodor Boveri (1862-1915). Rabi předpokládal existenci přesného počtu chromozómů v buněčných jádrech. Druhým předpokladem byla přesná konformace chromozómů v mitotických buňkách. Povšiml si, že chromozómy j sou přesně polarizovány 9 na začátku i na konci mitotického dělení. Zjistil, že jisté chromozomální oblasti se dotýkají mitotických vřetének a klastrují na jedné straně jádra, zatímco druhé konce chromozómů se natahují na opačný pól buněčného jádra. Primární konstrikce chromozómů, centromery, nebyly však Rablem definovány. Další jeho významná teorie se opět týkala chromozómů, jejichž struktura je stabilní během vytvoření jaderné matrix a trvá během interfáze. Navíc, chromozómy vytvářejí určité domény, které jsou důležité z hlediska jejich polarizace během jednotlivých stádií mitózy. Rabi předpokládal, že interfázní struktury chromozómů se skládají z primárních vláken, které dále vytváří sekundární a terciální uspořádání, což vede k vytvoření chromatinové sítě, která se rozpíná celým buněčným jádrem. Rablovy teorie přesného počtu chromozómů a jejich konzervativní uspořádání v interfázních jádrech se z dnešního pohledu jeví velmi pokrokové, avšak Rabi nepředpokládal, že každý chromozóm má svou jedinečnou funkci v dědičnosti, kterou nesdílí s jiným typem chromozómu. Velké obohacení Rablových teorií přinesla pozorování Theodora Boveri (1862-1915), který poskytl důkaz o individualitě jednotlivých chromozómů. V jeho práci se poprvé objevuje termín chromozomální teritoria, jejichž význam z hlediska regulace buněčných funkcí je v popředí zájmu i současných laboratoří, které se zabývají studiem struktury a funkce chromatinu. V moderní terminologii se za chromozomální teritoria považují interfázní protějšky mitotických chromozómů. Novodobá cytogenetika vychází z teorií Boveriho a Suttona (Walter a Sutton 1877-1916), kteří propojili své názory s významnými poznatky Johana Gregora Mendela, j ehož teorie dědičnosti významně poukazuj e na to, že chromozómy j sou základními nositeli dědičné informace a tudíž Mendel ovy a Boveri-Sutonovy teorie j sou základním stavebním kamenem obecné genetiky a rovněž dědičné molekulární architektury buněčného jádra (Cremer et al., 2006). Teorie Boveriho a Suttona vysvětlila nejenom Mendelovy zákony v cytologických termínech, ale rovněž poskytla důkaz, že dědičné znaky, lokalizované na daném chromozómu, se mohou přenášet během mitózy do dceřinných buněk, což argumentuje proti možnosti přirozené výměny jednotlivých segmentů mezi homologními chromozómy (Boveri 1904). Boveri a Sutton prohlašovali, že se chromozómy odlišují v haploidním stavu obsahem dědičných elementů. Navíc, Sutton zdůraznil rozdíly v morfologii chromozómů a v jejich chování během mitózy. Předpoklad, že morfologický rozdíl mezi jednotlivými chromozómy hraje důležitou úlohu ve vývoji samčího a samičího plodu byl popsán Henkingem v roce 1891. Na základě těchto pozorování Boveri 10 ve svých teorií shrnuje, že přesný počet chromozómů je důležitý pro optimální ontogenetický vývoj a přesná kompozice individuálních chromozómů je nepostradatelná. Tyto zákonitosti byly předpovídány ve Weismannově chromozomální teorii dědičnosti, ale jeden z nejlepších konceptů té doby byl poskytnut pouze Boverim v jeho "Teorii chromozomální jedinečnosti". Velkým převratem ve zmíněných teoriích byl objev nukleových kyselin v buněčném jádře (Kossel 1882; Miescher 1897; Watson a Crick 1953). Molekula DNA jako taková byla objevena v roce 1869, kdy se švýcarskému lékaři Miescherovi podařilo izolovat DNA z bílých krvinek. Nedařilo se však vytvořit dostatečně čistý vzorek na to, aby DNA mohla být dále zkoumána. Objev dvoušroubovicové struktury DNA se datuje do roku 1952, kdy o rok později James Watson a Francis Crick publikují závěry své práce. Všechny tyto objevy a zákonitosti postavily základní stavební kameny dnešních teorií struktury chromatinu, především konceptu uspořádání interfázních chromozomálních teritorií, který byly vytvořen později na základě analýz pomocí elektronové a konfokální mikroskopie (shrnuto v Crem er a Cremer 2001; Lanctôt et al., 2007; Misteli et al., 2004; Branco a Pombo 2006). 