Metody onačení a imobilizace biomolekul
Petr Skládal
Ústav biochemie PřF MU Kamenice 5, Brno
skladal@chemi.muni.cz http://biosensor.chemi.muni.cz/edu/mib
Uvod
■  modifikace biomolekul:
- vzájemné spojování
- zavádění vhodných značek
- navázání na pevný povrch (separační materiály, mg. částice, sensory, ...)
■  základ řady moderních:
-vědeckých výzkumných metod
- bioanalytických procesů
- terapeutických postupů
■  často zmiňovány jen okrajově
- cílem přednášky je podat ucelený pohled na tuto problematiku
*p"
Souhrn přednášky
1.      Modifikace proteinů a peptidů.
2.      Funkční skupiny nukleotidů, modifikace DNA a RNA. Modifikace (poly)sacharidů.
3.      Chemické reakce vybraných skupin biomolekul.
4      Biokonjugační reakce, zesíťující činidla. Štěpitelné můstky. 1     Fluorescenční značky.
6.      Biotinylace, chelatační skupiny, histidinové skupiny, boronátové komplexy. Radioaktivní značení. Liposomy, nanočástice.
7.      Enzymové značky, metodiky značení a detekce aktivity.
8.      Imobilizace biomolekul. Aktivace matric, polymerní materiály, porézní skleněné nosiče.
9.      Aktivace povrchu zlata, platiny, uhlíku a křemíku. Spontánní vznik monovrstev, fotoaktivace.
J 0,   Charakterizace biokonjugatu - stupeň substituce, povrchová hustota ligandu.
11.    Aplikace: konjugace haptenů s nosiči, značení protilátek.
12.    Aplikace: imobilizace proteinů na povrch zlata, příprava DNA biočipů.
Literati
■   P. Skládal: Metody značení a imobilizace biomolekul. Elektronický text (PDF), MU Brno, 2007.
■   Lowe CR., Dean P.D.G.: Afinitní chromatografie. SNTL, Praha 1979.
■   Hermanson G.T., Mallia A.K., Smith P.K.: Immobilized Affinity Ligand Techniques. Academie Press, San Diego, CA, 1992.
■   Hermanson G.T.: Bioconjugate Techniques. Academic Press, San Diego, CA, 1996.
■   CM. Niemeyer: Bioconjugation Protocols, Strategies and Methods. Humana Press, Totowa, NJ, 2004
■   internetová zdroje - webové stránky dodavatelů reagencií (Pierce, Sigma, ...)
Hermanson G.T., Mallia A.K., Smith P.K.: Immobilized Affinity Ligand Techniques. Academic Press, San Diego, 1992.
Greg T. Hermanson
PARTI
Bioconiugate Chemistry
1. Functional Targets
2_ The Chentisliy ol Reactive Grojps
PARTII Bioccnjugate Reagents
1   Zero Lengifi Ciots-lniktsra
A.   HůrTiQhilunctional Cross-ü-nkers
5.   HeteioMunctiorial Cmss-linkers
6.   Trifunctional Cross-inkers 1.   Cleavable Fteagem Systems S.   Tags and ProbůS
PART III
Bioconjjgate Applicanons
9- Preparation of Ha pien-Carrier lirimunrjgen Conjugates
10.  Arm body Modification and Cůn|jgaTiCn
11.   Immiinůtojiiri Cuniug^iipn Techniques
11 Prtľpsrshor q| Liposome Conju-gaies and Dsrtvauves 11 Auidiri-Bifflin Systems
14.   Preparation ol Colloidai Geld Labeled Proteins
15,   Modilicaucnwim Synttieuc Polymers 16 Eniyire Modification and Conjugation
17. Nucleic Acid and Oligonucleotide Modification and Coring atirjn
3
i 3/
293

Hermanson G.T., Mallia A.K., Smith P.K.: Immobilized Affinity Ligand Techniques. Academic Press, San Diego, 1992.
Immobilized Affinity Ligand Teilnimmt	
Ö 4	r
•	(íľl'J! T. lllTIIIIIINIil \. Knsliiiii Mallia 11           II'      11        • a 4
w	I'iiiilK.Sinilli
The matrix Activation methods Immobilization of ligands Techniques of the trade Selected applications
CM. Niemeyer: Bioconjugation Protocols, Strategies and Methods. Humana Press, Totowa, NJ, 2004
		
CmlHltl		
ssrssssr*" *'    *~		
■ !~~-;		
ť**l   "ill   "■**                                                                                          V	hWiktbbb. Mvtw r.n.—. Im »"■"	
nawtwifcinwoi		
		rianiMi
		
* Ei^r* ■«*">*+*«+*"— w	f*ir IMUwDtti 4SOLH1CI Cpvmmih	
**** t+.MW. '+ yk«   ň i.rfi  n.fc		
		
■ H,'*|t'*"		
-		
		■ A   l^nrilm ml í Iru Inf rim <M t>* LiJit ......■■■■-■ ■ ■■■ "■■........t '■   i. »*   C0*p*H*1 ^ ÜK*p«FHtf Thr+j(n 111 <[yn^ fnpr.' ■■jj— -' »niiHlhm -VCWF^irfN 1-fnŕn.W J r>» ŕ UM «■! < JW-rtOT H**                            _______« [Uuj  Iiáfriidrkikr>i4^                                          MT !'■■   H  M     ■   ■         ■     ■   ■ ■■    ■■ i  n ■  ■■ i-..-,.,,.,- ii:,i-.-,': i,ŕ......./,, ,t<:,..imij#mi    J J ŕ H   '_ ——------------------------------■—.....tiiaialL ľwtnm Hiwái IrtH £m«l «O-r-w tulím, hl H 'H Ci-iihM.
		
		
Modifikace peptidů a proteinů
■ aminokyseliny spojené navzájem peptidovou vazbou:
R	o	R
1	H             II	1
H3N/^N^/<^N/H^C/U		
	1	H             II
O	R	O
modifikovat lze některé postranní řetězce AK, koncovou aminoskupinu a karboxyskupinu, a případně také kovalentně připojené prostetické skupiny (např. koenzymy)
AK nepolární a hydrofobni: glycin, alanin, valin, leucin,
isoleucin, inďánorůn a prolin
AK nepolární aromatické: fenylalanin a tryptofé! j
- tyto jsou často orientovány dovnitř struktury proteinu, a tedy nepřístupné pro modifikační činidla
AK polární: asparagin, glutamin, ihräoinn a sarl/j
-  mimo Gin často posttranslačně modifikovány oligosacharidovými zbytky přes N- nebo O- glykosidické vazby
-  často modifikovány enzymově (např. fosforylace), avšak chem. modifikace ve vodném prostředí nesnadná, protože nukleofilní vlastnosti hydroxylu i amidu se blíží vodě
AK s ionizovatelnou skupinou - kyseliny asparagová
a glutamová, lyzin, sircjj/jj/j, cystein, IjjsíjcJj/j a iyrosl/j
-  vdeprotonovaném stavu jsou účinná nukleofilní činidla
-  hlavní cíl modifikačních reakcí
Aminoskupina (Lys, Arg, His, N-konec)
■   volná aminoskupina (konec pept. řetězce a Lys) je nejčastějším cílem
■   Lys (pKa 9,3 až 9,5) je obvykle protonován
■   Arg (pKa přes 12) je protonován prakticky vždy
■   His s imidazolovým kruhem (pKa 6,7 až 7,1)
■   aminoskupiny se účastní alkylačních a acylačních reakcí, kdy fungují jako nukleofily
■   imidazol. kruh může být elektrofilní, např. při jodaci
ylace a acylace aminoskupiny
■   průběh při reakcích je nukleofilní substituce - vzniká tetraedrický intermediát, X je obecná odstupující skupina
Karboxyskupina (Asp, Glu, C-konec)
■   postranní karboxyly (pKa 3,7 až 4,5) při fyziologickém pH nesou záporný náboj
■   vhodné pro tvorbu amidových, případně i hydrazidových derivátů
■   lze připravit i thioestery - ve vodném prostředí nestabilní
■   derivatizace probíhá přes reaktivní intermediáty -nejznámější je použití karbodiimidů (EDC, DCC, CMC):
	/----\                                                 '       X
<          )-í1N=C=NJK           >	<           >----N=C=N—CH2Chfc-N            O
	\        /                                    2       2/\       /
	H,C
DCC	CMC                          3    tosyl-
CMC ... cyklohexylmorfolinoethylkarbodiimid DCC ... dicyklohexylkarbodiimid
- nerozp. ve vodě, spíše pro konjugace malých molekul
Aktivace karboxylu karbodiimidem
hydrazid
Alternativní postupy
■    reakce s karbodiimidy je velmi rychlá
- nesnadná kontrola průběhu, nežádoucí postranní reakce, konkurenční hydrolysa je rychlá
■   konjugační reakce se provádí přes stabilnější aktivované meziprodukty - NHS, N-hydroxysukcinimid, nebo rozpustnější sulfo-NHS
o
m       karbonyldiimidazol sulfo-NHS                   ^J]^                                 J[^              ...další možnost
o.           soľ       R                                  ""                    ^
HO—N
O
vzniklé NHS-deriváty nebo imidazolylové deriváty jsou relativně stabilní ve vodném prostředí a ochotně reagují např. s aminoskupinou za vzniku amidů
komerčně je dostupná široká škála NHS-aktivovaných molekul (NHS-biotin, NHS-fluorescein, ...), které se pak velmi jednoduše mohou konjugovat s cílovou biomolekulou (R'-NH2):
R"-----NhL
L
\
NHS
Thioskupina (Cys)
cysteinove zbytky jsou normálně protonovane a bez náboje (pK, 8,8
až 9,1)
nejdůležitější reakcí v přirorozeném stavu je tvorba vzájemných
disulfidů (cystinové uskupení)
mohou se účastnit alkylací a reversibilních redoxních reakcí
HO              OH
z oxidované formy (disulfid) vzniká redukovaná forma (volná SH skupina) pomocí redukčního činidla dithiothreitolu (DTT, Clelandovo činidlo) reakce může probíhat oběma směry
thioester (nestabilní, hydrolyzuje)
pyridin-2-thion
vznik disulfidové vazby
Fenolická skupina (Tyr)
■ diazotační kopulace - elektrofilní substituce na aktivovaném benzenovém jádře
-  probíhá do ortho polohy, spojení s aromatickými aminoskupinami, aktivací s kys. dusitou (dusitan a HCl) vzniká regující diazoniova sůl
-  vzniklé konjugáty mají oranžovou barvu
další možnost - jodace, radioaktivní značení 125l
■  Manichova kondenzace - připojení aminosloučeniny v přítomnosti formaldehydu
Specifita modifikačních reakcí
■   účastní se bílkoviny, které obvykle poskytují řadu různých skupin -jejich srovnání dle síly nukleofilních vlastností:
R-S- > R-SH, R-NH2 > R-NH3+, R-COO" > R-COOH, R-O" > R-OH ■ H-OH
■   úlohu hraje přítomnost náboje (protonovaná / deprotonovaná forma) - lze ovlivnit volbou pH, ale protože se hodnoty pKa často překrývají, tak to není příliš spolehlivé
■   pro přesné cílení modifikace na konkrétní skupiny je zapotřebí zvolit specificky reagující činidlo
Cílené zablokování postranních skupin
P-NH2
(Lys)        R-n=c=s
isothiocyanát
(adice -thiomočovina)     °2N
trinitrobenzensulfonová V   ^N0        kyselina (subst.)
aldehyd     R-CH=0
(+ redukce borohydridem)
■ P-SH (Cys)
Cl-Hg    <Á^     />    COOH  p-chlormerkuri benzoová k.
R
maleimidy, např. NEM (adice)
HOOC
COOH
5,5'-dithio-bis(2-nitrobenzoová k.) DTNB, Ellmanovo činidlo (substituce)
P--nCNH
(His)
o
CO—OC2H5
CO—OC2H5
diethylpyrokarbonát (alkoxylace)
Cílená modifikace postranních skupin	
■   P-OH               fí/0-CH(CH3)2 F-P^ (SGI")                    Xo—CH(CH3)2	v>rr
diisopropylfluorfosfát DFP (fosforylace)	fenylmethylsulfonylfluorid PMSF (sulfonylace)
/=x                          C(N°2)4 ■   P-^l    /)—OH    tetranitromethan ^—'              (nitrace) (Tyr)	//     \\          N-acetylimidazol N              NAI (acetylace) 1 CO-CH3
o=L NH2+                ^-CH3 ■   P__NH-----<< 1                    \               2,3-butandion ,m        »           NH2         (kondenzace)	/H 0=f 0          lf^l fenylglyoxal (kondenzace)
nukleových kyselin
nukleové kyseliny (DNA a RNA) jsou tvořeny z jednotlivých nukleotidů spojených fosfodiesterovou vazbou mezi sacharidovými kruhy
základní složkou jsou báze
-  pyrimidinové (C cytosin, T thymin a U uracil)
-  purinové (A adenin, G guanin)
spojením s molekulou sacharidu (ribosa nebo deoxyribosa) poskytují nukleosidy (např. Ade adenosin nebo dAde deoxyadenosin)
připojením fosfátu vznikají nukleotidy (např. AMP adenosin monofosfát).
	s		7
1 ..^	^^	.   5	--N
N .U		:i	>'
	^N^	4	-N9
	3		
Nukleové kyseliny
N K
2' hydroxyl schází u DNA(deoxy...)
HO
5' konec
? 3' konec
ry
■   modifikační reakce mohou typicky směřovat na molekuly bází
■   méně časté je využití sacharidové části (2' hydroxyl u RNA)
■   velmi běžné je připojení dalších funkčních molekul na konec řetězce nukleové kyseliny

Pyrimidinové base
v
HN
-"      X
N
U
N
>k^ xx^-
N
A
N
X
■   části jejich molekul mohou být cílem ataku elektrofilních (červeně) i nukleofilních (modře, pozice 4 a 6) činidel
■   v molekule uracilu nukleofilní substituce v C6 pozici následně aktivuje C5 pozici pro elektrofilní atak:
Reakce cytosinu s hydrogensiřičitanem
vzniká sulfonovaný derivát,                  R
v přítomnosti nukleofilu (amin)      hn' dojde k transaminaci - možnost zavést funkční skupiny               HN'        .
NH,
NH.
HN'
HSO,
v slabě kyselém prostředí pak dojde k hydrolyse aminoskupiny na C4 a následně po alkalizaci se odštěpí hydrogensiřičitan - proběhla konverze na uracil
Biotinylace cytosinu
H2N-NH2 J              o"	O x H                                  NN	-y^-	O
R     O      °	Nh4           HSO3"	O^N^ 1 R	
reaktivní adukt cytosinu s hydrogensiřičitanem se
v reakci s biotin-hydrazidem přemění na žádaný derivát
Cytosin - halogenace
■   možností vpravení vhodné reaktivní aminoskupiny v postranním řetězci je halogenační reakce
■   vodný roztok jodu nebo bromu, případně pomocí N-bromosukcinimidu
■   poslední krok je substituce diaminem:
NH.
H      H2N(CH2)6NH2
(CHJ,------NH,
Purinové base        \ NH2     /             \ °        /
N                    ^n^^^N
pozic pro nukleofilní      n~     nr \\ ,          ^j™      T\    %
ielektrofilníatakyje     .W^/         h2n^%^/
cela rada                               i     a ^                         |   q   \
halogenační reakce s N-bromosukcinimidem poskytuje brom v pozici C-8 jak v případě adeninu, tak guaninu
reakce s kyselinou jodoctovou:
p2                                                                                             NH2
03   *  or°"----   °^rry
^NH                               o     pomalá alkylace v slabě o        ^m^—N
R                                     kyselém prostředí                  ;                     vr
X
zvýšená teplota, alk. prostřeqi                     nľ
nh         Fischer-Dimrothuv přesmyk
N

r   karboxyskupina na N6
HO         Nfl        Ns
Modifikace DNA
■   in vitro enzymová synthesa DNA polymerasou pomocí komplementárního templátového vlákna
■   do reakční směsi se přidají pozměněné nukleotidy, schopné párování, které tak do struktury DNA vnesou žádané funkční skupiny
■   je-li vyžadováno správné párování, tak stupeň substituce max. 30-40 modifikovaných míst/1000 bází
-  derivatizace na cukr-fosfátové kostře nebo na koncích vlákna párování nevadí
■   pozměněné base - deriváty s biotinem, nebo methylenový řetězec s volnou aminoskupinou
-  menší modifikace - není ovlivněna rychlost připojování bází
■   mnohočetné včlenění značených baží může být nevýhodné pro hybridizační reakci
u privatizované base
0        o        o
II             II            II
- P— O— P— O— P----OH
1              I              I O"          O"          O"
■  biotin-11-dUTP
D—
O"        O"        O"
Hl/^h
■  biotin-14-dATP
■ 8-aminohexyl-dATP
Metoda náhodných primerú
■   směs náhodných hexanukleotidových úseků sloužících jako 3'-OH primery s templátovou DNA
■   modifikované nukleotidy se připojují pomocí DNA polymerasy I
- pouze Klenowuv fragment, který postrádá 5'-3' exonukleasovou aktivitu přítomnou v nativním enzymu z E. coli
■   výsledkem je náhodné včlenění značených baží
Nick-transit
nick-translační značení účinkuje na dvojitou šroubovici
směs pankreatické deoxynbonukleasy I (DNasa I) a DNA polymerasy I
v přítomnosti Mg2+ DNasa (v limitujícím množství) provádí hydrolýzu pouze v jednom vlákně
vzniklé štěpy jsou však ihned zaplněny přítomnými modifikovanými i nativními nukletidovými monomery za katalysy DNA polymerasy
výsledkem je modifikace původní molekuly dsDNA
ačení v průběhu PCR
■   nejúčinnější metodou je provést značení DNA v průběhu polymerasové řetězové reakce (PCR)
- současně se samozřejmě zmnoží množství původní DNA
■   buď se do reakční směsi prostě přidají značené nukleotidy a jsou náhodně vestavovány do nově syntetizovaných řetězců
.»„.ft.
V^             TyfT   \fl
nebo je možné použít pouze značené primery (např. biotinylované)
Koncové značení
■   cílem je zamezit modifikaci uprostřed řetězce DNA
■   využití terminálni transferasy - přidává nukleotidy ke 3'-OH koncům DNA bez potřeby templátového vlákna
■   např. také pro radioaktivní značení
*■
Sekvenčně-spe           á značení
■   rozpoznání cílového místa, vytvoření kovalentní vazby se značkou
'  DNA methyltransferasy (MTasy) - přenáší methylovou skupinu z S-adenosyl-L-methioninu (AdoMet) na A nebo C zbytky
■   methylová skupina se nahradí něčím "užitečnějším" -aziridinový reaktivní zbytek pro vytvoření kovalentní vazby s DNA v průběhu enzymové methylace, biotinová skupina připojena v postranní části
■   značení DNA v předem určeném místě, daném polohou cílové sekvence MTasy
Značení pomocí methyltransferasy
cílová sekvence 5'-TCGA-3'       <f
• Ji J
5—T C G -o 3—AG C        T
H,N.     ,COOH
AdoMet    OH OH
5        T C G   o^        0    3
3—AG C        T      -s
Aziridin-Ado-Biotin
HN       NH
H")----('"H
I        jf    ^—NH(CH2)„NH-CO-(CH2)4---    -S'
/J,
HN       NH
H„A----/„„h
I        ||     '^NH(CH2)4NH-CO-(C;i2)í/Xs'
5-       T C G -o-*        0    3
3—AGC        T      -s
Fosforamidová metoda
■   aktivace konc. fosfátu EDC vede s aminy k fosforamidum
■    reakci lze provést také s imidazolem, čímž vznikne fosforimidazolidový produkt
- má ve vodném prostředí prodlouženou životnost a reaguje velmi dobře s aminy - vyšší výtěžky fosforamidové reakce
oligonukleotid s ö'-P,
Reaktivní EDC fosfodiester
imidazol
fosforimidazolid        f|      |1
M---------U
Modifikace RhlA
■   molekuly RNA obvykle jednořetězcové, vnitřní vzájemně komplementární krátké sekvence
■   párování vede ke vzniku různých třídimenzionálních struktur (helikální úseky, smyčky, vlásenky, G-kvartety...)
■   další změnou oproti DNA je existence diolového uskupení v molekule ribosy - lze specificky oxidovat jodistanem, na reaktivní aldehydové skupiny
■   vhodně orientované struktury RNA (i DNA) mohou vytvářet vazebná místa, komplementární k jiným biomolekulám - APTAMERY
-  možnost náhrady protilátek
-  tyto vazebné struktury, tzv. aptamery, lze vytvářet uměle kombinatorickými postupy (SELEX, systematic evolution of ligands by exponential enrichment)
-  nejznámější je aptamer vážící thrombin
Modifikace sacharidů
volné existují v monomerní, oligo- a polymerní formě
vázané ve formě konjugátů s proteiny (glykoproteiny) nebo lipidy (glykolipidy)
reaktivní skupiny - hydroxyly a oxoskupiny
-  monosacharidy - dle polohy oxo skupiny aldosy a ketosy
-  ve vodném prostředí přítomna zejména hemiacetalová forma
-  glukosa jako glukopyranosa a fruktosa jako fruktofuranosa
HO»
HO             OH
- následně jsou přirozené oxoskupiny jsou méně reaktivní k modifikaci se využívají postranní glykosidické skupiny pokrývající povrch glykoproteinů
velký význam má derivatizace polysacharidových matric sloužících jako stacionární fáze (separace, sensory, ...)
Aktivace bromkyanem BrCi J
■   klasická metoda aktivace polysacharidových materiálů
■   nevýhodou je vysoká jedovatost činidla
■   výhodou dobré výtěžky reakce
■   reakce probíhá v alkalickém prostředí, rozsah je úměrný koncentraci činidla
■   meziprodukt imidokarbonát reaguje s aminoskupinou biomolekuly B za vzniku různých derivátů:
H2N—(j^
O
II
O-C-NH
OH
-©
derivát                      N-substituovaný                   N-subst. karbamát
isomočoviny             imidokarbonát                      ....        .        .
J                                                        Aktivace bromkyanem
D.íjdace jodisÍ2Jij jm
■  jodistan (periodate) za mírných podmínek a v neutrálním pH účinkuje na diolová uskupení v molekule sacharidů
■   vhodné i pro postranní sacharidové složky glykoproteinů
- postup je např. často využíván k oxidaci peroxidasy při výrobě enzymových imunokonjugátů
i—OH                                                                              i-----OH
J—o^ i-°-b                    J—o.   p°-b
OH               ^                      NalO,
3     p
OH

