Smysl JC l Informace (úvod, metodiky) l Práce s anglickým textem l Hodnověrnost dat l Odborná mluva na „veřejnosti“ l Orientace v problematice spolupracovníků l „Team building“ Organizace l 1 výběr článku/úvod za semestr/osoba l Kdy? l Kde? l Kredity l Výběr článku – 8 obrázků, dobrý teoretický úvod, bez suplementů, recentní, dobrý časopis – konzultace předem l Teoretický úvod - Proč byl článek vybrán - Představení pracoviště - Detailnější vysvětlení tématu - Upozornit na zajímavé metody Differential effects of mitomycin C and doxorubicin on P-glycoprotein expression MDR a rakovina l Selhání chemoterapie (nádorové b. jsou obvykle citlivější než „zdravé“ buňky) l De novo/získaný fenotyp MDR (cytotoxic in vitro MTT-assay) l Mechanizmy: – Změny v metabolických drahách, které se podílejí na detoxifikaci látek – Změny v reakci organizmu na poškození DNA – Změny v aktivitě topoizomerázy II – Změny v drahách regulujících apoptózu – Zvýšená produkce ABC transportérů l Nádorová b. se vymyká vlivu svého prostředí (obsahujícího chemoterapeutikum), získává „evoluční“ výhodu ABC transportéry l ATP-binding cassette l Za spotřeby ATP pumpují toxické látky/metabolické produkty VEN z buňky (výjimka CFTR) l 48 různých proteinů u lidí l 7 rodin (A-G) podle homologie l Fyziologická funkce – sekrece látek produkovaných buňkou + obrana proti xenobiotikám l ! Různé substráty -> MULTIléková rezistence! – ABC-B1 – Pgp, MDR1 – ABC-C1 – MRP1 – ABC-G2 - BCRP Struktura MDR1 l Fyziologicky exprimován v játrech, ledvinách, střevě, placentě, krevně-mozkové bariéře, SC l Stres (teplo, zánět, hypoxie, UV záření, diferenciační činidla) vedou k zvýšení jeho exprese - enhacesom l Rychlé zvýšení exprese po inkubaci s jeho substráty (doxorubicin, vinca alkaloidy, etoposid, taxely) = jak zamezit zvýšení exprese dřív než nastane??? SP fenotyp l Marker SC – snížená barvitelnost způsobená zvýšenou expresí ABC transportérů Testované látky l Doxorubicin (adriamycin) – Derivát daunorubicinu (Streptomyces peucetius) – Antracyklinové antibiotikum – Interkalace do DNA – zabraňuje topoizomeráze II rozvinout DNA pro replikaci či transkripci – Léčba solidních nádorů, leukemií, lymfomů (x kardiotoxicita) – Rychlá upregulace exprese MDR1 Mitomycin C – Produkt Streptomyces lavendulae – Aktivován redukcí, následuje alkylace a pak vazba na DNA (5'-CpG-3') = „Cross-linking“ činidlo – Léčba nádorů GIS, moč. měchýře, prsu Vektory l Amplifikace promotoru mdr1: hMDRpro (-996 - +44) – PCR primery obsahující AseI a NheI restrikční místa – Gelová purifikace – Naklonování do pCR3.1 vektoru (využití RM) – Pomocí obou RM vyštípnut promotor l GFP expresní vektor: pEGFP-C1 (má též AseI a NheI RM) – Po štěpení AseI a NheI vyjmut CMV promotor a nahrazen promotorem MDR1 = hMDRpro/pEGFP-C1 (GFP pod kontrolou MDR1 promotoru) l Přidání mdr1 kódující oblasti: hMDRpro/pEGFP-C1/hMDR1 1. MDR1 cDNA – BstUI, Klenow, EcoRI = 1100 bp fragment MDR1 ligován do EcoRI místa na hMDRpro/pEGFP-C1 2. MDR1 cDNA – EcoRI, PmeI = 3300 bp fragment MDR1 ligován do EcoRI a SmaI štěpeného hMDRpro/pEGFP-C1/hMDR1-1100 Metody l Membránový extrakt – lyzační pufr + centrifugace = oddělení cytosolu a membránové frakce l Cytotoxicita (AQueous One Solution Reagent) – redukce tetrazoliové soli na formazán + stabilizátory reakce + elektronový coupler l Akumulace daunorubicinu – substrát MDR1, fluorescenční (FL-2) (1. 20uM verapamil – umožní vstup daunorubicinu do b.- 1,5h) 2. 1 uM daunorubicin - 1h Cíle práce: l Doxorubicin (a další DNA poškozující látky) zvyšuje expresi mRNA i proteinu MDR1 X l Mitomycin C (a další cross-linkující látky) potlačují expresi mRNA i proteinu MDR1 – ale přechodná fáze, kdy je zvýšeno množství MDR1 na membráně, ale ne jeho exprese) = l Existují mechanizmy regulující „dopravu“ MDR1 z cytoplazmy na membránu po vystavení cytotoxiku? Fig. 1 Fig. 2 Fig. 3 Tab. 1 Fig. 4 Fig. 5 Fig. 6 Fig. 7