2.2. Uspořádání chromatinu a dynamická architektura buněčného jádra Za hlavní součást buněčného jádra j e považována DNA, která společně s hi stony tvoří komplex nazývající se chromatin. Základní stavební jednotkou chromatinu je nukleozóm, který je tvořen oktamerem histonů (H2A, H2B, H3 a H4) a je ovinutý DNA, přibližně o velikosti 147 bp. Histony nukleozómu mohou být specificky epigeneticky modifikovány a typ modifikace, jako je acetylace, methylace, ubiquitinace a fosforylace histonů a methylace DNA, významně ovlivňuje vytváření různých chromatinových domén (Jenuwein 2006; Kouzarides 2007, Obr. 1). Zmíněné modifikace tvoří takzvaný histonový kód, který se uplatňuje v regulaci funkcí chromatinu, jako je transkripce nebo DNA reparace (Kouzarides 2007). Šířka nukleozómu je uváděna v rozmezí 10-11 nm a mezi jednotlivými nukleozómy se vyskytuje takzvaná "linkerová" oblast o velikosti 20 až 100 bp. Výše organizovanou strukturou chromatinu je komplex nukleozómu, které se stáčí do 30nm vlákna tak, aby byla následně vytvořena další struktura chromatinu, kterou představují 60-130nm vlákna chromonem. Za nejvíce organizovanou strukturu chromatinu j sou považovány metafázní 11 DNA 30 nm -T Methylace DNA a epigenetické modifikace histonú Obrázek 1 Příklad organizace chromatinu. Převzato z http://www.actrec.gov.in/pi-webpages/ SanjayGupta/index.htm. DNA může být specificky methylována v oblasti CpG ostrůvků a volné konce histonů mohou být epigeneticky modifikovány; vyskytují se zde především acetylace, fosforylace, methylace a ubiquitinace histonů. chromozómy a interfázní chromozomální teritoria (Obr. 1 a 2) (shrnuto v Adkins et al., 2004; Gilbert et al., 2005). Z hlediska uspořádání chromatinu byly navrženy různé modely, kdy k nejčastěji zmiňovaným modelům patří takzvaný solenoid o velikosti 30 nm, jehož struktura byla publikována na základě studií pomocí elektronového mikroskopu (Finch a Klug 1976). S využitím elektronové tomografie bylo zjištěno, že chromatin u živých buněk tvoří tak zvaný "zig-zag" model (Horowitz et al., 1994; Rydberg et al., 1998), ve kterém byly navíc popsány různé úrovně stáčení chromatinových vláken, například do struktur o průměru 700 nm nebo 1400 nm v případě chromatid metafázních chromozómů (shrnuto v Adkins et al. 2004; Gilbert at al., 2005). Důležitou vlastností chromatinu je jeho specifické uspořádání v rámci interfázních jader. Nápadným rysem jaderné architektury je existence odlišných strukturálních a funkčních kompartmentů. Základní model jaderné architektury popisuje formování jednotlivých 12 chromozómů do chromozomálních teritorií, které jsou od sebe odděleny interchromatinovým kompartmentem, což je soustava kanálů nezbytných pro transport regulačních molekul k cílovým místům DNA. Podle modelu chromozomálních teritorií - interchromatinového kompartmentu(CT-ICmodel)je vzájemný překryv teritorií omezený (Lanctôt et al, 2007; Obr 2). Nuclear Interchromatin speckle compartment Obrázek 2 Příklad kompartmentalizace chromozomálních teritorií a interchromatinového prostoru. Na obrázku j e dále znázorněno umístění různých jaderných struktur, domén a tělísek, jako například promyelocytická leukemická tělíska (PML bodies), Cajalovo tělísko, jaderné skvrny a další. Převzato z publikace Lanctôt et al. (2007). 