■ získají se reaktivní aldehydové skupiny
Real< ti vní skupiny
■  obecný pohled na reaktivní skupiny bez vazby na konkrétní typ biomolekuly - univerzálně použitelné metody
možnosti konverze existujících skupin
■  reakce typické pro vybrané skupiny
Vnášení reaktivních skupin
■   přirozené reaktivní skupiny biomolekuly nemusí dostačovat pro zamýšlené syntetické postupy
■   konjugace bílkovin - často heterobifunkční činidla, která vyžadují různé koncové skupiny v obou partnerech
■   jeden z reakčních partnerů předem upraven zavedením potřebné skupiny
Thiolace (zavedení -SH)
volná -SH skupina je pro konjugace velmi oblíbená
v bílkovinách obvykle zřídka, nebo blokováno ve formě disulfidických -S-S- můstků
stabilita -SH špatná - oxidace (inertní atmosféra, chelatace iontů kovů - katalyzují oxidaci)
+ NH2		NH, II
3   ^O      ^^	CH	,       -J<
		*    v           +     CH3OH
		^^      2-iminothiolan
T		R—NH2
H	^/SH	
methyl-4-merkaptobutyr-imidát (Trautův reagent) cykl. na 2-iminothiolan (imidothioester)
v mírně alk. podmínkách reaguje s primárními aminy alternativní methyl-3-merkaptopropionimidát poskytne kratší můstkovou část
-NH2 na -SH pomocí SÁTA
■    N-sukcinimidyl-S-acetylthioacetát (SÁTA) působí konverzi aminoskupiny na thioskupinu
■   odštěpí se N-hydroxysukcinimid, produkt obsahuje chráněnou sulfhydrylovou skupinu (lze uchovávat)
■   deprotekce nadbytkem hydroxylaminu
K
N-O         .S—^
R—N H.
o o .
p
CH,
7^
N-OH O
y-t     ch3
O
.. .2-
1
o.
_*   R-N            SH
CH,
HO—N H
■    není třeba redukce - neovlivní se tedy nativní -SH skupiny
■   analog N-sukcinimidyl-S-acetylthiopropionát (SATP) poskytne delší můstek
-NH2 na -SH: citiolon a SAMSA
citiolon, N-acetylhomocysteinthiolakton resp. 2-acetamido-4-merkaptobutyrát reaguje jako Trautův reagent, reakci urychluje Ag+
\     f^     citiolon	^SH
m      CH3        R-N         | ^"----------►       H        NH R-NH2     ^^                         °y	
\                                ^	.COOH
WL.   R"V	k„
°               SAMSA                °	
reaktivní cyklický anhydrid - anhydrid S-acetylmerkapto-jantarové
kyseliny (SAMSA)
uvolnění -SH skupiny deprotekcí s hydroxylaminem
>C=0 na -SH
■   konverze oxoskupiny (aldehyd / keton) je možná hydrazidem 2-acetamido-4-merkaptomáselné kyseliny (AMBH)
•   napr. pro jodistanem oxidované sacharidy ci glyk<	jpro
CK	
I                          AMBH	
1                   H	
^\^\^N^	
HS      ^^   >l^       NH2                CK	
1             II                 2                 1     3 O                   V          °                              <^	
//                      ^-«^^^                              O          NH ^                                                                ^^   J^    ^N^   ^-v	
H                                                       HS-^^Y        N	R
O	
COOH nebo -0-P032- na -SH
cystamin v přítomnosti karbodiimidu (EDC)
H2N
-S-S.
^NH,
vznikne amidová resp. fosfamidová vazba
vnesené -S-S- disulfidové uzkupení je možné přímo spojit s molekulou obsahující volnou -SH skupinu (uvolní se cysteamin)
nebo lze získat volnou -SH skupinu redukcí, např. DTT
cysteamin = 2-aminoethanethiol / 2-merkaptoethylamin / dekarboxycystein / thioethanolamin
cystein
cystl/j
-S-S- na -SH
speciální případ, k rozštěpení dojde redukcí, činidel je
celá řada, např. s volnou -SH skupinou:
- dithiothreitol (DTT, Clelandovo činidlo), 2-merkaptoethanol, 2-merkaptoethylamin
imobilizované formy činidel - není třeba provádět separaci nadbytečného činidla
odobný výsledek poskytuje i TCEP, tris(karboxyethyl)fosfin
nejjednodušší redukce pomocí borohydridu NaBH4
má význam i pro štěpení nativních S-S můstků v bílkovinách
Karboxyskupina místo -Ni
užívají se cyklické anhydridy dikarboxylových kyselin reagují s volnou aminoskupinou - otevírá se kruh a vzniká amid může reagovat i hydroxyl serinu a threoninu, fenolátový anion dává nestabilní produkt
dočasné blokování aminoskupiny - anhydrid kyseliny citrakonové -  poskytuje amidovou vazbu při pH 8, snadno hydrolyzuje při pH 3 až 4 za opětovného uvolnění aminoskupiny
možnosti: asukcinanhydrid, b glutaranhydrid, c maleinanhydrid, d anhydrid kyseliny citrakonové
změna aminoskupiny za karboxy-skupinu mění náboj a pl dané biomolekuly
o
R— NH,   +
O                    O
c o     h,c d     o
R—N.
OH
O
logenoctové kyseliny
■   kyselina jodoctová:
-  může reagovat s aminoskupinami lyzinu nebo imidazolového kruhu histidinu, se sulfhydrylovou skupinou cysteinu i
s methylthioskupinou methioninu
-  reakce závisí na pH prostředí
■   další a-halogenoctové kyseliny - podobně
-  reaktivita derivátů klesá v řadě I > Br > Cl > F
-  z druhé strany v řadě sulfhydryl > imidazolyl > thioether > amin
-  za ekvimolárních poměrů a v mírně alkalickém prostředí jodacetat reaguje exkluzivně s cysteinovým zbytkem
■   kyselina chloroctová slouží k derivatizaci hydroxylových skupin v polysacharidových matricích (dextran)
-  reakce probíhá v alkalickém pH:
r_oh   +   ci^^°-------------►               N
$            -HCl           FT    ^^     O
esení aminoskupi
• nejběžněji konverze karboxylu pomocí diaminů v přítomnosti karbodiimidu (EDC) - vzniká amidová vazba a druhá koncová aminoskupina zůstává volně k dispozici
-NH.
NH,
ethylendiamin (krátký můstek)
hexamethylendiamin (1,6-diaminohexan)
3,3'-iminobis(propylamin)
Jeffamin EDR-148 (hydrofilní)
konverze karboxyskupiny na aminoskupiny výrazně ovlivní celkový náboj biomolekuly a také její pl hodnotu - často je to zamýšleným účelem modifikace
-SH na -NH2
■   lze pomocí aminoethyl-8,N-(jodoethyl)trifluoracetamidu:
.H..'rFF
R—SH
-^
O H-l
^v~
R^  --»■       s
OH
,NH,
-   deblokace v druhém kroku je spontánní
■   ethylenimin v alkalickém prostředí - reakce převážně pouze s Cys
-   činidlo může vznikat přímo v alk. směsi cyklizací z 2-bromoethylaminu
R—S     +
H N
-    R.
.NU,
Aldehyd na -NH2
■  redukční aminace pomocí amoniaku nebo diaminu v přítomnosti kyanoborohydridu sodného NaCNBH3
-  vzniká Schiffova báze, pak stabilizována redukcí
-  lze takto připravit např. aminovaný dextran po předcházející oxidaci jodistanem
-  nedochází k redukci aldehydické skupiny
-NH2z tyrosir
■   nitrace pomocí tetranitromethanu
■   nitroskupina se zredukuje na aminoskupinu
■   lze výhodně aktivovat kyselinou dusitou na diazoniovou sůl pro kopulační reakce
C(N02)4 R—<\        /)—OH --------------►    R—<\        /)—OH                —»■  R—<\        /)—OH
NH,
Aminoskupina na aldehyd
■   sukcinimidyl-p-formylbenzoová kyselina (SFB)
■   sukcinimidyl-p-formyl-fenoxyoctová kyselina (SFPA)
- při reakci vzniká amidová vazba, v případě proteinů výrazně narůstá jejich hydrofobicita
\    SFB	N-0 ^i             SFPA 0
Glutaraldei 7 J
Schiffova báze
-C=N-je redukována r stabilnější formu (A)
reaguji i oligomerní adukty glutaraldehydu (E), pre bíhá adice aminoskupiny n; dvojnou vazbu (B)
kondenzace na cykl. produkt pak reakce s lyzinovýn zbytky - zesítění
tvorba smíšených konjugá málo definované a čas vysokomolekulárni
cyklická hemiacetalová for vyskytuje zejména v k) prostředí, může dále polymerovat (D)
a,p nenasycený aldehydov)/ polymer (E) vzniká při zásaditém pH
H                  H
kyanoborohydrid neredukuje aldehydy, borohydrid ano!
bY\
í reakce
spojení dvou biomolekul - vyžaduje činidla, která dokáží spojit přímo dvě různé nebo shodné povrchové skupiny na obou různých molekulách
přímé spojení biomolekul bez přítomnosti nějaké můstkové spojovací struktury - zero length crosslinkers
karbodiimidy, karbonyldiimidazol,
aldehyd + aminoskupina
včlení se spojovací můstek požadované definované délky tzv. linker- bifunkční činidla
Oo
Homobifunkční síťující činidla
■   symetrická činidla, co mají dvě shodné reaktivní skupiny
■    činidlo se spojí jedním koncem s biomolekuly A
■    druhý konec se spojí s biomolekulou B
■   vznikne A-B konjugát (to je žádaný produkt)
-   nežádoucí produkty: A-A, B-B, oligomerní AxBy, prokřížení skupin v rámci jedné molekuly A (nebo B)
■    průběh je málo definovaný
■    provádění reakce
-  jednokrokově - vše se smíchá dohromady - pak vznikají často oligomerní, případně i precipitující produkty
-   nejprve biomolekulu A smíchat s konjugačním činidlem a nechat proběhnout její modifikaci, odstranit nadbytek činidla (např. dialýzou) a pak přidat druhou biomolekulu B
■    komplikace - nestabilita reaktivních skupin ve vodném prostředí
-   mimo konjugaci probíhá i hydrolýza
■    přes uváděné nedostatky se běžně a úspěšně využívají
Homobifunkční N HS estery
■    karboxylové skupiny aktivované N-hydroxysukcinimidovou skupinou (NHS) (nebo sulfo-NHS) - velmi reaktivní vůči nukleofilním -NH2
■    obecná struktura NHS-z-NHS, z značí střední část = spojovací můstek:
0^° S    í °"0      V"2 R7NHz       ^ Ur
y%AzAo^ —s—s—> h z a
O                                             O                      NHS             NHS
■    dithiobis(sukcinimidylpropionát) (DSP nebo DTSP), Lomantovo činidlo, z = 1,2 nm, disulfidove uskupení může být rozštěpeno pomocí DTT nebo merkaptoethanolu
-   sulfonovaná varianta: 3,3'-dithiobis(sulfo-sukcinimidyl -Propionat) (DTSSP)
-   rozpustný ve vodě
■    DSP a vznikající produkt:
Další NHS bifunkční činidla
•   disukcinimidylsuberát (DSS), C8 alifatický můstek, z = 1,14 nm
-   existuje sulfovarianta bis(sulfosukcinimidyl)suberát (BS3)
-   hydrofilní BS3 je výhodný k prokřížení (bílkovinných) komplexů na povrchu buněk -činidlo neprochází buněčnou membránou
-   kratší C5 můstek, z = 0,77 nm, poskytuje disukcinimidylglutarát (DSG)
OH
O             OH     O      A/
DST              cT"7
y%ArN
O   DSC
disukcinimidyltartrát (DST) vytváří kratší můstek o délce 0,64 nm
-   přítomnost dvou hydroxylu uprostřed můstku umožňuje rozštěpit spojení použitím mírné oxidace jodistanem
nejkratší spojení vytvoří N,N'-disukcinimidylkarbonátu (DSC)
-   spojením vzniká substituovaný derivát močoviny, vůči nukleofilům je extrémně reaktivní
-   nelze použít ve vodném prostředí, hydrolýzou vzniká C02 a 2 NHS
-   pro derivatizaci polyethylenglykolů - spojí hydroxy a aminoskupinu za vzniku karbamátového uskupení
-   napřed se v nevodnem prostředí aktivuje PEG, ten pak může ve vodném prostředí reagovat s proteiny (pegylace)
Homobifunkční imidoestery
imidoesterová (jinak imidátová) skupina ve vodném prostředí reaguje s aminoskupinou za vzniku imidoamidu (amidinu)
- činidlo i produkt jsou ve vodném prostředí protonovány na imidovém dusíku, tedy dobře rozpustné
NH      NH
NH      NH
H,C_
A,
XH,
R'—NH2     R-NH2
's    's
CH3OH        CH3OH
RA
■»          N
H
A
amidinová vazba je stabilní v mírně kyselém prostředí, při vyšším pH může hydrolyzovat
činidla jsou na bázi imidoderivátů dikarboxylových kyselin:
-   dimethyl adipimidát (DMA, C6 z = 0,86 nm)
-   dimethyl pimelimidát (DMP, C7 z = 0,92 nm)
-   dimethyl suberimidát (DMS, C8 z = 1,1 nm)
DMP stabilizuje komplexy protilátek s proteinem A dimethyl-3,3'-dithiobispropionimidát (DTBP) obsahuje uprostřed disulfidové spojení (z = 1,19 nm)
-   může být případně rozštěpen DTT
Homobifunkční činidla spojující -SH skupiny
dvě skupiny podle stability vznikajícího spojení:
-   disulfidova vazba - spojení lze snadno rozrušit pomocí oxidačních činidel
-  thioetherová vazba - spojení trvanlivé
1,4 di-[3'-(2-pyridyldithio)-propionamido] butan (DPDPB)
-   reverzibilní spojení biomolekul, z = 1,6 nm, 14 atom. řetězec
-   odštěpovaný pyridin-2-thion lze sledovat při 343 nm
-   pro vytváření konjugátů redukovaných molekul protilátek s enzymy
o        DPDPB
Thioetherové spojení
1   bis(maleimido)hexan (BMH) reaguje v neutrálním prostředí za vzniku
stabilního spojení (z = 1,6 nm) 1   dochází k adici sulfhydrylových skupin na dvojné vazby v cyklu a vznikají tak stabilní thioetherové vazby
-  mechanismus vychází z použití N-ethylmaleimidu (NEM) jako inhibitoru cíleného na SH skupinu
rf^f      BMH
R-SH
-. I
HS-R'
Homobifunkční jJdehydy
■   dříve zmíněný glutaraldehyd
1   formaldehyd - nejkratší spojovací můstek, reaguje prostřednictvím
>    Mannichových kondenzací (A)
-   spojuje sloučeniny s aktivovanými vodíky (např. na jádře fenolu v ortho a para polohách) s formaldehydem a dále s aminoskupinou
>    přes imoniový kationt s aminoskupinou (B)
-   spontánně vznikne reaktivní imoniový katión, který zreaguje s další aminoskupinou a dojde ke spojení přes C1 můstek
R-NH2        S   .       R-NH—CH—OH——* R-NH=CH2
R'— NH,
\
H
Bis-epoxidové sloučeniny
jsou schopné spojovat biomolekuly obsahující nukleofilní skupiny
včetně aminů, hydroxylů a sulfhydrylů
dochází k otevření tříčlenného epoxidového kruhu (A)
reakce probíhají v mírně alkalickém prostředí
k aktivaci matric nesoucích hydroxylové skupiny (polysacharidy)
nejznámějším činidlem je 1,4-butandiol diglycidylether (B)
R'—NH„
Fotoreaktivní crosslinkery
■    bis[ß-(4-azidosalicylamido)ethyl]disulfid (BASED) je aktivován ozářením UV světlem (270 nm)
■    uvolní se molekula dusíku a vznikne velmi reaktivní a nestálý arylnitren - rychle se přemění za rozšíření aromatického kruhu na dehydroazepin, ten následně reaguje s aminoskupinou biomolekuly
-;X'NY^        H        BASED            O      OH
OH     O                                                    L\^L-N^N
R-NH2
N2
H
■    derivát vzniklý po konjugaci obsahuje na 7-členném kruhu fenolický hydroxyl, který ho aktivuje např. pro elektrofilní značení radioaktivním jodem
další možnosti...
■   aktivované vodíky na aromatickém jádře - diazoniové deriváty
■    úspěšné spojení se projeví oranžovým nebo ještě tmavším zbarvením vzniklých konjugátů -charakteristické pro diazosloučeniny
■    diazoniové sloučeniny se obvykle generují z příslušných diaminů -o-tolidin a benzidin (p-diaminodifenyl) - reakcí s NaN02 v slabě kyselém prostředí v chlazené reakční směsi
■   vzniklá diazoniová sůl reaguje ochotně se zbytky tyrosinu a histidinu ■
■    difluorbenzenové deriváty - atomy fluoru na vhodně aktivovaném aromatickém jádře (např. pomocí nitroskupin) reagují substitučně s aminoskupinami
-  mohou ale reagovat i jiné nukleofily
■    dostupná činidla jsou 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen (DFDNB) nebo 4,4'-difluoro-3,3'-dinitrodifenylsulfon (DFDNPS)
■   HO
KS
Heterobifunkční konjugační činidla
■   obsahují dvě různé reaktivní skupiny - spojí se s různými funkčními skupinami konjugovaných biomolekul
>   použití obvykle probíhá ve dvou nebo třech krocích
-   výrazně se omezuje množství oligomerních nebo polymerních produktů
-   činidlo je smícháno s první biomolekulou, kterou derivatizuje svou reaktivnější skupinou
-   nadbytek činidla je odstraněn (dialýza, gelová filtrace)
-   druhá reaktivní skupina je obvykle stabilnější a následně reaguje s druhou biomolekulou
1   variabilita reaktivních skupin - lze lépe vybrat cílové místo
-   menší narušení důležitých aktivních míst (epitop antigénu, vazebné místo protilátky, aktivní místo enzymu ...)
1   důležitá je i spojovací můstková část - linker
-   může být samozřejmě pasivní
-   může být cílem dalších reakcí, zejména se jedná o rozštěpení
-   význam pro zachování bioaktivity konjugátu má délka a polarita linkem
Spojení -SH a -NH2
■    nejčastější vzhledem k běžné dostupnosti cílových skupin v bílkovinách
■    pro aminoskupinu je v činidle nejčastěji přítomna NHS skupina v kombinaci s několika možnostmi pro SH skupiny
■    N-sukcinimidyl-3-(2-pyridylditio)propionát (SPDP) poskytuje amidovou vazbu s biomolekulou nesoucí -NH2 a disulfidovou vazbu s biomolekulou nesoucí -SH:
o
N-q o o'
SPDP
V           R—N
L               n
R-N
Q        \      N
pro SPDP je z = 0,68 nm
s delším řetězcem (z = 1,12 nm) pod názvem LC-SPDP (long-chain)
rozpustnější se sulfonovanou NHS skupinou - Sulfo-LC-SPDP
sukcinimidyloxykarbonyl-a-methyl-a-(2-pyridyldithio)toluen (SMPT)
-   můstek tvořený benzenovým jádrem a methylovou skupinou chránící disulfidovou skupinu (sterická zábrana ataku) zlepšuje trvanlivost konjugátů
-   analog Sulfo-LC-SMPT
-   spojení biomolekul lze rozebrat v místě -S-S- vazby redukcí (např. DTT)
,0	SMPT          f    ^>
h:	w
N-0	/—\        s—s
h y	o<
0   0	W         CH3
„nerozebíratelné" spoje používají pro SH skupinu maleimidovou nebo jodacetátovou reaktivní část
- sukcinimidyl-4-(N-maleiimidomethyl)cyklohexan-karboxylát (SMCC) z = 1,16 nm)
p
N-O
\       /, O   O
SMCC
R-NH,
-SH
^           >__►   R-N
NHS
0<Vs'R'
další alternativní činidla: m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysukcinimidoester (MBS, 0,99 nm), sukcinimidyl-4-(p-maleimidofenyl)butyrát (SMPB, 1,45 nm) a N-(Y-maleimidobutyryloxy)-sukcinimidester (GMBS, 1,02 nm)
■	N-sukcinimidyl(4-jodoacetyl)-aminobenzoátem (SIAB, 1,06 nm)		
	,     R-NH,      R'—SH                                                    R' /    SIAB        h^'      .               I                                                 /		
	O   O         \=/                             NHS              HI             //     \_}		
■ ■	alternativní činidla -   sukcinimidyl-6-[(jodoacetyl)-amino]hexanoát (SIAX) -  jeho varianta s můstkem prodlouženým o aminohexanovoi sukcinimidyl-6-[6-(((jodoacetyl)amino)-hexanoyl)amino]he> -   sukcinimidyl-4-(((jodoacetyl)amino)methyl)cyklohexan-1-k< (SIAC) s analogem SIACX mají objemnější spojovací můstc p-nitrofenyljodo-acetát (NPIA) vůči -NH2 reaguje podobr vzniká také amidová vazba -   výhodou může být krátké spojení mezi biomolekulami	j kyselinu, tj. :anoát (SIAXX) irboxylát :k lějako NHS,	
	R-NH,                                     R'—SH CLN.     /^.                                 I                           O                     I                       O Tn     9          l    .   u     11     ,      V .   u     11	s>	
	NPIA                                      *                                           h7 nitrofenol		
			