13 Obrázek 3 Ilustrativní obrázek umístění vybraných struktur v interfázním jádrě. Na obrázku jsou znázorněny jaderné skvrny (SC35), jadérka, c-myc gen, c-myc transkript, c-MYC protein, PML tělíska a distribuce laminu B. Na druhou stranu vzájemné prolínání ("intermingling") chromozomálních teritorií a přítomnost "transkripčních továren" v oblasti překrytí chromozómů byly publikovány autory Branco a Pombo (2006). Podle těchto autorů, interakce mezi jednotlivými chromozómy je asociována s transkripční aktivitou, což ukazuje na fakt, že exprese genů a lokální konformace chromatinu určují míru interakce mezi jednotlivými chromozomálními teritorii. Vzájemný vztah mezi chromozómy může být buněčně specifický a muže ovlivňovat stabilitu genomu, především s ohledem na možné translokace chromozomálních domén (Branco a Pombo 2006). Kompartmentalizace chromozomálních teritorií je zachována u různých buněčných typů, nádorových buněk i během buněčné diferenciace. K náhodné fragmentaci chromozomálních teritorií a k jejich rozpadu dochází až v rané fázi indukce programované buněčné smrti apoptózou (Bártová et al, 2003a). Kromě kompartmentu chromozomálních teritorií, byly v rámci interfázních jader charakterizovány i významné struktury jako je jaderná lamina, jadérka, promyelocytická leukemická (PML) tělíska, Cajalova tělíska nebo jaderné skvrny, takzvané SC35 domény obsahující faktory sestřihu (viz. ilustrativní Obr. 3). Většina těchto strukturálních komponent obsahuje faktory, které jsou důležité z hlediska regulace jaderných procesů jako je replikace, transkripce, sestřih a DNA reparace. Bylo například zjištěno, že replikace probíhá v takzvaných "replikačních ohniscích," stejně jako transkripce v "transkripčních továrnách" (Osborne et al., 2004). Transkripční továrny (Obr. 4) jsou místem koncentrace RNA polymerázy II (RNAP II), která je zodpovědná 14 Obrázek 4. Příklad lokalizace traskripčních továren, cis- a trans-inter akcí a umístění jaderných skvrn v interchromatinovém prostoru. Cis- a trans-iterakce představují vliv genetických elementů (enhancery, LCR - "Locus Control Region ") a specifických proteinů na transkripci. Převzato z publikace Fräser a Bickmore (2007). za přepis mRNA genů. V práci Osborne et al. (2004) bylo publikováno, že transkripčně aktivní geny z různých chromozomálních teritorií sdílí shodnou "transkripční továrnu", ve které se vyskytují ve formě vysoce dekondenzovaného chromatinu (Obr. 4). Během post-transkripčních úprav bylo zjištěno, že se faktory sestřihu rovněž koncentrují do specifických domén, takzvaných jaderných skvrn ("nuclear speckles"). Regulace transkripce a post-transkripční úpravy jsou pravděpodobně rovněž zprostředkovány faktory, které jsou obsaženy v PML tělíscích, jejichž význam byl studován v procesu DNA reparace. Neméně významné se z hlediska jaderných funkcí jeví právě "reparační ohniska" (Soutoglou et al., 2007; Soutoglou a Misteli 2007), které obsahují řadu reparačně důležitých proteinů. V devadesátých letech minulého století skupina vedená P. Lichterem navrhla model interchromozomálních domén (ICD). Původní verze tohoto modelu naznačuje, že chromozomální teritoria (CTs) tvoří hladké struktury, které jsou od sebe odděleny interchromozomální domémou (ICD). Tato první teorie však neodpovídá možnosti lokalizace aktivních genů na periferii CTs tak, jak to bylo pozorováno v experimentech Kurz et al. (1996) nebo Bártová et al. (2002). 