äjjDJení >C=0 a -NH2
■    pro konjugaci zejména sacharidů (a glykoproteinů)
-   oxoskupina se snadno generuje mírnou oxidací jodistanem
-   reaguje s ní zejména hydrazidová skupina
-   z druhé strany se účastní skupiny popsané již dříve
■    hydrazid kyseliny 4-(4-N-maleimidofenyl)-máselné (MPBH), z = 1,79 nm
-   je vhodné provést reakci nejprve s SH skupinou, purifikovat produkt a následně připojit aldehydovou skupinu.
■    rozebíratelné spojení se získá 3-(2-pyridyldithio)-propionylhydrazidem (PDPH)
H2N          0 N—f		0			R'	0				
H     \__		=>    ^			N-H				°y	S-.
MPBH	\_	^K	R-SH /		R^0		\^_	j	-N	í  "
		0         >	<				/		0	
			x		<	y	s			
		/==\	H,N	,0		•ť				
	s— /	\,_/	N— H			%	ŕ-			
°y^s		N—'			vY"	-N				
H2N-N            PDPH						y				
						0				
Amino- a fotoreaktivní konjugační činidla
■   jedna část činidel je aktivována světlem - arylazidy, fluorované aryl azidy, benzofenony, některé diazosloučeniny a diazirinové deriváty
-   první konjugační reakce napojí činidlo na biomolekulu (pracovat ve tmě)
-   odstraní se nadbytek činidla a navázaná fotoreaktivní skupina pak po osvětlení reaguje s partnerskou biomolekulou
arylazid                     T""**». N		R-NH2          1 Íy^i —	Ti '
_                                      IN2 dehydro    U        n azepin        \=/			xxN,
R-NH, /      *     R-H		>?Y	r5!
N-R H	N-H	R	^yR
N-hydroxysukcinimidyl-4-azidosalicylát (NHS-ASA, 0,80 nm)
-   derivatizuje aminoskupiny obvyklým způsobem - vznik amidové vazby
-   k dispozici jsou i varianty Sulfo-NHS-ASA a Sulfo-NHS-LC-ASA (1,8 nm) fenolický hydroxyl aktivuje benzenové jádro pro značení radioaktivním jodem, to lze provést před fotoreakcí
-   k dispozici jsou varianty bez hydroxylu na benzenovém jádře: N-hydroxysukcinimidyl-4-azidobenzoát (HSAB, 0,90 nm) případně s nitroskupinou N-5-azido-2-nitrobenzoyloxysukcinimid (ANB-NOS, 0,77 nm)
štěpitelné konjugáty poskytuje sulfosukcinimidyl-2-(p-azidosalicylamido)ethyl-1,3'-dithiopropionát (SASD, 1,89 nm) linker může být alifatický řetězec u N-sukcinimidyl-6-(4'-azido-2'-nitrofenylamino)hexanoátu (SANPAH, 1,82 nm)
-   nitroskupina podporuje fotoaktivaci již nad 320 nm
sulfosukcinimidyl-2-(7-azido-4-methylkumarin-3-acetamid)ethyl-1,3'-dithiopropionát (SAED, 2,25 nm)
-   vzniklý konjugát obsahuje fluoreskující uskupení - derivát kumarinu
-   lze tak pohodlně sledovat pohyb konjugátu
-   fluorescence se přitom iniciuje až po fotolytické reakci podobně se chová sulfosukcinimidyl-7-azido-4-methylkumarin-3-acetát (Sulfo-SAMCA, 1,28 nm)
			R-H		
A-V^s-s-	H                ?H3	'^l	^-	1         ľ"3	^^1
yv MH,	0   J^ A cr    0	\s^	NU   -	v	^^     N H
SO3H			^N	^N2	
■   alternativní fotolytickou skupinou je diazopyruvátové uskupení
-   poskytuje reaktivní karbenové uskupení, které se přemění Wolfovým přesmykem (W) na ketenové uspořádání
-   pak aduje nukleofilní skupinu - p-nitrofenyldiazopyruvát (pNPDP)
	/=\								O		
02N	NPDP	-o      o H_. ■ O          N—N=N p-nitrofenol	S«' R-	R--NH2 uv/ /-N2 H          O -N      // O          N—N=	H         O O        c:	w	R-	-N O	R-	R \ -N O	—NH2 ,■*■ HN
podobným mechanismem reaguje i p-nitrofenyl-2-diazo-3,3,3-trifluoropropionát(PNP-DPT)
Sulfhydrylova a fotoreaktivní konjugační činidla
■   kombinací předchozích skupin je l-(p-azidosalicylamido)-
4-(jodacetamido)butan (ASIB) a N-[4-(p-azidosalicylamido)butyl]-3'-(2'-pyridyldithio) propionamid (APDP)
•   jinou fotoaktivní část obsahuje benzofenon-4-jodacetamid
-   výhoda benzofenonu - možnost opakovaného průběhu fotoaktivace i po nekonjugační zpětné rekombinaci volných elektronů
-   vyšší výtěžky konjugace
-   alternativní SH-reaktivní část má benzofenon-4-maleimid
benzofenon-4-jodacetamid
O
Další fotokonjugace
■ s guanidinovou skupinou argininu může reagovat p-azidofenylglyoxal (APG)
APG                                                     .^ X^         NH zbytek argininu                                         m___U H        NH2	H   W    °H
pro napojení fotoaktivni části na aldehydovou skupinu je použitelný p-azidobenzoylhydrazid (ABH)
karboxyskupina může být fotoaktivována pomocí
4-(p-azidosalicylamido) butylaminu (ASBA)
- jeho volná aminoskupina se spojí s karboxylem v přítomnosti karbodiimidu, kdy vznikne amidová vazba
Fluorescenční metody
■   široké použití v oblasti výzkumu i praktické aplikace
■   bioanalytické metody
-  klinická chemie (fluorogenní substráty při stanovení enzymů)
-  imunochemické metody (ELISA, FIA fluoresceční imunoanalyza)
-  genetické analýzy a DNA biočipy
-  monitorování prostředí (fluorecenční proby)
■   biomedicína
-  identifikaci a separace buněk v průtokové cytometrii
-  zobrazení buněčných komponent ve fluorescenční mikroskopii a analýze obrazu
-  konformace a dynamika buněčných systémů
Fluoresces
zdroj světla
intenzita A
w\
fluorescence
(kolmo na excitační paprsek)
detektor
If = k®scl
fluorescence = fotoluminiscence,
emise světelného kvanta při návratu       l0 » lf
elektronu z vyšší energetické hladiny,
kam byl vybuzen fotoexcitací
fluorescence F se udává při určité vlnové délce
-   emisní x excitační spektra
-   relativní vyjádření, alternativně jako intenzita světelného toku na jednotkovou plochu ("count")
další charakteristiky: kvantový výtěžek 0, střední doba života r, polarizace P (směr kmitání el. vektoru emg. vlny) fluorescence prakticky ihned (KFs) po skončení excitace ustane fosforescence trvá delší dobu, při excitaci vzniká metastabilní stav energetické přechody - Jablonského diagram: (vznik a zánik excitovaných stavů)
Fluorescein
absorbce
*{
vnitřn , přechod
X:
absorbce kolize --^
přechod mezi systémy

vnejsi přechod
neradiační ■ přechody   ý
vibrační hladiny
S» S,,... energetické hladiny        f,uorescence        fosforescence r=    10-15s                             10-8s                       10-3-1 s
-j   Kashovo pravidlo;
-   před emisí dochází k relaxaci vibrační energie a vnitřní konverzi, takže fluorescenční přechod nastává z nejnižší vibrační hladiny prvního excitovaného stavu S1
■   Vavilovův zákon:
-   kvantový výtěžek a doba trvání excitovaného stavu složitých molekul v roztoku nezávisí na vlnové délce budícího záření
-   obecná vlastnost fluorescence: emisní spektra jsou nezávislá na vlnové délce excitace
■   Zcadlová symetrie mezi absorpčním a fluorescenčním pásem:
-   absorpce i emise z odpovídajících si vibračních hladin mají stejnou relativní pravděpodobnost. Většina absorbujících i emitujících molekul se nachází v rovnovážném vibračním stavu, přičemž vibrační struktura základního i excitovaného stavu mají stejnou strukturu
-   po absorpci přechází elektron z rovnovážné vibrační hladiny stavu S0 na vyšší vibrační hladinu stavu S17 poté dochází k rychlé relaxaci na stavu S1 (v čase 1012-1013 s) a teprve poté následuje zářivý přechod na vyšší vibrační hladinu stavu S0 a další vibrační relaxace na rovnovážnou vibrační hladinu stavu S0
-   výjimky jsou důsledkem rozdílného geometrického uspořádání atomových jader v excitovaném a základním stavu
■   Stokesův posuv
-   rozdíl v energiích mezi maximy absorpčního a emisního pásu
SI »dováni a měření fluorescence
■    spektrofluorimetry - měří střední signál celého vzorku v kyvetě nebo v jamce mikrodestičky
■   fl iiorescenční mikroskopy - umožňují pozorovat fluorescenci dvojného trojrozměrných mikroskopických objektů
■   fluorescenční skenery (i "čtečky" mikrodesticek) - měří fluorescenci 2D makroskopických objektů (elektroforetické gely, bloty, chromatogramy)
■    průtokové cytometry - měří fluorescenci velkého množství jednotlivých buněk a umožňují identifikaci a separaci jejich subpopulací
■    měření relaxačních časů (pulzní, nebo fázový posun - frekvenčně modulované světlo)
■   fluorescenční korelační spektroskopie (FCS)
-   fluktuace intenzity F v mikroobjemu (10151) určeném fokusovaným laserovým excitačním paprskem
-   rychle difundující fluorofory - fluktuace fluorescence (nedochází ke zprůměrování), její časová závislost se analyzuje pomocí autokorelační funkce (informace o kinetice, difúzi, koncentraci molekul ve vzorku)
Rozdělení fluoroforů
■   vlastní (vnitřní, intrinsic) - přirozený výskyt
-  proteiny (Trp, Tyr, Phe), NADH, FAD, FMN, chorofyl
-  fykobiliproteiny, green fluorescent protein (GFP)
■   nevlastní (vnější, extrinsic) - přidávají se ke vzorkům, které samy nemají fluorescenční vlastnosti
■   fluoresceční značky (váží se kovalentně)
■   fluoresceční sondy (váží se nekovalentně)
-  fluorofory, jejichž kvantový výtěžek, případně i spektrální vlastnosti se výrazně mění po navázání na bílkoviny, nukleové kyseliny, membrány aj.
-  studium změn konformace, membránového potenciálu, polarity a viskozity prostředí
■   fluorescenční indikátory (chemické sondy)
-  spektrální vlastnosti nebo intenzita fluorescence jsou citlivé na přítomnost dalších látek - zjištění koncentrace
orescečníznačky
■   klasické: organická barviva, fluorescentní bílkoviny, cheláty lanthanidů
-  dobře rozpustné ve vodě, snadné použití, mnoho existujících protokolů a aktivovaných forem
-  ale široké spektrální pásy, náchylné na fotorozklad
■   moderní - polovodičové kvantové tečky, anorganické nanočástice dopované lanthanidy, nanočástice latexu a kremičitanu s navázanými fluorofory
-  díky pokroku v oblasti materiálových věd
Fluorescein
■    nejčastěji používaný fluorofor
-   výhody: vysoká absorbce, velké 0, nízká cena
-   exc. lze při 488 nm Ar laserem (kofokál. mikrosk., cytometrie)
■   fluorescein-5-isothiokyanát
-   FITC, 494/520, s-NH2 skupinou dává thiomočovinové uskupení
■   výhodnější je NHS-fluorescein
-   reaguje rychleji, stabilnější produkt
■    na -SH skupiny: 5-jodoacetamidofluorescein (5-IAF) a fluorescein-5-maleimid
■    na aldehydové či oxoskupiny:
-   fluorescein-5-thiosemikarbazid, dá hydrazonovou vazbu
-   použitelný např. pro značení cytosinův DNA či RNA po jejich aktivaci hydrogensiřičitanem
■    na sacharidové zbytky:
NHS-fluorescein
-   fluorescein-dichlorotriazin (DTAF), i na jiné biomolekul s volnými
alifatickými hydroxyly, také na tubulin
Problémy s fluoresceinem
■   náchylný na fotorozklad - signál vydrží pouze pár minut
■   pH závislost fluorescence - výrazně klesá signál pro pH pod 7
■   existence isomerů - může komplikovat geometrii vazby k proteinům, následně eluční časy v chromatografii, migraci v gelech
méně vhodný pro "ultracitlivé" aplikace
Rhodaminy
rhodamin 6G
strukturně podobné fluoresceinu, který doplňují
-   místo atomů kyslíku jsou na postranní cykly vázány dusíkové atomy
-   mohou nést různé substituenty a tím je dostupná široká škála variant emise probíhá při delších vlnových délkách ve srovnání s fluoresceinem
-   použitelné pro techniky s dvojím značením
-   vyšší fotostabilita a dobrá excitovatelnost světlem rtuťových výbojek
■   sulforhodamin B, jinak Lissamin rhodamin B
-   obsahuje na dolním aromatickém jádře dvě sulfoskupiny v polohách 3 (vpravo nahoře) a 5 (dole) (Imperial Chemical Industries)
■   sulforhodamin 101, Texas Red (Molecular Probes)
-   emitující nad 600 nm
■   tetramethylrhodamin-5-isothiokyanát (TRITC) resp. (TMR)
-   od tetramethylrhodaminu, nejběžnější značkovací činidlo z této skupiny, (544/570), £544=105 M cm1
-   reakce s aminoskupinou probíhá analogicky jako u FITC
-   karboxytetramethylrhodamin (TAMRA) další alternativa
■    NHS-rhodamin (5-karboxymethylrhodamin sukcinimidylester) (544 / 576)
■    karboxy-X-rhodamin (ROX) - značení oligonukleotidů, sekvenování
■    Lissamin Rhodamin B sulfonylchlorid (556 / 576)
-   má v 5-pozici reaktivní skupinu -S02CI - s -NH2 vzniká Sulfonamid
-   podobně existuje sulfonylchlorid i od Texas Red derivátu
■    na derivatizaci SH: tetramethylrhodamin-5-jodacetamid (540 / 567)
■    pro reakci s aldehydy Lissamin rhodamin B sulfonylhydrazin
-   má v 5 poloze skupinu -S02-NH-NH2) (560 / 585)
-   sulfonylhydrazin Texas Red emituje při delší vlnové délce (580 / 604)
Rhodaminy - zhodnocení
fluorescence v červené oblasti
vyšší stabilita než fluorescein
excitovat (při 520 nm) lze rtuťovou výbojkou
SO,H
SCXH
SO,H
SCXH
H,N.
Alexa Fluor
rhodaminový nebo kumarinový skelet doplněný o sulfoskupiny vyšší rozpustnost celá odstupňovaná řadu sloučenin s posunujícími se exc. a emis. maximy
napojení na značené biomolekuly probíhá v dolní části molekuly přes karboxyl v poloze 5 aktivovaný např. NHS skupinou - jsou přítomny i isomery se skupinou posunutou do polohy 6
COOH
Alexa 532
COOH
			1. Alana Fluor 405
	1 2	3 4 56 7  BS      10 1112 1314 15   IB 17 18                     B	2. Alexa Fluor 350 —
E=		A A- flf\   AA/ft A AAA         ľ\	3. Alexa Fluor 500
O LŮ		/ v\ /ä\ /y v/\ \/a\    / \	4. Alexa Fluor 4ÔB —
[ů		í \ \w n a V \ \\\      \	5. Alexa Fluor 430
E		í h \ \\   Kk\ A/V\ \       \	6. Alexa Fluor 514 —
03		f  \\ u \l / V M /V U \   /    \	7. Alexa Fluor 532
		/■■■ /\N ft/í w\V\/i U \ /	B. Alexa Fluor 555 —
S		v //■ / \ÍK W/AmA'uW     \	0. Alexa Fluor 546
g S!			10. Alexa Fluor 560 —
		Vi'' /     i\ V j\Tvi m/V \  \\ V          \	11. Alexa Fluor 534 —
=3		m  /       íf\ N Kä  / tLA^\   V \ A               \	12. Alexa Fluor610-
J_		ví\i    jj \ pj í/v /jísQ^ W v       \	13. Alexa Fluor 633—
		Jf^Ji^-dl   / oOÍ^/y^^^^i^ž^^ľ^--^    v	14. Alexa Fluor 635 -
		y s^-^É£ ^/    s^fä/äczCs.   ""'--^^?^>^ľ^^ľ-^	15. Alexa Fluor 647-
	400          450	500         550         600         650         700         750         BOO         «	Í0         16-Alexa Fluor 560-17. Alexa Fluor 680-
		Wavelength (nm)	15. Alexa Fluor 700 19. Alexi Fluor 750
Značení AlexaFluor	•   imunolokalizace ríbulosabisfosfát
—r-X—.	karboxylasy v 2.0 um řezu listu kukuřice (C4, separovány fotosynt. složky mezi mezofil a svazky cévní)
r,~..      i-^ďyyt.         >ŠA	- anti rubisco Ab, Alexa Fluor 488 kozí
-í     -i        A-     J        .~     "	Ab anti králičí IgG
■*§£f ,   -*&&        ^y	- autofluorescence chlorofylu (červeně, v mezofylových plastidech)
	-  lignin (matně zelený) v xylemu svazků
	-  kutin (jasně zelený) v kutikule vně epidermis
feSE%	■   periferní neurosystém embrya Drosophily:
	-  mAb 22c10 anti mikrotubuly, Alexa Fluor 488 králičí Ab anti-myší IgG
*   %	- dělící se buňky - Ab anti histon-H3, Alexa Fluor 594 kozí Ab anti králičí
1                           Blhw i'   ^! **% *   '2	IgG
J	- jádra DAPI (modrá fluorescence)
Kumariny
4-methyl -7-hydroxykumari n excitace^.             f\   emise
kumarin = 2H-1-benzopyran-2-on je přírodní látka 7-amino-4-methylkumarinové deriváty, zejména 7-amino-4-methylkumarin-3-octová kyselina (AMCA) (345 / 450)
-   pro-NH2AMCA-NHS
-   pro-SH AMCA-HPDP
-   pro aldehydy AMCA-hydrazid 7-diethylamino-3-[(4'-(jodacetyl)amino)-fenyl]--4-methylkumarin (DCIA)
-   velmi intenzívní fluorescence (382 / 472)
-   na světle nestabilní
300 350 400 450 500 550 _______WA
BODIPY
o'    "    9
BODIPY FL C3 SE                   \/^
BODIPY 530/550 C3
4,4-difluoro-4-bor-3a,4a-diaza-s-indacen
-   nemá ionizovatelné skupiny - málo ovlivněn pH
-   vysoké absorbance a vysoké kvantové výtěžky fluorescence
-   menší komplikací jsou malé Stokesovy posuny pod 20 nm modifikace v krajních polohách postranních cyklopentadienů
-   deriváty s posunutými spektrálními charakteristikami
-   pro -NH2 existuje BODIPY FL C3 SE s postranní NHS skupinou (502 / 510)
-   komplikací je vzájemné zhášení, pokud je stupeň substituce vyšší
-   dostupné deriváty s jodacetamidovou a hydrazidovou skupinou deriváty BODIPY 530/550 C3-X - maxima k vyšším vlnovým délkám
-   přítomnosti objemných aromatických postranních substituentů
-   reaktivní skupinou X může být NHS nebo hydrazid bromderivát Br BODIPYpro substituce sulfhydrylových skupin
£3JSS«d« biu3
od sulfonovaného pyranu
-   vlastnostmi vhodně doplňuje fluorescein při multiznačení
-   výborná rozpustnost ve vodě
-   dobré kvantové výtěžky (kolem 50%)
-   malá úroveň vzájemného zhášení při vyšších substitučních poměrech
-   mateřská sloučenina má na horním jádře vpravo pouze methoxyskupinu. pro značení aminoskupin - acetylazidový derivát (375+400 /410)
-   při vyšších teplotách - kolem 80 °C v DMF probíhá přesmyk azidového uskupení na isokyanátovou formu a odštěpí se molekula dusíku
-   isokyanát reaguje s volnými hydroxyly, vzniká urethanové uskupení
-   další formy mají v postranní části hydrazinový, ethylendiaminový nebo kadaverinový (pentamethylendiaminový) zbytek
Lucifer yellow
základní sloučeninu z = H deriváty 4-aminonaftalimid--3,6 disulfonátu napojení se realizuje přes horní imidový atom dusíku
-  jodacetamidový derivát (na -SH)
-   hydrazidová skupina (Lucifer Yellow CH, na aldehydy)
-   optické parametry (427 / 530) především v cytochemii
Cyaninové fluorofory
>   velmi populární zejména v oblasti DNA biočipů využívajících cDNA fragmenty jako imobilizované próby
■   základem je indokarbocyaninový skelet
- je sulfonován, obě aromatické části jsou spojeny uhlíkatým můstkem s konjugovaným systémem dvojných vazeb (methin)
>   je k dispozici odstupňovaná řada fluoroforu (Amersham Biosci.)
kontrola Cy3
překryvový signál (oba kanály)
Cyaniny - zhodnocuj j
délka polyenového spojovacího řetězce
-  monomethinove sloučeniny - thiazol orange (TO), oxazolle yellow (YO) nebo jejich dimery (TOTO, YOYO) -fluoreskují po vazbě na nukleové kyseliny (fluorescenční sondy)
-  polymethinové sloučeniny - Cy3, Cy5,...
-  délka spoj. řetězce, resp. počet vinylenových -CH=CH- skupin působí bathochromní posun o cca 100 nm -fluorofory emitující až v NIR oblasti
výhody NIR fluorescence
-  není zde už autofluorescence biologických složek - vyšší citlivosti
-  méně nákladná instrumentace, excitace při delších vlnových délkách
problémy
-  úzké excitační pásy, fotorozklad, menší intenzita v NIR
Atto
vysoká absorbce a výtěžek, fotostabilita modifikace oligonukleotidů
několik typů struktur na bázi kumarinu, rhodaminu,...     (Atto-Tec)____________
_.               .    Absorption Fluorescent _                    max. Dye                [nm]		Emission max. [nm]	Extinction coefficient [cm"1 M-1]
Atto 39C              390		479	24.000
Atto 425            436		484	45.000
Atto 465            453		508	75.000
Atto 495	495	527	80.000
Atto 488	501	523	90.000
Atto 520            51S		538	110.000
Atto 532	532	554	115.000
Atto 550	554	579	120.000
Atto 565	563	592	120.000
Atto 590	594	624	120.000
Atto 594	601	627	120.000
A*) 620            619		643	120.000
Atto «3            629		657	130.000
Atto 64/ H            644		669	150.000
Atto 655            663		684	125.000
Trojnásobné značeni endotheliálních buněk (HUVAC): von Willebrand faktor - Atto 550 znač. Ab (zelené), kadherin - Atto 655 zanč. Ab (červeně) a jádra DAPI (modře)
Fluorogeuuj substráty hydrolas
deriváty fluoresceinu, např. fluoresceindifosfát pro ALP
deriváty resorufinu
rhodamin 110, bis-(A/-CBZ-L-argininamid) (BZAR), pro serinové proteinasy, (496 / 520) cca 100x citlivější než sloučeniny založené na AMC
jiný příklad - rhodamin 110, bis-(A/-CBZ-L-fenylalanyl-L-arginin amid) (Z-FR-R110) pro cysteinové proteinasy katepsin B a L
Fluorogenní enzymové substráty
Ck /,0
H20
Ck /O
H3P04
4-methylumbelliferylfosfát (MUP), po hydrolyse fosfatasou vzniká 4-methyl-7-hydroxykumarin (methylumbelliferol), modrá fluorescence, (360 / 450)
deriváty 7-amino-4-methylumbelliferolu (Z-X-AMC nebo Z-X-MCA), AMC produkt (342 / 441), např. 7-amino-4-methylkumarin A/-CBZ-L-fenylalanyl-L-argininamid (Z-FR-AMC) pro stanovení serinových proteinas a plasminu, kalikreinu, katepsinu), nebo 7-amino-4-methylkumarin, A/-CBZ-L-aspartyl-L-glutamyl-L-valyl-L-asparagylamid (Z-DEVD-AMC) pro kaspasu 3
alternativně deriváty 7-amino-4-trifluoromethylkumarinu, např. Z-DEVD-AFC
A/-CBZ-je W-benzyloxykarbonyl-
Lanthanidové komplexy
Eu3+ a Sm3+ ve formě chelátových komplexů
-   atraktivní fluorescenční značky vhodné pro časově rozlišenou fluorescenci („time-resolved fluorescence", TRF)
pro "přichycení"k biomolekulám slouží N1-(p-isothiokyanatobenzyl)-
diethylen-triamin-N1,N2,N3,N3-tetraoctová kyselina (DTTA)
která se může vázat na aminoskupiny za vzniku thiomočovinového
uskupení.
takto připravené komplexotvorné místo pak váže iont lanthanidu a
získá se intenzivně fluoreskující značka s relativně dlouhou dobou
záření po excitaci
-   při pulzní excitaci se vyčká, až vymizí či vyhasne nespecifická fluorescence pozadí, případně rozptýlené záření, a až pak se po krátké prodlevě změří fluorescence značky
-   lze použít i další lanthanidy, např. terbium a dysprosium
-   proces pod názvem DELFIA zavedla finská firma Wallac Oy
Další chelátové struktury
OCH,
N^           EU-3         r^
C00'  C00'                          C00"   CÜO-
■   kryptát
terpyridin
chelát s anténou
TRF měření
■   cheláty lanthanidů (Eu, Srn, Dy)
-   dlouhá životnost excitovaného stavu
-   velké Stokesovy posuny
Excitation
45C          500          550          COO           450 -----Dy*"                -----Eu**                -----Sni**
400                     800       1000
Time his)
kvantové tečky
1   moderní fluoreskující polovodičové nanokrystaly
1   QD, "quantum dots" jsou menší než 10 nm a svým kvantovým
chováním se nachází mezi polovodiči a izolovanými atomy 1   polovodiče - valenční a vodivostní energ. hladiny odděleny o £g
-   excitace - elektron přejde do vodivostní hladiny a zanechá za sebou kladně nabitou díru ve valenční hladině
-   prostorová separace tohoto páru ("exciton") odpovídá Bohrovu průměru a je typicky 1 až 10 nm
1   QD mají obdobnou velikost
-   excitony jsou v nich ohraničeny podobně jako chování částice v uzavřeném prostoru
-   energetické hladiny připomínají atomy či molekuly
-   optické vlastnosti závisí na velikosti
ľ.
ECM>
UJMO
bulk
seniccnducla
L|uaii(iu)l dut
-H-
iiulocuk
Fotoluminiscence u QD
■   vzniká radiační rekombinací excitonů, spektrální vlastnosti jsou „laditelné" změnou velikosti částic
-   např. u CdSe nanokrystalů lze emisi nastavit od 450 do 650 nm
-   menší QD jsou „modřejší" (hypsochromní efekt)
■   výhody nanoteček oproti klasickým fluoroforům zahrnují
-   vysoký jas (20x vyšší proti jiným typům, daný velkým kvantovým výtěžkem a vysokým extinkčním koeficientem)
-   úzké emisní pásy pod 30 nm, velké Stokesovy posuny - částice obsahujících různě barevné QD v různých poměrech, čímž vzniká chemický „čárový kód" umožňující identifikaci v komplexních směsích
-   velmi stabilní a nepodléhají fotodegradaci (často se chrání proti fotooxidaci pláštěm z polymerů nebo jiných polovodičů (např. CdSe povlečený ZnS nebo silikátem)
-   široké absorbční pásy - různě barevné QD lze excitovat stejným zdrojem světla a jednoduše tak vyhodnocovat současně různé značení odlišnými barvami při multiplexních stanoveních
■    pro konjugaci s biomolekulami se nanáší reaktivní vrstvy jako tri-n-oktylfosfinoxid (TOPO) nebo hexadecylamin
Kvantové tečky (<uD)

■-a"
"" Ir-"/"-'''
ni


unikátní fluorescenční
vlastnosti - stabilita vůči
fotorozkladu, velké
Stokesovy posuny
CdTe jádro obalené CdS,
rozpustnost díky vazbě thioglykolové kys. (TGA)
prekurzory - Te, CdCI2, TGA a NaBH4
-   NaHTe připraven redukcí Te pomocí NaHB4
-   nástřik roztoku NaHTe do směsi CdCI2 a TGA v inertní atmosféře
-   refluxace na vzduchu (minuty až hodiny)
při zahřívání roste průměr QD, emisní maximum se posouvá k delším vln. délkám větší QD mají lepší stabilitu
í:;:
Tffl» Š    «CO
ť
C
5í    «M
Ex: 465-520 nm E m: 523^20 nm
Ex; 360-J40 nm Em: 620 740 nm
sensitivity 110                   sensitivity 110
quíntinn doljluorticrfrt«
NLiarflíiĽoiŕi nuftrc-s-LB-ri
Vlastnosti QD
Nanočástice s fluorofory
1 optické kódování na základě multiplexování vln. délek
1 polymer, uvnitř směsi různě fluoreskujících QD - charakt. spektrum
1    možnost identifikace cílových biomolekul ve směsích při užití kombinatorických postupů
A       OOO       A
i        tíOO        B
b              e
B
c
0    %%    o**1*""»j ig^
1
c
D
D                 D
Wavelength
obiliproteiny
intenzivně fluoreskující proteiny z fotosyntetického aparátu eukaryot, modrozelených a červených sinic, řas a cyanobakterií nativní nefluoreskují, ale excitační energii předávají na chlorofyly purifikované fluoreskují s výtěžky kolem 100%
-   obsahují několik bilinových chromoforů (např. B-fykoerithrin 34)
-  to v souhrnu poskytuje vysoké extinkční koeficienty pro celou molekulu
-   fluorescenční výtěžky se blíží 30 fluoresceinům nebo 100 rhodaminům
-   fluorescence není externě zhášená
-   dostupnost mnoha konjugačních míst
-   v prodeji jako konjugáty se streptavidinem nebo biotinem
	Název	Zdroj	Složení	(kDa)	Počet bilinů	Aex 1 nem (nm)	E(10BM"' cm"1)	
	B-fykoerythrin	Porphyrídium omentum	(aß)eV	240	34	546 / 575	2,4	
	R-fykoerythrin	Gastroclonium coulteri	(aß)eV	240	34	566 / 574	2,0	
	C-fykocyanin	Anabaeba variabilis	(aß)2	72	4	614/643	0,58	
	allofykocyanin	Anabaeba variabilis	(aß)3	110	6	650 / 660	0,70	
	CryptoFluor Crimson	cryptomonad algae		40,2		585 / 658		
	CryptoFluor Gold	cryptomonad algae		30,8		566 / 600		
								
Zelený fluoresceční protein
"green fluorescent protein", GFP - z bioluminiscentní medúzky (Aequrea victoria, jellyfish), 26 kDa
chromofor - p-hydroxybenzyliden-imidazolidinon, vniká cyklizací a oxidací aa zbytků Ser-Tyr-Gly:
TV166        0      Qiyfjj                                                             O                                                                           O
y\ s«re5
H        OH
H       OH
mutagenezi získány vylepšené varianty - široké použití pro značení
-   divoký typ, směs fenolu a fenolátu
-   fenolátový anion
-   fenol
-   fenolátový anion s přidruženým pí-elektronovým systémem
-   indol (Trp místo Tyr)
-   imidazol (His místo Tyr)
-   fenyl (Phe místo Tyr)
'r>Ol\±YÚ  Z?rr>
■   biologická značka pro sledování a kvantifikaci exprimovaných bílkovin
■   studium protein-protein interakcí
■   interní buněčný "biosensor" pro sledování signálů
'  rekombinantní techniky - spojení GFP se sekvencí jiné bílkoviny - chiméry - sledování lokalizace a pohybu bílkovin v buňkách
zelené myši a podobné
Fluores^uční polarizace (FP)
T(i«erot       • x)               Tf,»e™i
založena na velikosti rotačního pohybu molekul
v protikladu jsou doba života rf, a rychlost pohybu 0rot fluoroforu
excitace se provádí polarizovaným
světlem, tj. excitují se-ponze—
fluorofory vhodně oiientované
vůči rovině světla
pokud bude životnost
exc. stavu mnohem
kratší, než rotace,
tak si excitované mole-        « <-Y~r~m
kuly zachovají orienlaci 0^* o>ľ» °co
a bude emitováno      J2^ áS
polarizované zářen
pokud bude životnost
exc. stavu dlouhá, porusT
se orientace molekul a
nastane depolarizace
/

\
polarizované
depolarizované
emitované záření
FP a mobilita molekul
FP v nepřítomnosti rotační difuse

yp,
.\
1 + -
v   e
j
0 =
T]V _ T]Mr
kT ~ RT
(v+h)
alternativní vyjádření rotace pomocí
viskosity a molekulárního objemu V,
lze dále zavést molekulovou hmotnost
spec. objem bílkoviny v a hydrataci h
(typ. 0.2 g vody na 1 g proteinu)
v praxi jsou díky hydrataci a nesférickému tvaru korelační časy 6 asi
2x větší než odvozené pro kouli v suchém stavu (např. HSA, M= 65
kDa, Ai=1,9 vychází 6 kolem 50 ns)
Polarizátor
■   světlo po průchodu polarizátorem osciluje pouze v jedné rovině
■   dichroické systémy - adsorbují jednu z obou rovin polarizace (film z orientovaného PVA dopovaná jódem), málo efektivní v UV oblasti
■   krystaly kalcitu vykazující dvojitou refrakci - rozptylují různě obě roviny polarizace (Nicol a Glan polarizátory, Wollastonův hranol)
vzorek
Měření FP
zdroj světla
■   změří se horizontální a vertikální složky emitovaného záření
■    polarizace se vypočte podle vztahu: bývá od -0.25 po 0.5
■   alternativně se používá anisotropic r.
■    obě veličiny jsou zaměnitelné (vnitřně souvisí)
jako tracer fungují konjugáty malých molekul (peptidy, léčiva, pesticidy,...), které jsou pomocí vhodného můstku (linker) spojeny s fluoroforem (fluorescein, rhodamin)
FRET Förster emery y resonance transfer
přenos energie zářivými nebo nezářivými mechanismy mezi dvěma chrom ofory
-   zářivý (triviální) přenos - excitovaná molekula donoru emituje záření, které je absorbováno molekulou akceptoru
-   nezářivý přenos energie (FRET) - ve směsi molekul dochází k absorpci pouze molekulami donoru, avšak konečným výsledkem je excitovaná molekula akceptoru (chromofor, budící záření sám neabsorbuje)
-   nedochází k emisi světla donorem
^
absorbce donoru
<.{:
neradiačni přechody
■■-S
......►
rezonanční přenos
ti
«.{;
emise akceptoru
donor
akceptor
n     Distance and Energy Transfer Efficiency
S í 100
í"
o E
'S so
u
J».
-	^L Fůrattť D&tance Y
-	\     Transfer I \   Efficiency
I           4           1            t
Distance (r. In Nanometers)
10
E            l            1	ť            F' L   D   _ 1 _ i__D_ TD                   FD
r ■♦(%)''	
Efektivita FRET
dána poměrem vzdálenosti r mezi D a A a Forsterova poloměru r0, nebo alternativně poměry doby t nebo intenzity F fluorescence donoru bez (t, F) a v přítomnosti (t' ,P) akceptoru, závisí dále na:
-   vzdálenosti mezi donorem a akceptorem
-   speltrální překryv emisního pásu donoru a absobčního pásu akceptoru
-   vzájemné relativní orientaci dipólů donoru a akceptoru
pravděpodobnost rezonančního přenosu energie určuje kDA
-   určující složkou je dipól-dipólový přenos energie
-   Forsterův vzorec (v případě slabé vazby, kdy vzájemné interakce donoru a akceptoru neovlivní optická spektra)
-   rD - doba dohasínaní fluorescence donoru, r0 - vzdálenost, ve které je pravděpodobnost přenosu energie rovna pravděpodobnosti vnitřní deaktivace vzbuzeného stavu molekuly, rDA - vzdálenost mezi donorem a akceptorem
	lTr Y		
k   --			
			
	TD   V rDA )		
FRET uspořádání
donor - fluorescenční skupina (fluorofor) akceptor - zhášející skupina (quencher)
hydrolysa vhodné skupiny ve spojovacím můstku I m I nezářivý přenos energie na blízkou skupinu akceptoru                 |
ŽÁDNÁ FLUORESCENCE
\
2
oddálení - není přenos energie
NASTUP ŕ      FLUORESCENCE
"molecular beacon"
komplementární DNA (target)
FRET - ifhodné skupiny
HCL
„OH
R I
o=s=o
^„
FAM
dansyl
cr    r
H.C        CH,
fluorofory (donory, R značí napojení na další část molekuly)
(CH3)2N
DNP
N(CH3)2
=\         ,N
(CH3)2N
O
TMR
lo-R
DABSYL
cr    r
zhášeče (akceptory)

Vícenásobné značení -detekce mufcjüj
	Targets WT-C                       MUT-G                    MUT-A                    MUT-T		
FAM (G) AL350 (T) e iZ TMR (C) CY5 (A)	LÍH	(c)	(d)
	M                                           O	tg}	(h)
	mi2	W	(1)
	M                                (n)	to)	w
			
FISH fluorescence in situ hybridization
'Acceptor''
molecular"
beacon
Quencher            —
Donor Dye
\................
i  i  i  i.............TTT
#0
FRET      Acceptor dye
Oft
Quencher
I I I I t...........'.' i
mRNA large!
dual molecular beacon - vyšší specifita - obě proby musí hybridizovat s cílovými místy, technika "adjacent probes"
Real time PCR
■   zviditelnění průběhu pomocí MB
-   95 °C denaturace
-   65 °C annealing, přisednutí primem a MB = fluorescence
-   72 °C prodloužení vláken
2000
1   1000
10    20   30    40    50    60 Thermal Cycles
revers* primer    s .
forward primár   r/.
mol ecu ar beacon
9
-------------   I I I I LIJ V*1
(monitor fluoreacence)

FRET: in vivo interakce biom
separované biomolekuly		
BFP        rggaS excitace      *fiP při 380 nm    ^SS	■       +	jjjBftgfa      GFP '   bez emise MjS    Ö$>   pri 510 nm
BFP B	J	fji    GFP asociace
BFP                   9 excitace               ■ při 380 nm		m    GFP H^^     nástup emise při 510 nm
		
FRET imaging v mikroskopjj
lokalizace a vzdálenosti biomolekul v buňce

..
Fluorescence
Ro«onance
Energy Tranífcí
{FRET} Micros top*
Configuration
CímíI eif íí en lil
ifH«iinfnm CCß Comer j
Sv'......-
NlůKrw CůflíůdU    TImu» Cullura
	