15 Umístění genů na samém okraji chromozomálních teritorií pravděpodobně umožňuje funkční interakci těchto genů s faktory obsaženými v transkripčních továrnách nebo jaderných skvrnách. V dalších studiích však bylo navrženo, že chromozomální teritoria jsou určitým způsobem strukturována, a tudíž transkripčně aktivní geny mohou být rovněž pozorovány ve vnitřních částech těchto teritorií (Verschure et al., 1999). Na základě zmíněných pozorování byl navržen takzvaný CT-IC model, který popisuje teritoria chromozómů jako strukturu s řadou invaginací tak, že IC kompartment zasahuje i do nitra teritorií interfázních chromozómů a tím zprostředkovává jejich kontakt s jadernou membránou (Cremer et al., 2006). Uspořádání chromatinu v jednotlivých teritoriích řeší řada modelů, z nichž jedním je takzvaný "Multiple Loop Model" (MLM) (Münkel et al., 1999), ve kterém série domén o velikosti chromatinových smyček kolem 100 bp tvoří rozety o velikosti 1 Mbp. Sousední 1 Mbp chromatinové domény jsou spojeny spojovacím chromatinem. Další názor na uspořádání chromatinu je představován "Giant Loop" modely, kdy prvním z těchto modelů byl "Random Walk/Giant Loop" (RW/GL) model, popsaný Sachsem v roce 1995. U tohoto modelu má každá chromatinová smyčka (GL) velikost několika Mb DNA a je oddělena od druhé GL v tom samém chromozomálním teritoriu pomocí 200 kbp spojovací DNA (Sachs et al., 1995). Ovlivnění velikosti GL a spojovací oblasti mezi nukleozómy determinuje úroveň kondenzace chromatinu (Münkel et al., 1999). Několik článků popisuje expanzi GL z relevantních chromozomálních teritorií. Například Volpi et al. (2000) pozorovali, že na geny bohaté sekvence hlavního histokompatibilitního komplexu (MHC) jsou lokalizovány na chromatinových smyčkách, které vybíhají mimo relevantní kompaktní chromozomální teritorium. Lokalizace genů na podobných chromatinových smyčkách byla pozorována i pro EDC ("Epidermal Differentiation Complex") klastr genů na lidském chromozomu 1 (Williamns et al., 2002) a dále pro oblast lip 15.5 (Mahy et al., 2002) nebo Hoxl gen během diferenciace embryonálních kmenových buněk (Chambeyron et al., 2004). Podobné umístění genů na velkých smyčkách chromatinu jsme rovněž pozorovali v naší práci Bártová et al. (2008a) pro gen Oct 3/4, který je zodpovědný za pluripotenci embryonálních kmenových buněk (ESCs). Během diferenciace jak myších (mESCs), tak lidských (hESCs) embryonálních kmenových buněk došlo k výraznému snížení exprese genu Oct3/4, což bylo doprovázeno změna v architektuře tohoto lokusu; u hESCs byl pozorován na periferii odpovídajícího 16 chromozomálního teritoria (Obr. 5). Na druhou stranu, vzdálenost genu Oct3/4 od středu jádra se významně nezměnila během indukce diferenciace (Bártová et al., 2008a). Je otázkou, zda všechny chromozomální oblasti jsou schopné tvořit GL a nebo jestli tato vlastnost je charakteristická pouze pro omezené množství genů, případně určité podoblasti chromozomálních teritorií. Z našich experimentů se ukazuje, že pouze některé lokusy mají schopnost tvořit GL a to pravděpodobně lokusy, které se uplatňují během vývoje a nebojsou zodpovědné za pluripotenci hESCs. Tuto domněnku nám potvrzuje fakt, že Protoonkogen c-myc v žádném modelovém experimentálním systému nevytvářel GL (Bártová et al., 2002; Harničarová et al., 2006; Bártová et al., 2008a; 2008b). V případě neutrofilních granulocytu byl sice c-myc umístěn v odlišném segmentu granulocytu (Bártová et al., 2001), ale velikost chromatinové smyčky byla zanedbatelná v porovnání se smyčkami, které nesou sekvence Oct3/4 u pluripotentních hESCs (Obr. 5a). Utvoření GL je pravděpodobně ovlivněno hustotou genů v dané oblasti, protože GL tvoří pouze klastry genů. Navíc epigenetické modifikace histonů a lokální struktura by mohly ovlivňovat míru dekondenzace chromatinových smyček (Mahy et al., 2005). To bylo podpořeno našimi experimenty, které ukazují, že