Gene-PIN	CCGCT T                  A A                   Q                       GACGTAGGCGATCTAAT c                   A                    -CTGCATCCGCTAGATTAg C-G                  C                                                                 ü C-G
■    oligonukleotid - "inte komplementární k cíl ■    na jednom konci má fluoroforu ■   v roztoku tedy vytvoi přiblíží ke guaninový ■   v přítomnosti cílové ! fluorescence ■   výhody: jednoducho	ligentní" DNA proba obsahující sekvenci ové sekvenci v analyzovaném vzorku řadu G, na druhém konci řadu C a navíc skupinu !í vlasenkovou strukturu, v níž se fluorofor m zbytkům, které fungují jako zhášeč sekvence se vlásenka otevře a objeví se st, rychlost, citlivost (107až 1012 M)
Xtrochemiluminescence (ECL)
1   chemiluminescence jako výsledek elektrochemické reakce, ze stabilního prekurzoru na povrchu elektrody vytvořen vysoce reaktivní prvek, který reaguje za tvorby světelného záblesku
1   chemiluminiscentní reakce, která vede k emisi fotonu z ruthenioveho komplexu, je iniciována elektricky, spíše než chemicky
1   realizace ECL na povrchu elektrody umožňuje přesnou prostorovou kontrolu procesu, včetně zapnutí a vypnutí (ON / OFF), PMT detektor je prostorově velmi blízko
1   hlavní výsledek je intenzita světelného toku, podružnou informací je závislost proudové odezvy elektrody
1   vhodné i pro velmi nestabilní látky (generování in situ)
>    možnost recyklování - zesilovací účinek
>    ECL lze provést i s luminolem
>    komplexy ruthenia s bipyridinem, [Ru(bpy)3]2+
>   technologie se využívá v imunoanalyzátorech firmy Roche
7
6;
Systém Bioveris
620 n m                                                Luminiscence
emise světla
*Ru(bpy}3=*
TPA'
.r
Ru(bpy)^- -                 --RulbwJj^-TPA- -                            TPA"
f
e-     Electrode                           *■/ . -----------------------------------^     iniciace
Chemi-předání chem. energie
Elektro-elektrochemická
Ru(bpy)3!+(1) = BV-TAG"                TPA = Tripropylamine
ruthenium a TPA jsou oxidovány po aplikaci napětí na elektrodu radikál TPA + ztrácí proton, redukuje Ru3+ na Ru2+, které z excitovaného stavu přechází do základního za vyzáření fotonu Ru se nespotřebovává - recykluje se - zesilovací mechanismus
- zvýšení citlivosti stanovení
BioVeris tag
stabilní neizotopická značka různé formy pro biomolekuly:
-   BV-Tag-NHS-ester
-   BV-Tag-fosforamid
-   BV-Tag-maleimid
-   BV-Tag-hydrazid
-   BV-Tag-amin
aminy (bílkoviny)
fosfoskupiny (nukleové kyseliny)
thioly
sacharidy
karboxyly
podobný je systém ELECSYS
obvykle kombinováno se záchytem pomocí magnetického nosiče
V°-#-^
Biotin a (strept)avidin
široce používáno pro přípravu konjugátů, značení a imobilizace
-   1927 - objeveno, že krysy krmené bílkem dostanou dermatitídu
-   1940 tu odstraní vitamin H
-   1941 efekt přiřazen avidinu a objevena vysoká afinita avidinu k biotinu
-   1976 praktické využití interakce pro značení - Wilchek
Biotin / avid ju
velmi pevná interakce, KD= 1.3 x 10-15 M odolnost komplexu - stabilní v 8 M guanidinu při pH 5, disociuje až při pH sníženém na 1.5
biotin. vitamin B7, vitamin H
avidin
-  tetramer (4 x 16.4 = 58 kDa)
-   každá podjednotka má vazebné místo pro biotin
-   glykoprotein, pl 9.5, izoluje se z vaječného bílku
streptavidin
-   obdobný (tetramer 4x15 kDa), ale strukturně i co do aa složení odlišný od avidinu
-   pl 5-6 - menší celkový náboj - méně nespecifických interakcí
-   ze Streptomyces avidinii
-   výhodou mnohem menší nespecifické interakce
neutravidin
-   deglykosylovaná forma avidinu (nevadí lektiny), pl 6.3
avidin
J       2
streptavidin
10
20
30 _JÜ_
40
50
SO
J&_
ÄVD SA
AVD SA
ARKCSLTGKW
EAGITGTW . ** *
70
MT IG AVNS RGE FTGTSlHAVígäSN EIKESPLHGTQNTINKRTQPTFGFT FIVT AG - ADG ALTGTaEgAVGgÄE SRYVLTGRYDSAPATDG- SGTALGWT
80
90
J5_
100
110
120
VtjffiK------j^E&lffivraTGQCFIDRNGKEVLKTUffiliLRSSVNDIGDDffiKATRVGlffllFTRLRTQKE
VAgKMNYRÍ)AH§A0T2sGQYVGGAEAK--INTCgLLTSGTTEA-NA5KSTLVGH3TFTKVKPSAA
Petailyvazebného místa
avidin
N118
F79
1
\AIQ-J       """      T"*        J   /     1     A.                        :*1
T 77
7&
VT-'/-
.V37
^wiifŕ ■■
/t38
S 75
T40
S73
streptavidin   n23
D1Z8
S45       W*>
'ioi ■
Reverzibilita komplexu
\|—i    r—[j/      : lze přerušit X*   y' nelze
K33
ze přerušit
interakce mezi biotinem a avidinem za normálních podmínek nelze přerušit imobilizace různých biotinvlovanvch biomolekul na avidinovaný povrch
nitroayidin - připraví se
nitrací tyrosinových zbytků v avidinu (volný nebo imobilizovaný) pomocí tetranitromethanu interakci mezi biotinem a nitroavidinem lze narušit nadbytkem biotinu nebo při pH10
Biotinylace - lysin, ev. jiné -NHj
NHS-biotin    hn    nh
OH
NHS      9
HN        NH
R-NH.
■    alternativně lépe rozpustný
nebo s delším spacerem:
Sulfo-NHS-biotin
HN        NH
SCLH
NHS-LC-biotin: (i sulfo varianta)
-------T~
1.35 nm
HN        NH
Biotinylace -SH
maleimido-propionylbiocytin
HN        NH
R-SH
O
O
R-S
N-[6-(biotinamido)hexyl]-3'-(2'-pyridyldithio)propionamid biotin-HPDP
o
X
HN        NH
R-SH
R-S-S-
iÍJDÍJljyJ2Ji;y  =32JCÍJ2J/JXJŮ
			0 A HN        NH
biocytin-hydrazid			
H2N\,		H	-^\^\s/
CT	"NH-NH2	0	
po oxidaci jodistanem na aldehyd
s CDI účinkuje i na Asp a Glu
Biotinylace Tyr, His
diazobenzoyl-biocytin
o
HN        NH
COOH
Fotobiotin
N-(4-azido-2-nitrofenyl)-aminopropyl--N'-(N-D-biotinyl-3-aminopropyl)-N'-        ...... ,
-methyl-1,3-propandiamin
R-NH0
fotoaktivace, expanze kruhu
Modifikace
B88,B
B
genetické manipulace
-  mutace Y33H - pH-nastavitelná vazba biotinu
-  monovalentní protein (N23A, S27D, S45A) - odstranění crosslink interakcí
cílená kovalentní vazba polymerů reagujících na stimuly
-  "molecular switches" - reakce na podněty - teplota, pH, světlo,.. změnou konformace
-  "smart polymers" fúzní chimérické proteiny
-  dvojí afinita
-  "single-chain"
Change in pH. light or temperature
Mimuli-resnnsive               >rÄ
streptavidin conjugates     fônfäí}      B i--------------------------►    B
B
B ■
B
ti
Existující a budoucí možnosti
-Combining other functions to Changed binding activities
-Noveil binding specificities
*-<:■ ~Catalytlcally active streptavidin -More stable avidin
-Du.il-.iľfinily pvldEn»
-Faster biotiri-bindmg
kinetics -Increased affjnľty             G
Iriw.irrK l.iliľlli-fl  biofiri     .y
-R..'i (iriiuiM.Mil  \^^•.\■.'.•'u\  iiuriht .11 im: -Specific immobilization -Targeted gene therapy -Enhanced binding activities
-Enhanced scaffold* ^£ ^ tt-for nanotechnology^t ^tij y
Fii«lnn                  -Combining other functions
proteins                  to t>iolln blndlllfl' llhe
epitope recognition and
enzymatic activities
-Probe and enzyme immobilisation
Di rected / rand om mutagenesis
^
&4q
■Screening residues           ^Jft n? dft.
important fůr property      if ^£ V^ engineered in each case jjt\ "iff
-Identification Of Structurally
important residues -Affinity maturation for a peptide ligand
(streptag and streptavidin)
-Optimization of properties acquired by other methods
-Affinity maturation fůr other
type or new Ngands hke small moleculesj peptides and nucleic acids
m
-Incorporation offiuorescent amino acid In the Streptavidin polypeptide
-Specific binding nf multiple [up to four) Itgands Into one tstrept)a vidin molecule -Scaffold structures for nanotechnology
-Immobilisation & labelling methods -Modulation Of l::i::i n:| affinity -Control nf oligamerisatinn and stability -Modification of physicochemieal properties
Radioaktivní značení
sledování radioaktivně označené bílkoviny, nukleové kyseliny, substrátu nebo produktu enzymové reakce používané sloučeniny:
-  jednoduché - 14C02,3H20,35S042
-   uniformě značené - [14C] alanin, [14C] ethanol
-   specificky značené L-[methyl-14C] methionin, [methyl-3H] thymin jednotky: Bequerel ~ s_1 (dle SI), Curie ~ 1 g 226Ra, (|jCi - mCi v praxi) detektory
-   ionizační (Geiger-Mullerova trubice)              -scintilační
-   polovodičové skenery                                     -fotografický materiál separace rad. produktu
-   precipitací, extrakce
-   vývoj nebo inkorporace rad. plynu nebo těkavé látky
-   elektroforesa, papírová nebo tenkovrstevná chromatografie
výhody: přesnost, chemická identita, měření radioaktivity nezávisí na
formě a podmínkách
problémy: nákladné vybavení i reagencie, pracovní rizika
Radioaktivní značení
vysoce citlivé z hlediska detekce
komplikací je striktní dodržování zásad bezpečnosti práce s radioaktivním materiálem a získání potřebného oprávnění pro značení biomolekul přichází do úvahy řada izotopů: ß zářiče - 14C, 32P, 35S a 3H
-   slabé záření vyžaduje použití scintilačních činidel Y zářiče -131l a 125l
-   lepší z hlediska citlivosti detekce sledovatelne přímo s několikařadově lepší odezvou
131l má velmi silné záření a zejména krátký poločas (8,1 dne)
-   obojí je nevýhodné
125l má delší poločas rozpadu (60 dní) a je slabší zářič
Jodace
lze využít přímo vodný roztok l2, který obsahuje reaktivní formu H2OI+, vznikající v důsledku rovnovážných reakcí
dochází k substituci aktivovaných aromatických jader tyrozinu (mono
i disubstituce) a histidinu
mohou být najodovány některé uměle vnesené skupiny
jodace obvykle snižuje rozpustnost bílkovin
doba reakce určuje stupeň jodace
ukončí se přidáním redukčního činidla, např. dithioničitanu
l2 + H20   -               H2OI+ + I-
H2OI+
N^.N
N^NH I
OH
H2OI+
OH
OH
Jodační činidla
■   pro oxidaci jodidu se používá nejčastěji chloramin T
dostupný i v imobilizované formě na polystyrénových částicích jako tzv. IODO-BEADS (Pierce)
-   výhodou je pomalejší reakce a lepší kontrola průběhu a stupně jodace IODO-GEN
-   1,3,4,6-tetrachloro-3a,6a-difenylglykouril
-   nerozpustný ve vodě, potáhne se jím povrch pracovní nádoby
laktoperoxidasová jodace
-   nosič s imobilizovanou glukosa oxidasou (generuje s glukosou peroxid vodíku) a laktoperoxidasou -oxiduje Jodid na jod
		0		
	ckX,		XI	
(	v	-H-	f	->
	cK \S    ci			
		0		
Bolton-Hunterovo činidlo
>    často efektivnější než přímá jodace
>    když nejsou k dispozici volné tyrosinové zbytky
>    napřed se najoduje činidlo, to se pak konjuguje s bílkovinou
Radioaktivně značené protilátky
■    cílené rádioterapeutické aplikace
■    radionuklidy - 212Bi, 88Y, 90Y, "Tc, 67Cu, 186Re, 188Re, 66Ga, 67Ga, 111ln, 114ln, 115ln
■    přímé metody
-  jodace, interakce kovů s povrchovými -SH skupinami
■    nepřímé
-   zavedení chelátových skupin komplexujících ionty kovů
-   BCA, "afunctional chelating agents"
-   DTPA, diethylentetraaminpentaoctová kyselina - na bázi dianhydridu pro derivatizaci -NH2 skupiny
Liposomy
■    poprvé popsal Bangham v roce 1965
■   široké uplatnění v bioanalytických aplikacích, jako nosičů terapeutických prostředků nebo vakcín, kosmetický průmysl
■   spontánně vznikající sférické lipidové struktury sestávající z fosfolipidových dvojvrstev (jedna nebo několik) tvořených amfifilními molekulami -
- mohou být přítomny také např. cholesterol, mastné kyseliny nebo další látky důležité pro funkcionalizaci povrchu liposomů
■   amfifilní molekuly na rozhraní fází - voda / vzduch - vytváří orientovanou strukturu monovrstvy, kdy polární části molekuly směřují do vodné fáze a nepolární do prostředí vzduchu
■    mezi jednotlivými dvojvrstvami je uzavřena vodná fáze - může obsahovat hydrofilní látky, do lipidové dvojvrstvy lze vpravit hydrofobní látky
Vrstvy a micely
■   lipidová dvojvrstva sestává ze dvou monovrstev nad sebou orientovaných tak, že nepolární části jsou uvnitř struktury, kde navzájem interagují - základem přirozených biomembránových struktur
■   sbalením monovrstvy do kulovitého tvaru vzniká micela (ve vodném
prostředí) nebo obrácená (invertovaná)              i-----------------------------
micela (v nevodném prostředí)                                       rOuTK
Uzavřené struktury
■   sbalením dvojvrstvy do sférické struktury vznikají membránové váčky (vesikly) - liposomy, které uvnitř obsahují vodnou fázi
■    nejjednodušší jsou unilamelární (ULV) v praxi nejvhodnější
-   20 až 50 nm - SUV, „small unilamellar vesicles", velké zakřivení povrchu
-   od 100 nm až do asi 1 um LUV, „large ..."
-   1 až 200 um GUV, „giant..."
■    multilamelární (MLV, připravují se nejsnadněji a jsou stabilnější), až 20 um, uspořádány koncentricky i nekoncentricky
'   multivesikulární (MVV) - obsahují uvnitř několik vesiklů
7�25290�6994
Příprava liposomů
■     rozpuštění směsi lipidů v org. rozpouštědle (chloroform:methanol, 2:1)
-   lze použít i rozpouštědla mísítelná s vodou, zejména ethanol; nejsou v něm ale rozpustné všechny lipidy potřebné pro přípravu liposomů
■     rozptýlení ve vodné fázi
-   po odpaření rozpouštědle ve vodné fázi se dá využít mechanické protřepávání, vysokotlaká emulzifikace, ozvučování, protlačování membránou s póry (extruze) nebo opakované zmrazovaní / rozmrazování - vznikají různé druhy liposomů
-   přidání detergentů, které proces disperze usnadní dočasným maskováním nepolárních částí (Triton X-100, cholát, oktylglukosid)
-   přidání chaotropních činidel (močovina, guanidin HCl, thiokyanát, nitrát)
■     izolaci žádané frakce z populace liposomů
■     separace nadbytečných modifikujících látek nezachycených uvnitř liposomů,
-   gelová filtrace (Sephadex G-50) nebo dialýza
-   pro velikostní frakcionaci liposomů (Sepharosa 2B nebo 4B)
■     uchovávání
-   ve vodném prostředí obvykle vede k reorganizaci liposomů
-   zmražení poškozuje integritu vnější membrány
-   zmražení v přítomnosti polyolů nahrazujících vodu, např. sorbitol
Lipidy
■     složení je variabilní:
-   cholesterol
-   fosfatidylethanolamin (PE)
-   fosfatidylglycerol (PG)
-   fosfatidylcholin (PC lecithin)
-   fosfatidylserin (PS)
-   fosfatidylinositol (PI)
-   roztoky je třeba chránit před oxidací, udržovat ve tmě
■     R značí zbytek mastné kyseliny, např.
-   kyselina myristová R=CH3(CH2)12-
-   kyselina palmitová R=CH3(CH2)14-
-   kyselina stearová R=CH3(CH2)16-
		^		NH2
fosfatidová		k		k
kyselina		1		1
o~ „ x p o	p O"	bv P   °'	pf O"	V" O   O      O"
R		v R PC		V> R PE OH
°Y°		HCX		HOykyOH
H2N-^S		HO-^N		HO^Nr^^OH
I o o    o		1 os P   °'	O"	°.  <P O   O      O"
v R  ps		v RpG		R  p|
Cholesterol
může tvořit až 50% (mol.) z přítomných lipidů
-  je v membráně do značné míry rigidní a nemá volnost ohybu
-  jeho vzrůstající podíl snižuje fluiditu
membrány liposomů a posouvá fázové přechody k vyšším teplotám
N1-cholesteryloxykarbonyl-3,7-diazanonan-1,9-diamin (C-DAN)
-  polyaminový kladně nabitý derivát
dále je možné do liposomů včlenit i sfingolipidy na bázi sfingosinu, běžné v přirozených membránách, prakticky to omezuje vysoká cena těchto složek
Náboj liposomů
■    neutrální (PC, PE)
-   náchylné k agregaci a sedimentaci
■   záporně nabité (PG, k. fosfatidová, PS)
-   dobře vychytávány buňkami, uvolní obsah při cirkulaci
■    kladně nabité (dimethyldioktadecylamonium bromid, DoDAB, stearylamin, C-DAN)
-   zejména pro přenos nukleových kyselin (genová terapie)
Charakterizace vlastností
■    morfologické (velikost, tvar, stabilita, distribuce velikostí -mono/polydisperzní, náboj
■   strukturní organizace (permeabilita a fluidita)
■   funkcionalizace (zachytávači kapacita, stabilita, reaktivita, schopnost fúzování)
■   techniky
-   elektronová mikroskopie (SEM, cryo-TEM)
-   rozptyl světla (statický SLS a dynamický DLS)
-   separace (SEC, FFF, CZE)
-   kalorimetrie (DSC) - určení teplotv přechodu 7"„
(Chemická) modifikace liposomů
■    aktivace liposomů je možná předem
-    modifikací komponent tvořících membránu
-    biotinylované liposomy
-    přímé zakotvení lipofilních antigénu (kardiolipiny, glykosfingolipidy) nebo biomolekul modifikovaných lipidy
■    nebo až u hotového liposomů
-    oxidace PG nebo PI v diolové části pomocí jodistanu - vznikne aldehydová skupina
-    volné aminoskupiny u fosfatidylethanolaminu a fosfatidylserinu, nebo přidání stearylaminu
-    karboxyskupina z PS, lze získat začleněním karboxylových kyselin s dostatečně dlouhým alifatickým řetězcem přímo do membrány
-    hydroxylové skupiny u fosfatidylglycerolu a fosfatidylinositolu
Náplň liposomů
■   při přípravě mohou být dovnitř vpraveny různé látky z okolního vodného prostředí
- bíj/viva, fluorofory, enzymy, léčiva,...
■   liposomy pak fungují jako nosiče velkého množství detekovatelných nebo jinak "užitečných" komponent
-  mohou být s vysokou citlivostí stanoveny po uvolnění do okolního prostředí rozrušením membrány liposomů detergentem -- zesilovací mechanismus
-  postupně se uvolňují v cílovém prostředí po specifické vazbě liposomů na vhodné determinanty na povrchu buněk, tzv. cílené směrování - "homing"
Heterogenní stanoveni
■  LISA, liposome immunosorbent assays
varianta s využitím biotinu/avidinu - univerzální použití
ŕ-i t ig e n     (streptjevidin
+ if» *
výhoda: vyšší citlivost oproti klasické ELISA
Boronátové komplexy
	HO      OH ho' xoh	HO	HO,    0^ B ho'   o^	
		4.		
		J		
kyselina boritá je schopna vytvářet komplexy se sloučeninami obsahujícími diolové uskupení - sacharidy, glykoproteiny možnost využití pro reversibilní imobilizaci biomolekul pomocí kyseliny fn-aminofenylborité (APBA):
■   nejznámější je možnost měření hladiny glykosylovaného hemoglobinu
Boronátové komplexy ( V^/^Jinx)
■   velmi silnou komplexaci mezi kyselinou fenylboritou (PBA) a salicylhydroxamovou (SHA) využívá firma Prolinx pro generický způsob imobilizace biomolekul či tvorbu biokonjugátů:
HO.    /OH B
OH   HN
,OH
O
^        HOvl
—            /Bv   /OH
O        N
SHA je obvykle kovalentně navázána na jednom partneru a PBA (nebo diboritá varianta PDBA) je v preaktivované formě pro modifikaci biomolekul:
PDBA-X-NHS
Imunoreacj        e
pro značení se využívá specifická interakce mezi vazebným místem protilátky a rozpoznávaným místem (epitopem) antigénu
-   protein, lipopolysacharid, nízkomolekulární hapteny - peptidy, pesticidy, toxiny, léčiva, ...
protilátka - prakticky výhradně imunoglobulin G (IgG)
-   160 kDa, 2 vazebná místa pro antigen, tvar Y, 1 Fc a 2 Fab fragmenty
-   polyklonální (pAb), monoklonální (mAb), rekombinantní (rAb) primární protilátky - rozpoznávají cílové místo, ale obvykle nejsou nijak dále označeny
-  jsou dostupné tisíce prim. Ab a nebylo by ekonomické od každé připravovat různě značené konjugáty
-  je to ale samozřejmě možné, má význam při dlouhodobém častém používání - zjednoduší se pracovní proces
sekundární protilátky - obvykle značené (konjugát s enzymem nebo fluoroforem)
-   skupinová specifita - rozpoznávají všechny protilátky pocházející z určitého organismu, např. kozí anti myší protilátka rozpozná všechny IgG připravené imunizací myší (nebo vytvořené pomocí DNA pocházející z myši)
Sekundární protilátky
•   rozpoznávající (anti) protilátky původem:
-   myší, králičí, kozí, krysí, ovčí, koňské, lidské
■   specifita vůči:
-   celý IgG, IgM, Fc, Fab, lgG12   ,
■    konjugované s:
-   peroxidasa, alkalická fosfatasa
-   fluorescein, rhodamin, Texas red, fykoerithrin
-   biotin, streptavidin
Proteiny A, G, L
některé kmeny Staphylococcus aureus produkují protein A
-  skupinový ligand, velmi pevně a specificky váže molekuly imunoglobulinů v oblasti Fc fragmentu (až 4 vazná místa)
-  42 kDa, stabilní při pH 1 až 12, snadno renaturuje
-  KA až 108 l/mol, neváže ale všechny podtřídy IgG skupiny C a G streptokoků - podobný protein G
-  23 kDa, nižší afinita k IgG, ale váže širší skupinu IgG
-  má vazebné místo pro albumin (odstraněno v rekombinantní formě)
-  produkují i podobné protein H (IgG Fc), protein B (IgA), Arp (IgG a IgA)
Peptostreptococcus magnus - protein L
-  35.8 kDa, 4 vazná místa
-  váže některé k (ne však A) řetězce L protilátek, i Fab a scFv fragmenty
■  rekombinantní hybridní varianty (L/G, L/A, ...)
Použití proteinů A G L
■   orientovaná imobilizace protilátek
-  na povrchu sensorů nebo afinitních nosičů
-  vzniklý komplex lze zpevnit prokřížením pomocí dimethylpimelimidátu
1  purífikace protilátek
-  po imobilizaci na vhodnou (agarosovou) matrici - Protein A Sepharose
■   obecně použitelné jako detekční činidlo pro imunokomplexy
-  Protein A značený peroxidasou nebo vhodným fluoroforem
-  zviditelnění přítomnosti protilátek
	Porovnání spéci   bj				
	Antibody	Protein A	Protein G	Protein L (*)	
	Bovine	++	++++	-	
	Cat	+	-	■>	
	Chicken	-	+/-	-	
	Dog	+++	+	■>	
	Goat	-	+++	-	
	Guinea pig	++++	++	■>	
	Horse	++	++++	■>	
	Human IgG,, lgG2, lgG4	++++	++++	++++	
	Human lgG3	-	++++	++++	
	Human IgM, IgA, IgE	+/-	-	++++	
	Human IgD	-	-	++++	
	Mouse IgG,	+	++++	++++	
	Mouse (others)	++	++	++++	
	Pig	+++	+++	++++	
	Rabbit	++++	+++	++	
	Rat	+/-	++	++++	
	Sheep	+/-	++	-	
		* pouze pokud má	kapa řetězec		
					
Lektiny
■    buněčné proteoglykany, glykoproteiny a glykolipidy mohou obsahovat širokou škálu oligosacharidových zbytků
-   vyskytují se obvykle na povrchu buněk jako složky zakotvené do buněčné membrány
-   pro různé buňky mohou být specifické různé sacharidové sekvence
-   např. nádorové buňky mohou změnit své povrchové oligosacharidy
■    lektiny - proteiny schopné rozpoznávat a vázat specifické konfigurace sacharidových molekul
-   aglutinace buněk (aglutininy)
-   precipitace komplexních oligosacharidů
■   fluorescenčně značené lektiny se uplatňují při:
-   detekce povrchových buněčných struktur a intracelulárních glykoproteinů v mikroskopii
-   detekční postupy v histochemii a cytometrii
-   lokalizace glykoproteinů na gelech a v blotech
-   precipitace glykoproteinů
-   aglutinace specifických buněk
Concanavalin A
■   z bobu Canavalia ensiformis (Fabaceae, "jack bean", "pig bean")
■    první známý lektin, 237 aa, Mr 26,5 kDa, dvě místa pro ionty kovu (Ca2+, Mn2+)
■   vytváří dimery a z nich pak tetramer
-   4 dostatečně vzdálená vazebná místa
-   výhodné pro tvorbu agregátů, (např. z erythrocytů)
■    má afinitu ke glukose a k manose
-   nejlépe váže methyl-3,6-di-0-(-D-manopyranosyl)-a-D-manopyranosid
■   podjednotka Con A
				
	Lektiny	Izolován z	Vlastnosti	Vazebná specifita
	Con A	brazilské boby, Canavalia ensiforinis	4-mer, 104 kDa ionty Ca2* a Mna	a-GIc, a-Man
	WGA	obilni kličky, Triticum vulgaris	dimer, 36 kDa	(GlcNAc)2, NeuNAc
	GS- .. IA4, IA3B, IA2B2, IAB3, IB4	africké boby, Griffonia simplifolia	isolektiny, 4-mery, 114 kDa	A: term. ct-GalNAc, B: term. a-Gal
	GS-II	-"-	4-mer 113 kDa	term, nereduk. GIcNAc
	PHA-L	fazol, Phaseolus vulgaris	4-mer, 126 kDa	GlcNAc(1-2)Man
	PNA	arašídy Arachis hypoglea	4-mer, 110 kDa	term. ß-Gal
	HPA	hlemýždi, Helix poinatia	6-mer, 70 kDa, váže A-eryhtrocyt	GalNAc
	SBA	sója, Glycine max	4-mer, 120 kDa, isolektiny	term. GalNAc a Gal
	ABA	žampion, Agaricus bisporus	Monomer, 59 kDa	ß-Gal(1-3)GalNAc
	PSA	hrách, Pisum sativum	49 kDa, 4-mer	a-Man
	RCA	Castor bean, Ricinus comunis	120 kDa, 4-mer	ß-Gal
	B-podjednotka z choleratoxinu	Vibrio cholerae		Gal, gangliosid G
yjJCjJJ :>j]3JCäJ]J
apoptické lidské keratinocyty značené ConA-fluoresceinem (okraje membránových puchýřků) ' a propidium jodidem
fixované a permeabilizované osteosarkomove buňky
-   ConA-AlexaFluor-488 - žlutozeleně, glukopyranosyl
-   WGA-AlexaFluor-594 - oranžově, GIcNac
-   Hoechst 33342 - modře, nukleové kyseliny
kapilární endothely a mikroglie z kryořezu krysíhc
mozku                                                        '                 #A-W
-   GS-IB4-AlexaFluor 488 (žlutozeleně)
-   neurony - NeuroTrace 530/615 (červeně)
-   jádra - DAPI (modře)
His-tag
•    purifikace geneticky modifikovaných rekombinantních proteinů exprimovaných v E. coli nebo jiných mikroorganismech
•   jinak "polyhistidine-tag" nebo "hexahistidine-tag" je úsek histidinových zbytků na N- nebo C-konci
-   volí se ten méně důležitý nebo dostupnější
•   slouží k rychlé izolaci pomocí metaloafinitní chromatografie s Ni2+ nebo Co2+ ionty
-   eluce snížením pH (protonace His) nebo komplexotvorným činidlem (imidazol, EDTA)
-   další formáty - magn. nosiče, jednoúčelové kolony,...
■    po purifikaci se tento koncový úsek odstraní
-   pomocí exopeptidasy z N-konce
-   na základě další krátké cílové sekvence endoproteinasy
■   vhodné i pro denaturované proteiny (důležitá je sekvence)
■   vadí peptidylprolylisomerasa (25 kDa, SlyD) - lépe použít SlyD-deficientní E. coli
•   vynalezeno u Roche (licence, akademická zdarma), vhodné vektory distribuje Qiagen
Vnesení His-tagu
•   vnesení DNA úseku kódujícího cílový protein do vektoru, kde je His-tag sekvence přítomna na C-konci
•    použití primem s His-tag sekvencí ke spojení s cílovou DNA v průběhu PCR
DNA encoding Protein
HIS-TAG Forward Primer
Reverse Primer
"\*
HIS-TAG
DNA encoding Protein
DNA wriLuding Protein
His.
>*HJ
vector
I
Ligation
DMA encoding Protein    ^
^G
vector
primery s repetitivními His sekvencemi (CAC nebo CAT)
Protein specific sequence
5'  ATGcatcalcaccatcaccacNNNNNNNN-
Protein specific sequence
5'   _N NNNNNN catcatcaccatcaccscTAG    j
HIS-TAG
HIS-TAG
f
START codon
STOP codon
Metaloafinitni interakce
komplexotvorna reakce nitrilotrioctové kyseliny (NTA) s vhodným iotem kovu (Ni2+, Cu2+) a imidazolovým kruhem histidinových zbytků
-o, o
/ V       2 O    OH,
His lze do proteinů vnést i chemicky    h přes oxidované sacharidové zbytky        0=
GST-tag
■    glutathion-S-transferasa (26 kDa) - má silnou afinitu k nosičům s imobilizovaným glutathionem
■    GST reprezentuje skupinu multifunkčních cytosolických proteinů u eukaryot
■    nevyskytují se u prokaryot - není tedy žádná kompetice s glutathionovou matricí
■    připraví se fúzí konjugát cílového proteinů s GST
-   exprese se provede v bakteriích
-   GST část může zlepšit rozpustnost eukaryotických bílkovin v prokarytickém prostředí
-   purifikace na glutathionové matrici
-   odstranění GST části štěpením proteasou
glutathion, y-Glu-Cys-GLy
Další "tágy"
tyto cizorodé sekvence se vkládají pomocí rekombinantních technik
do cílových genů
kódují krátké peptidy, které vytváří antigenní determinanty (epitopy),
které rozpoznávají specifické protilátky
výsledkem je "označení" exprimovaného proteinu daným úsekem
("tagged protein")
běžně komerčně dostupné protilátky proti tag sekvencím zjednodušují
identifikaci, imunoprecipitaci nebo imunoafinitní purifikaci
označených bílkovin
tyto fúzní proteiny se vzhledem ke krátké značce neliší od nativních
bílkovin co se týká bioaktivity nebo biodistribuce
příklady "tagů":
-   HIS            HHHHHH
-   c-MYC      EQKLISEEDL
-   HA            YPYDVPDYA
-  VSVG       YTDIEMNRLGK
-   HSV          QPELAPEDPED V5             GKPIPNPLLGLDST
-   FLAG        DYKDDDDK
Značení glykoproteinů
mapování glykomu - metabolické značení pomocí acetylovaných derivátů:
-   N-azidoacetylgalaktosamin (GalNAz)
-   N-azidoacetylglukosamin (GIcNAz)   *"\(
-   N-azidoacetylmanosamim (ManNAz) v metabolismu buňky se vestaví do glykoproteinů
chemicky se označí Staudingerovou ligací pomocí FLAG-fosfinového derivátu
vhodné pro proteomickou analýzu postranslačních modifikací FLAG se „zviditelní" pomocí značené anti FLAG protilátky
GalNAz
Metabolie labeling
Y^>
Staudinger ligation
. ob
FLAG-Phosphíne
r.\-                                 ^_
ACQ      /
Ob
La be led glycoprotein
Značení red. konce		0 HO"^^!^^   Schiffs basů		HO-^	NHAC         H      J
■    anthranilová kyselina (2AA)		HjN"^		HO''	
nebo 2-aminobenzamid (2AB)		Dye			1 rtediiciant
- fluorescenční značky		+			
■    redukční aminace		OH			OH
-   Schiffova báze stabilizovaná					{        OH                Y
redukcí NaBH4		HCr\Íw>		ho-^	Í^Vk.
		HO              NHAc		HO''	NHAc                 J
			Glycan (cyclic/acyclic in equilibrium)		Labeled Glycan
	0                                          OH				
					
	HafT*^                             HO"^       NHAc          |J				
	Dye				
	+                                                                        1  Reduclanl				
	OH                                                  OH                                0				
	HO              NHAc                    ho-^     NHAc        [|    J				
	Glycan (cyclic/acyclic                                 Labeled Glycan in cquilibiium)				
					
Nanočástk
■   techniky značení biomolekul pomocí různých částic se používají již několik desetiletí, „immunogold"
-  částice zlata potažené protilátkou se zmiňují už kolem roku 1970
-  rutinně se používají např. v elektronové mikroskopii
■   značná popularita se zvedla v posledních letech se všeobecným trendem nanotechnologií, kam řada tradičních značek „rozměrově" samozřejmě zapadá
□ D
Koloidní zlato
1   stabilní suspenze dispergovaných částic kovu vel. 5 až asi 150 nm
-   v roztoku se jeví jako intenzívně zbarvené (červeně, dle velikosti částic -při koagulaci - zvětšování velikosti - se barva posouvá do modra)
-   Casiův purpur -již od středověku k barvení skla či hedvábí 1   příprava konjugátů s proteiny - řada způsobů podle toho
-   který typ interakce bude zodpovědný za vazbu proteinu na povrch částice; ta nese obvykle záporný náboj
-   mohou se uplatnit i hydrofobní vazby
-   velmi často se používá pevné adsorbce thiosloučenin na zlato (SAM, „self assembled monolayers")
-   v roztoku se záporně nabité částice odpuzují, ale existují mezi nimi a jinými molekulami i přitažlivé síly, v závislosti na iontové síle prostředí
1   adsorbované bílkoviny stabilizují sol zlata a brání koagulaci, kterou lze jinak vyvolat např. přídavkem NaCI
-   vazba bílkovin by měla probíhat v blízkosti jejich izoelektrického bodu, ale proces samozřejmě ovlivní i další faktory
-   sledovat se adsorbce dá při 580 nm.
Příprava
1   prakticky je výhodné používat monodisperzní částice
>    redukce kyseliny chlorozlatité HAuCI4 pomocí různých činidel
>    obecně větší „redukční síla" poskytuje menší částice
-   redukce citrátem sodným poskytuje částice 15 až 150 nm velké dle použitých koncentračních poměrů
-   střední částice 6 až 15 nm se získají nejlépe pomocí askorbatu sodného
-   nejmenší lze připravit redukcí bílým fosforem (pod 5 nm)
-   nebo pomocí borohydridu sodného (2 nm)
struktura koloidní částice - Au obalené záporně nabitými [AuCI2]--  neshlukují se, přitahují kationty
		
' i  A 7\\X\\\XVVVV a*/^iVsX\V\\\XNNo	*	**
	$V 7 ** /v/W GS'■ •	
	•ť ■P*	
Adsorbce bílkovin
■    inkubace s proteinem, zcentrifugování částic, rozsuspendují
■    částice s proteinem A (G, L) - univerzální zviditelnění imunokomplexů
-   adsorbce při pH 6,9 v přítomnosti polyethylenglykolu (PEG 20 kDa, 0,025%) jako stabilizačního činidla
-   produkt se uchovává v 10 mM fosfátovém pufru pH 7,4 s 1% PEG
■   adsorbce protilátek - pH 8 až 9, PEG lze nahradit albuminem (0,25%)
■    další často používané kombinace
-   lektiny - detekce sacharidových struktur na povrchu buněk
-   avidin / streptavidin - široké univerzální použit.
■    rychlé vizuálně vyhodnocované imunotesty
-   červená barva snadno a citlivě detekovatelná
-   výhodou je stabilita nanočástic - nepodléhají degradaci na rozdíl od biomolekul
-   nulová toxicita
častice zlata
nanoklastry zlata jsou vlastně koordinační komplexem centrální atomy Au jsou v dané konfiguraci, na povrchu jsou koordinačně vázány s vhodným ligandem, takže zlato je valenčné saturováno a tím stabilizováno - Undecagold a Nanogold
-   tris (aryl) fosfin
-   halidové anionty
menší klastry Hexagold (6 Au) a Octagold (8 Au) mohou nést náboj
ukázka nanoklastru Au aktivovaného maleimidovou skupinou
£r3p-r t*sP
Au nanočástice v mikroskopii
r< ""~~J	
.-■	ar" Bii,
svazek mikrotubulů
-   anti-tubulinová Ab, kozí Ab anti myší IgG značená koloidním zlatem (vlevo) nebo nanočásticemi NANOGOLD (vpravo)
-   zvětšení 1300x
adenokarcinomy prostaty
-  Ab anti cytokeratin antibody, konjugát Alexa Fluor 488 FluoroNanogold s Fab' fragmentem kozí Ab anti myší IgG
-   vlevo, fluorescence
-   vpravo, lokalizace Au po zesílení Ag+
Magnetické pole
permanentní magnet má dva póly, které vytváří magnetický dipól (často reprezentován šipkou, směr od S do N), mezi póly se šíří magnetické pole magn. dipól m v magn. poli o hustotě toku B je natáčen torzní silou do směru rovnoběžného se siločarami pole:
— mB sin(jfl)|
magnetické materiály mají volný magnetický moment, vykazují magnetizaci M, která závisí na:
-   hustotě magn. dipólů na jednotkový objem materiálu
-   velikosti a vzájemné orientaci dipólů
-  je důsledkem nesparovaných spinu elektronů, v malé míře i pohybem elektronu v rámci orbitalu
magn. pole může vyvolat i elektromagnet
-   elektrický proud procházející vodivou smyčkou (solenoid) vytváří uvnitř homogenní pole
hustota toku B je dána intenzitou H a permea-bilitou vakua u0:
B = Mo(H + M)
L
Magnetizace
magnetizace M se mění v závislosti na intenzitě pole H
-   konstantou úměrnosti je magnetická susceptibilita x
-   velikost změny závisí na typu materiálu, teplotě a někdy i na historii předcházejícího magn. pole (hystereze)
zahřívání zmagnetizovaného materiálu snižuje jeho magnetizaci, při zahřátí nad 7~c (Curieova teplota) pak M zcela vymizí
X
My
'H
M	
	
==S'~j	H < T4<TS
T,<T<	
Magnetické materiály
íudrjnetické - mají tendenci "zahušťovat" siločáry
-   železo, kobalt
-   vykazují magnetizaci i při absenci magn. pole
diamagnetické - siločáry slabě odpuzují
-   bílkoviny, tuky, voda
-   malá negativní magnetická susceptibilita
paramagnetické
- v magn. poli se u nich orientují magn. dipóly a získávají magnetizaci
superparamagnetické
-   nanočástice, 1 až 10 nm
-   orientují se v magn. poli
	ŕ	.	
©	H	CD	CD
CD	(2)	CD	CD
M	
	
	j      vamraíSsUE-
	H
Magnetické častice
>   široká škála aplikací zahrnující:
-  imunostanovení
-  separace proteinů a buněk
-  distribuce léčiv, oligonukleotidů
-  magnetická hypertermie
-  magnetické značení
-  zobrazování při magnetické resonanci (MRI)
>   superparamagnetické materiály na bázi maghemitu (Y-Fe203) a magnetitu (Fe304)
-  dobré magnetické vlastnosti, nízká toxicita
-  žádané vlastnosti: uniformní tvar, definovaná krystalinita, monodispersnost, stabilita ve vodném prostředí, povrchové funkční skupiny
-  nanočástice nebo duté koule (vyšší magnetický moment)
Metody přípravy
■   depozice z plynné fáze
■   tepelný rozklad
-  Fe(CO)5, Fe(oleát)2, Fe tris(acetylacetonát)
■   mikroemulzní precipitace
■   sonochemická syntéza
■   hydrolytické postupy
-  zahřívání FeCI3.6H20 s hexamethylendiaminem a NaAc v glykolu (6 hod, 200 °C)
-  vzniknou částice rovnou s -NH2 na povrchu
■   bakteriální (BMP) produkce
-  vznikají potažené fosfolipidovou vrstvou (magnetosomy)
■   povrchová funkcionalizace
-  vrstvička zlata
-  polymerní povlak s funkčními skupinami
-  silanizace pomocí aminopropyltriethoxysilanu (APTES)
-  elektrostatická adheze (přes polyaminový povlak)
Majjjj, částice v kíjjj^jJjjjš
■   vliv vnějšího magn. pole
-   uniformní pole částici otáčí - orientace dle jejího magn. dipólového momentu, nedochází ale k jejímu translačnímu pohybu
-   pouze gradient magn. pole způsobí translační pohyb
■   viskozitní efekty
■    mezičásticové magnetické a elektrostatické síly
-   může docházet k agregaci až precipitaci
-   el. odpuzování zabraňuje agregaci
Separace buné
■    přímá metoda
-   ligand imobilizovaný na povrchu mg. nanočástice (kolem 50 nm -nezpůsobit mech. stres)
-   přidá se ke vzorku, naváže se na povrch cílové buňky
■    nepřímá metoda
-   cílové buňky se označí ligandem, např. protilákou (biotinylovanou,...)
-   vymyje se nadbytek ligandu (pokud možno)
-   označené buňky se pak zachytí na modifikovaných mg. částicích
■   získaný mg. komplex se zachytí mg. separátorem
■    pozitivní nebo negativní izolace
-   odseparují se cílové nebo balastní buňky
cJJená distribuce (magnetic targeting)
■   akumulace podaných látek ve zvolené cílové oblasti organismu
■    injekce do cévy zásobující orgán
■   v přítomnosti externího mg. pole
-   musí překonat lokální lineární toky odnášející nosič (0.05 až 10 cm/s, dle průřezu a rozvětvení cévního systému)
-   dlouhodobé zadržení nosiče v daném místě (až 70%)
-   lokální vysoká koncentrace uvolňované látky (až 8x)
-   mnohem menší zatížení pro další části organismu než při systémové aplikaci
■   termocitlivé magnetoliposomy
-   v cílovém místě se přenášená látka uvolní lokálním zahřátím pomocí elmg. pole
Hypertermie prostřednictvím magnetické kapaliny
■    metoda likvidace nádoru lokálním zvýšením teploty na 42 až 46 °C
-   sníží se viabilita buněk a ty jsou citlivější na chemoterapii a radiaci
-   mg. subdoménové nanočástice se bioselektivně zachytí na povrch maligních buněk
-   aplikace externího střídavého mg. pole generuje teplo mech. pohybem
Kontrastní zobrazování
■    MRI, "magnetic resonance imaging" - H-NMR aplikované na tkáně
■    při MRI je kontrast zobrazení důsledkem rozdílných odezev různých tkání na aplikované radiofrekvenční pulsy
-   hustota protonů a mg. relaxační časy dané chemickým složením
-   zejména množství vody a lipidů
■    přítomnost superparamagnetických nanočástic (magnetit-dextran) v cílovém místě velmi výrazně zvyšuje kontrast
-   více nanočástic vede k tmavšímu zobrazení, mění se rychlost relaxace protonů z excitovaného stavu
-   např. zdravé buňky nanočástice přijmou, ty odumřelé či poškozené ne
■   sledování buněk značených uvnitř umístěnými mg. nanočásticemi in vivo - např. dodané buňky kostní dřeně, případně v budoucnu kmenové buňky
Bioanalytické aplikace
■    imunomagnetické sensory - snadná regenerace citlivého povrchu
-   na povrchu vhodného převodníku jsou zachyceny (magnet, elektromagnet) mg. mikročástice s imobilizovanou protilátkou
-   provede se imunostanovení, na konci se mg. částice uvolní a nahradí novými
-   vhodné zejména pro komplexní vzorky (potraviny, krev), které normálně degradují imunorekogniční vrstvu
■   enzymové sensory - regenerace při stanovení ireverzibilních inhibitorů
■   analýza DNA
-   specifická extrakce cílové sekvence z komplexního materiálu
Enzymové značky
■   jedna molekula značky při detekční enzymové reakci
konvertuje mnoho molekul substrátu
- chromogenní, fluorogenní nebo poskytující jiné detekovatelné produkty
■   takže je zde využit jistý zesilovací mechanismus
■   nejběžnější využití je v bioanalytice - v imunochemických technikách typu ELISA
ELISA
■   enzyme linked immunosorbent assay"
■   enzymové konjugaty („tracery") slouží pro detekci vzniku a množství imunokomplexů
■   enzymová značka se zachytí v komplexu na pevné fázi
- povrch zkumavky, mikrotitrační destičky, imunostripu
■   přidáním substrátové směsi se vyvolá barevná změna
♦:
kompetitivní
enzymová značka
sendvičová (vícevrstevná)
protilátka             ► analyt
lastnosti enzymu vhodného pro značení
■   dostatečně vysoká aktivita
-  vysoké číslo přeměny
■   stabilita
■   snadná detekovatelnost
■   skupiny vhodné pro konjugaci
-  konjugáty lze připravit mezi zvoleným enzymem a značenou komponentou
-  výhodně lze používat univerzálně např. biotinylované enzymy nebo protein A (G) - enzymové konjugáty
Peroxidasa
■   z kořenů křenu (HRP, „horse radish peroxidase", EC 1.11.1.7)
■    malý (40 kDa) oxidoredukční enzym s hemem (protohem IX)
v aktivním místě, glykoprotein, katalyzuje oxidaci široké škály substrátů pomocí peroxidu vodíku (i MeOOH a EtOOH)
■    donory fenolické povahy nebo aromatické aminy, které jsou bezbarvé (leukoformy) a po oxidaci vznikají intenzívně barevné produkty
■    pH optimum je 5 až 7, stabilita při pH 4 až 10
■   enzym je inhibován mimo jiné azidem, kyanidy a sulfidy
■    mnoho isoenzymů, komerčně dostupná HRP C
	HRP+H2O	2------J Compound I	
Compound I	+ AHs(oxidi2s.ble substrate)------* Compound II		+ AH°
	Compound II i	AH2------i-HKP+AH	
	2AH------	»Oxidised product	
■   peroxidasa ze sojových bobů (40 kDa) je termostabilní (do 90 °C) a aktivní v širokém rozsahu pH 2 až 10
Konjugace peroxidasy
1   při tvorbě konjugátů se peroxidasa může jednoduše sledovat a stanovovat na základě absorbance při 403 nm (typické pro hemoproteiny)
1   poměr absorbancí při 403 a 275 nm charakterizuje čistotu enzymu
-  toto jednoduché stanovení komplikuje existence několika isoenzymů
-   velmi kvalitní preparáty mají tuto hodnotu (R.Z., reinheitzahl) mezi 3 až 3.4, nemá to ale vazbu na aktivitu
>   reakce mohou využít e-aminoskupiny zbytků lyzinu - ty jsou ale
pouze 2, což je velmi málo 1   využívají se sacharidové postranní řetězce
-   snadno se aktivují pomocí oxidace jodistanem a tak se získají aldehydové skupiny
Chromogenní substráty HRP
DH2 + H202
bezbarvý
D + 2 H20
barevný
... obecná reakce ABTS, 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonová kyselina)
o3s
-N = N
CH, I 2 CH,
N
I CH
I CH
SO,
peroxidasa
N=N-
CH    405 nm
fenol   4-amÍnoantÍpyrín   chinonimin
(510 nm)
Ca          NHj             CS
/j—«A                            } =^       peíoiitUse
TMB
3,3',5,5'-tetramethyl benzidin
CH„ CH,
CH CH