například gen c-myc, mapovaný v oblasti s nízkou transkripční aktivitou (anti-RIDGE) a v blízkosti telomer, není nikdy umístěn na velkých chromatinových smyčkách (Bártová et al., 2002; Harničarová et al., 2006; Bártová et al., 2008a, 2008b). Obrázek 5 Distribuce genu Oct3/4 (červeně) v rámci teritoria chromozómu 6 (zeleně) u lidských embryonálních kmenových buněk (hESCs) (a-c) a hESCs d i ferencovaných kyselinou retinovou (d-f). Jaderná topografie byla rovněž studována pro gen c-myc u pluripotentních hESCs a během jejich diferenciace (g). Publikováno v Bártová et al. (2008a). 17 Z hlediska jaderného uspořádání transkripčně aktivního (euchromatinu) a neaktivního heterochromatinu má svůj funkční význam rovněž i radiálních jaderná distribuce jednotlivých struktur genomu. Bylo zjištěno, že transkripčně aktivní geny, stejně jako oblasti s vysokou transkripční aktivitou (RIDGE - "Regions of Increased Gene Expression"), se vyskytují v jaderném středu, zatímco transkripčně neaktivní lokusy a anti-RIDGE sekvence jsou umístěny spíše na jaderné periferii (Zink et al., 2004; Williams et al., 2006; Goetze et al., 2007; Obr. 6). V práci Harničarová et al. (2006) jsme rovněž ukázali, že transkripty genu c-myc asociují s jadérky, které jsou umístěny v jaderném středu, ve vzdálenosti kolem 40% jaderného poloměru, což je velmi centrální umístění v porovnání s kódujícími sekvencemi genu c-myc, které jsou umístěny v přibližně 70% jaderného poloměru. Navíc žádný z lokusů, studovaných v naší laboratoři, nevykazoval tak centrální lokalizaci jako transkripty c-myc (Harničarová et al., 2006; Bártová et al., 2008b). Například gen TP53 patří mezi geny, které jsou umístěny ve velmi centrální oblasti interfázního jádra, v přibližně 45-50%) jaderného poloměru (Jirsová et al., 2001; Bártová et al. 2003b), avšak transkripce a RNA procesy genu c-myc probíhají ještě centrálnej i v rámci interázních jader (Harničarová et al., 2006; Bártová et al., 2008b). Jak již bylo naznačeno, orientace RIDGE a anti-RIDGE oblastí v buněčných jádrech je velmi specifická (Goetze et al., 2007), což jsme potvrdili i v našich experimentech (Obr. 6). Významné objevy v této oblasti byly udělány i na příkladu chromozómu 18 (HSA 18), který je charakteristický malým obsahem genů, v porovnání s genově bohatým chromozómem 19 (HS A 19). Oba dva chromozómy j sou charakteristické podobnou velikostí v Mbp, ale pravděpodobně z důvodu odlišné genové hustoty je HS A 18 lokalizován na jaderné periferii, zatímco HS A19 je umístěn blíže ke středu buněčného jádra (Croft et al., 1999). Zmíněným výsledkům odpovídají i naše stanovení radiálních distribucí všech lidských chromozómů (Bártová et al., 2001) a rovněž korespondují s našimi výsledky týkající se hustoty zastoupení H3K9 acetylace na chromozómech 17, 18 a 19 (Obr. 7). V tomto případě, H3K9 acetylace, epigenetický znak transkripčně aktivního chromatinu, byla silně zastoupena na centrálně lokalizovaných chromozómech jako je HS A 17 a HS A 19, zatímco chromozóm 18, asociovaný s jadernou periferií, byl spíše deacetylován (Obr. 7). Naše srovnání rovněž vychází z faktu, že radiální uspořádání jednotlivých chromozomálních teritorií i jejich subdomén v rámci interfázních jader je konzervativní u různých buněčných typů (Skalníkova et al., 2000) a během evoluce vyšších primátů (Tanabe et al., 2002). 18 A RIDGEs / antiRIDGEs B HSA11 /RIDGEs HSA11/antiRIDGEs IM :<ut'C'aLOCKIShurBvCh_Fpf3evCh HSA18 fffff/ff/J *ŕ /' f f f /' / / /' /' r J / é 2(J2ö,chria gfi JU' íl' i lnii:itil___u SMITWrExp^mwwM^yiolaWmpuWCBLOCKIShiimyCh.FprtayCh HSA19 J J" J Jř J- Jř J1 y / jŕ J jŕ J J J y jŕ jŕ * , / / / / / / /' f /' / / / / / / / / / / ÍÉéIííL __AÍMšň 5SOI702 Ě)