CH,
X„,-295nm
I-"
CH,
j-NH, CH.
CH3i
.1/2
!,•
CH,            J^ťCHä
H*N-0~~wNH*
CH»               ^CHj
CH5W     WCH, ^■o»"370,652nm
CHS
HN
■Ö-Q-
CH,                 XH
Xma,'450nm
NH
+- 2H +
-  měří se při 620 až 650 n m v průběhu
reakce, nebo po zastavení kyselinou sírovou při 450 nm)
+ H1
Luminogenní substráty HR^
>    pro citlivou detekci HRP se používá lumitj oJ
- 5-amino-2,3-dihydroftalazin-1,4-dion
>   v nadbytku H202je intensita světla (425 nm) úměrná množství HRP
zlepšení luminiscence (vyšší výtěžek) - přítomnost "enhancers" sloučenin -p-jodofenol, p-fenylfenol
-   nejde již o záblesk, ale o stabilnější světelný tok
-   výsledek silně závisí na podmínkách reakce
-   raději použít komerčně namíchané směsi vyšší výtěžek dává 7-dimethylaminonaftalen-1,2-dikarboxyhydrazid
Akridanové luminogeny
'   alternativní substráty pro HRP •   emise při 435 nm
PS-3
0\ JO       (akridan)
(akridinium)   I
Alkalická fosfatasa
■    katalyzuje štěpení ortho-esterů kyseliny fosforečné v zásadité oblasti pH(AP, EC 3.1.3.1)
■    řada isoenzymu, používá se enzym izolovaný z mukosy telecích střev
-   CIAP, 140 kDa dimer, 2 Zn2+ na podjednotku, vysoké číslo přeměny 3500 s"1 při reakci kolem pH 9,8 (pH optimum je 8 až 10)
-   aktivována aminoalkoholy (diethanolamin, Tris) •   uchovává se lyofilizovaná nebo v 3 M NaCI
-   nesnáší kyselé prostředí
-   poškozuje ji opakované zmrazovaní / rozmrazování
relativně dobře snáší vyšší teploty
-   např. v průběhu hybridizace
-   značka při detekci nukleových kyselin
i#*
Ar£-I66

Asp-3S9

Asp-327
a        HIS-J7«
qtrt

Konjugace ALP
1   příprava konjugátů není snadná a často dochází ke ztrátám aktivity
1   pomocí glutaraldehydu nebo lépe
'   heterobifunkčními činidly SMCC a SPDP
- je dobré provádět konjugaci ve fosfátovém pufru, který chrání aktivní místo jako reverzibilní inhibitor
1   komerčně dostupná je ALP s maleimidem (EZ-link od Pierce):

-O
°-cra
o
Maleimide Activated Alkaline Phosphatase (AP)
Pň>tein-AP conjugate with ťhioether linkage
SH
■    protilátky se redukují merkaptoethanolem a po dialyse lze provést konjugaci
■    pro zavedení -SH slouží SÁTA
Měření aktivity
'   p-nitrofenylfosfát (PNPP, 405 nm), hydrolýzou vzniká nitrofenol
-   intenzivně žlutý v alkalickém prostředí od fluoresceinu - fluoresceindifosfát
1   4-MUP (methylumbelliferylfosfát) >   luminogenní substrát - Lumigen PPD
-   chloro-4-methoxy-4-(3-fosfátophenyl)spiro[1,2-dioxetan-3,2'-adamantan])
-   patří do skupiny dioxetanových luminogenů
-   substibuce halegenem v adamantanovém skeletu zlepšuje citlivost detekce (už 600 molekul ALP, zeptomoly)
-   477 až (dle enhanceru) 620 nm
5   /»mo-4-chloro-indolylfosfát (BCIP)
indigo
O         Cl
hydrolytickou reakcí vzniká indoxyl, který po oxidaci (např. tetrazolium) přechází na modré nerozpustné indigo
Galaktosidasa
■    ß-galaktosidasa (ßGal, EC 3.2.1.23) je velký enzym (540 kDa, 4 podjednotky po 135 kDa) a je tedy snadno inaktivován
>    katalyzuje hydrolyzu galaktosidů, pl 4,6, pH optimum má 7 až 7,5 (enzym z Escherichia coli)
>    má dostatek sulfhydrylových skupin pro konjugační reakce, takže lze jednoduše spojit s protilátkami aktivovanými předem SMCC
■    chromogen. substrátem je ONPG
-   o-nitrofenyl-ß-D-galaktopyranosid
-   v hydrolytické reakci nitrofenol
•   Xgal produkuje indigo
Gal jako reporter genové exprese
enzym může být rozdělen na dva peptidy LacZa a LacZQ
-   samy o sobě nemají aktivitu
-   ale spontánně se spojí do funkčního enzymu
využívá se v mnoha klonovacích vektorech pro dosažení a-komplementace u speciálních lab. kmenů E. coli
-   malý LacZa peptid je kódován v plasmidu
-   velký LacZQ je kódován bakteriálním chromosomem
-   když se DNA fragment vpraví do vektoru a produkce LacZa se přeruší, ztratí se ß-galaktosidasova aktivita
-   základem pro modro/bílý screening rekombinantních klonů
Glukosa oxidasa
(ß-D-glukosa:02-1-oxidoreduktasa, EC 1.1.3.4, GOD) dostupná z plísní Aspergillus niger nebo Penicillinum notatum 160 kDa, dimerse dvěma FAD kovalentne vázanými na podjednotky obsahuje asi 16% glykosylových zbytků specifická aktivita preparátů přesahuje 200 lU/mg velmi stabilní
v imunostanoveních často "spolupracuje" s HRP, pro kterou generuje peroxid vodíku oxidací glukosy - tunelovací stanovení, imunosensory
Ureasa
substrátem je močovina
-  změna pH vyvolaná hydrolysou, měří se
-  pomocí indikátoru bromkresolová modř při 588 nm
-  potenciometricky (light addressable potenciometric sensor, na bázi pH ISFETu) - pro imunosensory
kasa
1   z choroše Coriolus hirsutus, Cu-dependentní 1,4-benzendiol oxidasa
(EC 1.10.3.2) 1   oxiduje fenolické substráty pomocí kyslíku
-   alternativa k peroxidase
-   menší problémy s dlouhodobou stabilitou substrátové směsi
	
Acetylcholinesterase ■   vysoké číslo přeměny (105 s-1) ■   z elektrického úhoře ■   vysoká citlivost stanovení ■   substrát acetylthiocholin a DTNB -   dithiobis(nitrobenzoová kyselina), Ellmanovo činidlo -   poskytuje žluté zbarvení	\
	
Luciferasy
patří mezi oxygenasy, štěpí substrát luciferin za účasti ATP
-   meziproduktem je luciferyladenylát, ten je poté oxidován
-   luciferin-4-monooxygenasa, 61 kDa, 550 aa
-   dochází k emisi světla při 560 nm (žlutozelené světlo), výtěžek asi 0.88 ! zdrojem světluška (firefly, Photinus pyralis), (EC 1.13.12.7)
HO\/^^S            N      >COOH                              HCL    /~        o
//    T    + AMP+ PiPi + hv
J   I
CO, + H,0
Reakce luciferasy		
-j   kroky 1 a II jsou enzymové (ligace a oxygenace)		
...     N      N^-COOH                       ^^      N^-COAMP 0   -oQí^J      ™£**£Xt&	+    PPi + hBO	
(D-luciferin)                                                      (Luciferyl-adenylsrte)		
r^rN      NrCOAMP                                          N0'b=0 (id -o-CKaxJ     -% -oWJ	+    AMP	
(Luciferyl-attenylate)                                           (Peroxy-luciferin)		
(no -o-CcH^=0 ^ [-oííH/]*	+     C02	
(Peroxy-lucifenn) (oxyluciferin)		
(iv) L-OCH3x J — -o-CX3K3x		
(oxyluciferin)                                              (oxyluciferin)		
		
				
Luciferasa z Renilla				
■   mořská sasanka ("sea pansy", Renilla reniformis) svítí při dráždění				
■   emituje modré světlo 480 nm, přenosem				
na GFP vzniká zelené záření				
■   36 kDa monomer				
■   luciferinem je coelenterazin			^^Ata^^fl	
	li      li	i—OH	o<^	-OH
		o2	N^/NH ľl                 li                            nn	
	.__.   Ji   JJL		1            1                 +C°2   +	hv
	A J    H   JL HO        r\	JCX	h	
	kJ		kJ	
				
Luciferasa z brouků
1   zdrojem je "click-beetle", Pyrophorus plagiophthalamus
'   různé enzymy emitující od 544 do 593 nm (zeleně až oranžově)
-   byly geneticky upraveny pro emisi při 611 nm a 544 nm
-  lucRD červená emise ("Chroma-Glo""), lucGR zelená emise (nebo CBR/uc, CBG/uc)
£ G.B -
DIPTERA                    COLEOPTERA
vlycetophilidae     Staphylinidae Elateridae
Phengodidae
5D0            550            6D0
Wavelength inml
■ ■	Luciferasa z bakterií mořské bakterie - luciferasa (EC 1.14.14.3) oxiduje aldehydy (>C8, dekanal, tetradekanal) -  Vibrio fischen, Vibrio harveyi, Photobacterium phosphoreum nemají význam pro použití v eukaryotických buňkách, pouze u prokaryot	
	NAD(P)H + FMN + H+      NADH oxidoreduktasa >   NAD(pf + PMNH2 Luciferasa FMNH2 + R-CHO + 02 -----------------> FMN + R-COOH + H20 + hv	
		
Geneticky upravené luciferasy
světlušky:
-   lue nativní varianta, lue* "enhanced", zvýšená luminiscence (vyšší svítivost) - vyžadují zlyzování buněk před přidáním substrátů
-   h/uc+ optimalizované kodony pro expresi v savčích buňkách, svítí déle, poločas přes 5 hod, "Steady-Glo", h/ucP+ zkrácená stabilita uvnitř buňky, poločas 30 min, "Bright-Glo", h/ucCP+ velmi krátká živostnost - svítí přímo v buněčné kultuře, vhodné pro mikrodestičkový formát
-   nahrazení C-terminální sekvence Ser-Lys-Leu cílové pro peroxisomy za Ile-Ala-Val
u Renilla obdobné: Rluc, hR/uc, hR/ucP, hR/ucCP, nemá C-term. cílovou sekvenci
"Dual-Luciferase" - použijí se oba typy luciferas, lyže buněk, dva substráty, postupné měření emise
-   "Dual-Glo" - stejné, ale přímo v buněčné kultuře optimalizace kodonů pro dobrou expresi v savčích buňkách odstranění skrytých ("cryptic") regulačních a potenciálních sestřihových sekvencí
www.promega.com
Vylepšené luciferasy
z luc+ na Iuc2 - mnohem vyšší exprese odstranění konsensuálních sekvencí pro vazbu transkr. faktorů - vyšší specifita
10,000,000
□ luč*
NIH/3T3        CHO       HEK 293        HaLa
I:í portery genové expres e
molekul luciferasyje pro zobrazení potřeba mnohem méně než např. GFP (musí mít silnější promotor, je velmi stabilní)
-   rychlejší metabolismus (začlenění sekvence pro degradaci - PEST, Pro-Glu-Ser-Thr)
-   lepší pro zobrazení dynamiky exprese
-   efektorová specifita, uniformní a optimální exprese v hostitelských buňkách
zobrazení žádané buněčné linie po úspěšné transfekc
-   hledání a studium účinku nových léčiv
-   efekty cizorodých látek na buněčné procesy identifikace interagujících proteinů
-   společně spustí přepis reporteroveho genu interakce a vzdálenosti biomolekul - BRET
-   fúze studovaného proteinu s luciferasou (Rluc) a druhého partnera s vhodným fluoroforem (GFP)
Luciferasový reportérovy vektor pGL4
■   pro přenos reporteroveho genu do hostitelských buněk, obsahuje:
-   promotorové sekvence (HSV-TK, SV-40, CMV)
-   savčí selekční sekvence (Hygr - resistence k hygromycinu)
-   poly(A) úseky
klonovací místa lue gen (dle volby), • Iuc2 nebo R/ucNeo
Poly(A) block
(for background
reduction)
SV40 late poly(A) signa
- Firefly {luc2)
•  Rapid Response™ (-P, -CP) -Rentíla{hR!uc)
•  Rapid Response™ (-P. -CP)
Přehled dostupných vektorů
Vector	Reporter Gene	Multiple Cloning Region	Protein Degradation Sequence	Gene Promoter	Mammalian Selectable Marker
pGL4.10	hici	Yes	No	No	No
pGL4.ll	luc2P	Yes	hPEST	No	No
pGL4.12	luclCP	Ves	CLlhPEST	No	No
pGL4.13	lud	No	No	SV4D	No
pGL4.14	Utc2	Yes	No	No	Hyg'
pGL4.15	luc2P	Yes	hPEST	No	Hygi
pGL4.L6	luc2CP	Yes	CĽl-hFE5T	No	Hyg'
pGL4.70	.'.'Jii'Tir	Yes	No	No	No
pGL4.71	hRiucP	Yes	hPEST	No	No
pGL4.72	hRlucCP	Yes	CLl-hPEST	No	No
pGL4.73	:iR!i:C	No	No	SV40	No
pGL4.74	Mílii C	No	No	HSV-TK	No
pGL4.75	hRluc	No	No	CMV	No
pGL4.76	::R:i:c	Yes	No	No	Hvgi
pGL4.77	hRiucP	Yes	hPEST	No	Hygi
pGL4.78	hRliícCP	Yes	No	No	Hyg'
BRET
■    bioluminiscence resonance energy transfer
-   neradiační přenos energie z luminiscentního donoru na fluorescentní akceptor
-   vyskytuje se také in vivo (rod Renilla obsahuje luciferasu emitující modré světlo, BRET přenosem na GFP se ale mění na zelené
-   účinnost BRET se stanovuje jako poměr intenzit emise akceptoru a emise donoru - eliminují se tak vlivy techniky měření, počtu buněk, prostředí
■   aplikace in vivo - studium interagujících biomolekul
-  jeden z partnerů se na úrovni DNAsfúzuje s genem luciferasy (rluc), druhý partner pak s genem GFP
■    výhody
-   není problém s fotorozkladem
-   lze studovat buňky citlivé na světlo, případně buňky s vysokou přirozenou autofluorescencí
■    při sterických problémech lze použít velmi malou luciferasu z rodu Gaussia (20 kDa)
Bioluminiscence vs. fluoresces i^
F - vysoký jas, excitované stavy mohou vznikat rychle díky masivnímu excitačnímu záření (napumpovaní energie)
-   ale zvyšuje se i signál pozadí, rozhoduje poměr signál/šum
-   detektory nerozlíši excitační a emitované fotony (geometrická diskriminace ani filtry nejsou 100% účinné)
-   emitují i nežádoucí fluorofory přítomné v komplexním biomateriálu
-   uplatní se při zobrazování detailů - rozhraní, kdy S/N nemá takový vliv
-   mikroskopie, cytometrie, kdy stejně optická konstrukce limituje citlivost detektoru
BL - nižší intenzita světla, ale současně prakticky nulové pozadí
-   uplatní se při "větších" vzorcích, kdy je pouze jednoduchá optika (žádné filtry) a detekce fotonů je tedy efektivnější (detektor blíže vzorku)
-   stanovení ve zkumavkách, v mikrodestičkách, detaily u větších organismů (myši,...)
-   široká lineární oblast (6 až 8 koncentračních řádů)
-   při bioanalytických stanoveních dosahuje 10 až 1000x vyšší citlivosti a limity detekce (1020 mol, cca 104 molekul/vzorek, několik molekul v buňce)
-   luminofor je chráněn při emisi uvnitř bílkovinného obalu
Acetátkinasa
■   jako značka pro vysoce citlivá imunostanovení
■   generuje ATP z acetylfosfátu a ADP
■   vzniklé ATP se pak použije pro vyvolání bioluminiscence luciferinu s luciferasou
■   citlivost až 10"22 mol
H<\	C	.S.            .N.,COOH    +   ATP  — Substrate     +   ATP	tuciferase Kinase	Glo Substrate     +   ADP Ó
				
Imobilizace biomol ^   J v afinitní chromatografii
separační postupy využívající vysokou specifitu bioafinitních interakcí - afinitní chromatografie
možnost opakovaného použití biomolekul - snížení pracovních nákladů - imobilizované enzymové reaktory
Afinitní chromatografie
■   separace biomolekul na základě reversibilní interakce s ligandem imobilizovaným na vhodném nosiči
■   ekvilibrace matrice ve vazebném pufru
■    nanesení vzorku za podmínek, které jsou vhodné pro vznik afinitního komplexu, vymytí nenavázaných složek vzorku
uvolnění biomolekuly změnou podmínek
-   přidání volného kompetujícího ligandu
-   změna pH, iontové síly, polarity,...
-   biomolekula se získá v čisté podobě a v zakoncentrovaném stavu
■   reekvilibrace nosiče s vazebným pufrem
Průběh afinitní separace
equilibration-
adsorption of	wash
sample and ___ elution of	away unbound
unbound material	material
elute
►•■ bound -
protein(s)
begin sample application
1-2 cv
re-equilibration
1-2 cv
Column Volumes (cv)
Nosiče (bio)ligandů
ve vodě nerozpustné materiály obvykle sférického tvaru
-  kuličky "beads"
-  gelové materiály
-  membránové separační techniky
-  monolitické materiály
-  magnetické nosiče
v zásadě lze připravit vlastní materiály, je vhodnější používat komerčně dostupné matrice
-  výrobci poskytují materiály dostatečně reprodukovatelné
-  charakterizující informace, bohatá firemní literatura
-  doporučené postupy imobilizace
povrchové reaktivní nebo derivatizovatelné skupiny
-  obvykle nejčastěji hydroxyly - dobře se aktivují, vykazují nízkou nespecifickou adsorbci
-  aminy, karboxyskupiny - snadná vazba biomolekul, ale vyšší podíl nespecifických interakcí (mohou nést náboj)
Mechanic ^ parametry nosičů
>    mechanická a chemická stabilita nosiče může být aktivačními reakcemi negativně ovlivněna
>    mechanické parametry
-   ovlivňují možnost použití vysokých tlaků a rychlých průtoků
-   rigidní nosiče na bázi skla a silikátů či zesíťovaných polymerů
-   měkké gelovité nosiče jsou málo odolné a nemusí snášet ani míchání při derivatizaci
1   chemická odolnost
-   vhodná pro použití různých typů solventů
-   možnost pracovat v širším rozsahu pH mezi 3 až 11 1   odolnost vůči mikroorganismům
-   uchovávání v chladu, přidání konzervační bakteriocidních činidel (azid)
Průtočné vlastnosti
1   dobrý průtok přes daný nosič závisí na průměru použitých částic
-   pro běžné účely v laboratoři vyhovuje asi 100 um
-   přesná definice průměru není pro afinitní techniky až tak kritická jako pro jiné druhy chromatografických separací
-  typický rozsah pro Sepharosu CL-6B je 45 až 160 um
-   pohyb kapaliny přes sloupec mohou komplikovat jemné fragmenty vznikající mechanickým poškozením částic např. při intenzívním míchání
1   velikost částic společně s porozitou samozřejmě ovlivňují kapacitu připraveného sloupce
-   vzrůstá pro menší částice
/azebná kapacita nosiče
■   udává množství cílové molekuly navázané na jednotku nosiče •   teoretická vs. praktická
-   vhodnější je vztahovat tento údaj na nosič při reálném použití, tedy ne v suchém, ale v nabobtnalém stavu
-   často se může výsledná kapacita např. pro protein výrazně odlišovat od udávaného množství reaktivních skupin pro imobilizaci ligandu (výrobci počítají s malou molekulou ...)
-   dostupnost molekul ligandu na povrchu a uvnitř v pórech matrice
-   roli hraje také vzdálenost mezi povrchem matrice a ligandem
-   spojovací můstková část ("spacer" nebo "linker"), jeho délka může výrazně ovlivnit probíhající afinitní interakci
Nespecifické interak
1   nespecifická vazba balastních molekul v separovaném roztoku
probíhají na bázi iontových nebo hydrofobních vazeb 1   proces lze ovlivnit
-   složením pracovních pufrů
-   promývacími kroky
-  také volbou teploty
1   obvykle nelze zcela vyloučit oba typy rušivých vazeb 1   různé typy matric vždy vykazují zbytkové interakce
Volovi u osice
■    kombinace výše zmíněných parametrů
■    cena a dostupnost daného materiálu
■    předchozí zkušenosti
Postup modifikace
■    nosič
■    nosič s aktivními skupinami
■    imobilizace bioligandu
■    blokování zbylých aktivních míst
-   glycin, ethanolamin, glycerol
-   hydrolysa při zvýšeném pH
■   volba pracovního uspořádání
-   naplnění do kolony,...
Způsob vazby ligandu
■   vliv vzdálenosti ligandu od povrchu nosiče - ovlivní se délkou spojovacího můstku - "linker", "spacer arm"
-  je potřebný pro Ugandy menší než asi 1 kDa
-   příliš krátký - biomolekula ligand neváže efektivně, sterické zábrany vzniku pevného biokomplexu
-   příliš dlouhý - balastni biomolekuly s ním mohou reagovat nespecificky
	1»	K»	
&28Q Inefficient binding			Efficient binding f\ target elutes in      \ a single peak           \
target elutes during binding and elution A .			
i      i      i      i 0              5              10            15            20            25 Elution volume, ml		l                            1                                                            III 0              5             10            15            20            25 Elution volume, ml	
Silikagel
■    "silica", Si02 x H20, voda chemicky vázaná v nestechiometrickém poměru, obsahuje vazby
-   siloxanové (Si-O-Si)
-   silanolové (Si-OH)
■   amorfní struktura, výborná mechanická stabilita - vysoké tlaky
■    omezená pH stabilita (mezi 2 a 8)
■    náchylný na nespecifické interakce
■    povrchové silanolové skupiny (Si-OH) se musí aktivovat, např. silanizací
Poresní sklo
■    CPG, "controlled pore glass" stejně jako obdobné anorganické silikáty, alumina a zeolity vynikají především výbornými mechanickými vlastnostmi
-   pro techniky pracující s vysokými tlaky
-   poměrně křehké, při aktivacích raději jemně třepat a nemíchat
-   při výměně roztoků je dobré používat vakuum, aby se odstranily bublinky zachycené v pórech
■    příprava - borosilikátové sklo se zahřeje - dojde k separaci borátové a silikátové fáze, boráty se odstraní vylouhováním, vzniknou uniformní póry
■    chemická stabilita
-  toleruje dobře kyselé pH
-   v alkalické oblasti nad pH 8 se rychle degraduje
■    pro modifikace se využívá silanizace
■    komerčně dostupné jsou aminované CPG i jiné deriváty
■    nízká nespecifická adsorpce biomolekul
CPG
vysoký povrch uvnitř pórů velikosti částic:
-   grade A: 80/120 mesh, 125-177 um
-   grade B: 120/200 mesh, 74 - 125 um
-   grade C: 200/400 mesh, 37 - 74 um
Průměr pórů (nm)	Plocha (m2/g)
7.5	340
17	150
35	75
100	25
200	13
300	9
Silanizace
>   aktivace inertních povrchů pokrytých vrstvou oxidu (sklo, silikáty, slída, oxidy kovů)
-   v hydratovaném stavu obsahuje hydroxylové skupiny, např. Si-OH, silanolový zbytek
•    reakcí se silany vzniká spontánně uspořádaná vrstva
-   obvykle několik vrstev, ne monovrstva
-   nepoužívají se organické halogenované silany (jsou příliš reaktivní a žádná další skupina už by nezbyla), ale méně reaktivní alkoxyderivaty
•   silanizací se na povrch modifikovaného nosiče zavedou vhodné reaktivní skupiny X
(CH CH O) Si-----(CH)-NH.
aminosilany
-   APTES (3-aminopropyl)-triethoxysilan APDEMS
(3-aminopropyl)-diethoxy-methylsilan APMES
(3-aminopropyl)-dimethyl-ethoxysilan, monofunkční - vede ke vzniku monovrstvy
glycidoxysilany
-   GOPS glycidoxypropyl-trimethoxysilan
-   GPMES (3-glycidoxypropyl)-dimethyl-ethoxysilan
merkaptosilany -   MPTS
Silanizační člnikJhj
OCH,CH,
I        2      3
H3C— Si — (CH2)3-NH-
OCH,CH,
		H
(CH30)3Si-	-c—	-C-------CH,
	H2	\/ O
CH,
I    3
CH3CH20—Si—(CH2)3-NH.
CH,
(CH30)3Si-----(CH2)3-SH
CH, I     3
CH,CH,0—Si-----C-
3      2        I         H,
CH,      2
H -C-------CH,
\/
O
(3-merkaptopropyl)-trimethoxysilan
MP D MS
(3-merkaptopropyl)-methyl-dimethoxysilan
H,C-
OCH,CH, I        2       3 -Si —(CH2)3-SH
OCH,CH,
další činidla -   MPS
(3-trimethoxysilylpropyl)methakrylát
o
(CH3CH20)3Si----(CH2)3-0-
-f=CH. CH,
Silanizační reakce
1   lze provádět z organické fáze
-   10% roztok silanu v toluenu, v něm se daný povrch refluxuje 12 až 24 hod, po pro myt í toluenem či acetonem a vysušení se dále zahřívá 2 až 4 hod při 110 °C
1   z vodné fáze se dosáhne menší vazebná kapacita, ale vrstva je stabilnější při použití ve vodném prostředí
-   povrch se hydratuje 30 min povařením ve vodě
-   zahřívá 3 až 4 hod při 75 °C v 10% vodném roztoku silanu, pH 4
-   po usušení se zahřívá přes noc při 110 °C 1   odpařovací nanesení je nejjednodušší
-   povrch se inkubuje 1 hod v 1% roztoku silanu v acetonu
-   po opláchnutí acetonem a vysušení se zahřívá 1 hod při 110 °C
nanášení silanu z vodné fáze nebo z polárních rozpouštědel vede ke tvorbě složitějších struktur (4 až 5 vrstev silanu)
		
Agarosa (Sepharosa) ■  polysacharid tvořen z D-galaktosy 3-anhydrogalaktosy	Or -0^	CH2OH                    A—O       0_ ^VoJS/CH2°^ SI          /                ° OH
		
■    poly-{ß-1,3-D-galaktosa-a-1,4-(3,6-anhydro)--L-galaktosa} ■   sekundární a primární struktura je komplexní, vláknitá s přítomnými póry ■   přirozená je mechanicky labilní (zahřátím nad 40 °C se rozpouští)		Ä
-  modifikuje se zesíťováním pomoci epichlorhydrinu nebo divinylsulfonu -  ztratí se tím část využitelných hydroxylových skupin -  zesítěná je relativně stabilní (rozpouštědla mísitelná s vodou, pH 3 až 14), -  neměla by se nechat vyschnout		
Sepharosa
■    nejběžnější je Sepharosa CL-6B
-   zavedená firmou Pharmacia (Amersham Biosciences, dnes GE Healthcare)
-   CL = „crosslinked", 6B = 6% „beaded" agarose
-   póry dostatečné pro biomolekuly do 1 MDa, varianty 2B a 4B do 10 MDa
-   nosič dodávají i firmy BioRad jako Bio-Gel A a IBF jako Ultrogel
■    pro aktivaci vhodné metody zaměřené na hydroxylové skupiny
Sepharose	Forma (částice vesměs 90 |jm)
High Performance	6% highly cross-linked agarose (34 Mm)
6 Fast Flow	6% highly cross-linked agarose
4 Fast Flow	4% highly cross-linked agarose
CL-6B	6% cross-linked agarose
CL-4B	4% cross-linked agarose
6B	6% agarose
4B	4% agarose
Preaktivovane Sepharosy
NHS-activated Sepharose High Performance	12-atom. hydrofil. můstek, přes-NH2
NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow	viz výše
CNBr-activated Sepharose 4 Fast Flow	vazba primárních -NH2 skupin
EAH Sepharose 4B	10-atom. můstek, přes-NH2
ECH Sepharose 4B	9-atom. můstek, přes -COOH
Epoxy-activated Sepharose 6B	12-atom. hydrofil. můstek, přes-OH, -NH2 nebo -SH skupiny
Activated Thiol Sepharose 4B	10-atom. můstek pro reversibilní vazbu přes volné thioskupiny
Thiopropyl Sepharose 6B	4-atom. hydrofilní pro reversibilní vazbu proteinů a thiolovaných ligandů. Reaguje i s těžkými kovy, alkyl- a arylhalogenidy a dává adiční reakce s C=0, C=C a N=N vazbami
Preaktivovai/j i £3   íharosy
Chemical group           Length of            Structure cf spacer arm                            Product
on ligand                       spacer arm
Proteins, peptides, amino acids amino                          10-atom
None
10-atom carboxyl                       11-atom
thiol                             4-atom
10-atom 12-atom
^-°-^CN-.
^■O-^A^N-^.	^"--Am
OH	"-^^^^N^
011	N—'
	r-Q
OH	
HiTrap NHS-activated HP NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow
CNBr-activated Sepharose 4B CNBr-activated Sepharose 4 Fast Flow
ECH Sepharose 4B EAH Sepharose 4B
Thiopropyl Sepharose 6B Activated Thiol Sepharose 4B Epoxy-activated Sepharose 6B
Aktivace -OH v sacharidových matricích
■   epoxyskupiny (bisoxiran, epichlorhydrin)
■   bromkyanová metoda
■   divinylsulfon
CH,=CH-SO,-CH=CH,
R-NH2               (R-OH, R-SH)
|------OH
|------0-CH2-CH2-S02-CH=CH.
|------0-CH2-CH2-S02-CH2-CH2-NH-R
sulfonylchloridy
-  tosylchlorid = p-toluensulfonylchlorid
-  tresylchlorid = 2,2,2-trifluorethansulfonylchlorid
ci-sož    <\      ň    ch3 tosylchlorid
ci-so2-ch2cf3   tresylchlorid        r-nh2           ho-so2-ch2cf3
I------OH
I------O-SO-CHCF.
2   ^' '2^'   3
I-------NH-R
	Srovnání reakčních parametrů			
	Aktivní skupina	Reagující skupiny Ugandu	Reakční podmínky	
	epoxy	-NH2 -OH -SH -COOH	pH 5-12 doba 4 - 72 hod teplota 4 - 60° C	
	bromkyan	-NH2	pH 7-10, doba 1-12 hod, teplota 4 - 25° C	
	divinylsulfon	-NH2 -OH -SH	pH 6-11, doba 2 - 24 hod teplota 4 - 25° C	
	tresyl	-NH2	pH 7-9, doba 2-16 hod, teplota 4 - 25° C	
				
Množství navazovaného ligandu -kolik ho použít?
■   když ho máme dostatek
-  10 až 100x molární přebytek vůči přítomným reaktivním skupinám
■   malé biomolekuly
-  1 až 20 Mmol na 1 ml media (2 Mmol typicky)
■   proteinové ligandy
-  5 až 10 mg na 1 ml media
■   protilátky
-  5 mg proteinu na 1 ml media
■   velmi slabě interagující systémy
-  co nejvyšší koncentrace ligandu
-  vyšší koncentrace vede k vyšší vazbě
extranové nosiče
■    materiály Sephadex, Superdex
■    glukosové jednotky spojené 1,6 vazbou, větvení i přes 1,2 /1,3 a 1,4 spoje
■    mechanicky málo stabilní
■    náchylné na bakteriální degradaci
■    glykosidické vazby nestabilní při nízkém pH
Celulosa
•    použití není tak běžné, spíše v průmyslové oblasti
■   velmi často se objevuje ve formě membrán
•    lineární polymer z 1,4-ß-D-glukosovych jednotek
■    nativní polymer je ve formě vláken bez poresní struktury, reinformovaná celulosa je ve formě kuliček
>   snáší pH 3 až 10, stabilnější je při kyselé oblasti pH, při pH 7 může být autoklávována
■   vláknitá celulosa se dodává jako suchý prášek
-  Whatman, BioRad, Schleicher & Schuell
-   v roztoku je náchylná na mechanické poškození (NE magn. míchání)
•   aktivace - karbonyldiimidazol a divinylsulfon pp chloroformiát
-OH
CI-CO-0-CH,CH,
-OH      - HCl, CHjCHjOH
R-NH,
y<
■   celulosové částice, průměr kolem 450 um
Polyakrylamidové nosiče
v biochemické oblasti velmi oblíbené
připravují se kopolymerací akrylamidu a N,N'-methylen-
bis(akrylamidu), probíhá radikálovým mechanismem v přítomnosti
tetramethylendiaminu (TEMED) a peroxodvojsíranu amonného jako
iniciátoru
Bio-Gel P dodává materiál firma BioRad
-   póry poskytují vylučovací limity od 2 do 400 kDa
-   nízké nespecifické vazby
-   dobrá pH stabilita (2 - 10) nevýhodou je malá mechanická stabilita
-   variabilita matrice při změně složení pufrů
-   nízké průtočné rychlosti
aktivace se nejsnáz provádí částečnou hydrazinolýzou při 50 °C
-   dostupnejšou i preaktivované materiály (Enzacryl) glutaraldehydem - uplatní se adice amidové skupiny na dvojné vazby přítomné v polymerní formě glutaraldehydu.
Trisacryl
dodáváIBF
N-akryloyl-2 amino-2 hydroxymethyl-1,3 propandiol       i       *     2     '3    |             2      3
CO                     CO
H,C=C-CO-N-C(CH,OH),                                  I                         T
2      H            H            2      3                          -CH2-CH-CH2-CH-CH2-CH-
kopolymeracé:                     +                 -----------------*             ^        trisacryi
H,C=C-N-CO-C-C-CO-N-C=CH,                                   CH-OH
H    H          á   6           H   H                                             CH-OH
CO        NH-C(CH2OH)3
N,N'-diallyltartradiamid                                                    NH        co
-CH,-CH-CH,-CH-
tris(hydroxymethylové) uskupení poskytuje materiálu výborné
hydrofilní vlastnosti
zesíťovaný charakter přináší zlepšení mechanických vlastností oproti
polyakrylamidu
tolerance pH je od 1 do 11
snáší zmražení, teploty do 120 °C a organická rozpouštědla
aktivace je možná pomocí
-   karbonyldiimidazolu
-   bromkyanu
-   divinylsulfonu
ä^jjhacryl
na bázi dextranového gelu s vnesenými allylovými postranními skupinami zesíťovanými pomocí N,N'-methylen-bis(akrylamidu) obsahuje tedy lineární glukosove řetězce spojené přes molekuly bis(akrylamidu) a také lineární části polymerního bis(akrylamidu) vyrábí Pharmacia
Sephacryl S-300 a S-400 - vylučovací limity 1,5 a 8 M Da gely HR řady - vylepšené průtočné vlastnosti materiál je dostatečně chemicky i mechanicky odolný aktivace - přes sekundární hydroxylové skupiny
Jiakrylátové matrice
O              CH2OH    O
H2C=C-C-0-CH2-<C-CH2-0-W-C=CH2 CH                 CH2OH         CH3         |
CH,0             OH
I      3   II                    |
CH, I 2 CH,
H,C-
H-l-O-C-C-l-OH H    H
0        o
II              / \
H,C=C-C-C-C-CH,
2       i          H, H        2
CH,        2
O
I CH,
I   2 HC-OH
I
C.......
H,
o-c—c-c-£-o-c—c-]^-o-
rL   n    H-           H-   H-
TSK
I pentaerythritol dimethakrylát
II polyethylenglykol
III glycidylmethakrylátu
TSK-Gel Toyopearl (vyr. Tosoh, distribuce Merck jako Fractogel TSK) -  kopolymerace glycidylmethakrylátu, pentaerythritol dimethakrylátu a polyethylenglykolu - velký počet hydroxylů a etherových vazeb
částečně hydrofilni, výborné mech. vlastnosti, tolerancí pH 2 až 12 velikosti S („superfine", 20 až 40 um), F („fine", 30 až 60 um) a C („coarse", 50 až 100 um) střední typ rozsah 50 kDa až 5 MDa - nejvhodnější pro afin. separace
o ii
H2C=C-C-0-CH2-CH2-OH
CH3                                    _____
+ O                           O
II                            II
H2C=C-C-0-CH2-CH2-G—C-C=CH2
CH20
O   CH,
HEMA
H,C-
HO-CH,-CH,-0-
O   CH,     >| II     I   2 -CH,
-o-c-c-o-
CH,
CH,
CH,
-j-CH3 CH, O
H,C-
L0-CH,-CH,-OH
CH,
H,C-
-o-c-c-o-
-CH,
CH,
O   CH,
poprvé připraven v Československu
-   distribuován pod názvy Separon a Spheron
-   vzniká kopolymerací 2-hydroxyethylmethakrylátu se síťujícím ethylendimethakrylátem
-   zesíťovaná struktura vytváří makro i mikropóry, které poskytují vysokou odolnost vůči tlaku
chemická odolnost je pro pH 2 až 12
-   krátké promytí je možné i 2 M NaOH či 2 M HCl tepelná odolnost až do 170 °C
dodávané velikosti částic jsou 5,10 a 60 um
-   v tuzemsku nyní vyrábí firma Tessek
-   k dispozici i předaktivované matrice s různými reaktivními skupinami
H2C=C-C-NH-CH. CH3 + H2C=C-C-NH2 CH3 + H2C=C-C-0-C-2      H   H2        H2	0 II -NH-C-0 /\ -C—CH H	-C=CH2 CH3	ÓH2 Ä               ?"2 H,C—C-C-O-C-CH 2        H   H,        H,   1 2CH20 1   í m	N-H	-c-H2	-N-H	i Eupergit ČH2 CH20 1   2 n HC—C-NH, 1                 2 0   CH, II     1   2 -C-CH in                                                0 CH2                   /X HC-C-O-C-C-----CH, 1    H,        H, H           2 CH2 2          2
		2	0   CH, n     l   2 H2N-C-C-CH3 CH2				
-   kopolymerací methakrylamidu, N,N'-methylen-bis(methakrylamidu) a složky s oxiranovou skupinou, glycidylmethakrylátu nebo allylglycidyletheru (na obr. dole)
-   Rohm Pharma, v USA jako Spectra/Cryl porézní částice 30,150 a 250 |jm, neporézní 1 um
-   mechanická stabilita výborná
imobilizace probíhá adicí na oxiranové uskupení
-   reagovat mohou primární aminy, sulfhydrylové skupiny či hydroxyly
-   doporučována přítomnost fosfátového pufru, urychlí se tím reakce a může probíhat blízko neutrálního pH
■ ■ ■	^ Jyamidové nosiče polykondenzační reakce -   Nylon 66 z 1,6-diaminohexanu a hexan-1,6-dikarboxylové kyseliny -  tuzemský Silon vzniká kondenzací c-kaprolaktamu -   ve formě membrán, sítek, kuliček a trubiček pro imobilizaci enzymů přirozený materiál má pro imobilizaci málo volných konc. skupin -  je nutné jeho strukturu částečně narušit opatrnou hydrolýzou -   asi 3 M HCl, doba působení závisí na formě materiálu, 10 sec až 1 hod aktivační postupy, které amidovou vazbu nepřerušují -   O-alkylace peptidové vazby oxoniovou solí (triethyloxonium tetrafluoroboritan)            - dimethylsulfátem -   vzniklý imidoester reaguje v slabě alkalickém prostředí s aminoskupinou (lyzin, 1,6-diaminohexan) za vzniku amidinu -   kladný náboj zvyšuje polaritu polymeru -   získá se větší povrchová hustota využitelných karboxy nebo aminoskupin -   na trhu dostupná řada aktivovaných membrán	
	/C-NH— <CH3)2S04_C=^H_   R-NH2     —C=NH\ 'II                                    fc    I                                    fc   I           \	
	0                                           >    ÜCH3            -CH3OH   *NH"K Aktivace polyamidu dimethylsulfátem	
		
Skupinově specifické ligandy
■   interaguje s třídou podobných biomolekul - skupinová separace	
NAD+, NADP+, Blue B	dehydrogenasy
5'-AMP, Blue F3G-A	NAD+-dependentní enzymy
2,,5'-ADP, Red HE-3B	NADP+-dependentní enzymy
kalmodulin, Blue B	kinasy
glutathion	glutathion-S-transferasa (fúzní proteiny)
chitin	chitin vážící protein (fúzní proteiny)
amylosa	maltosu vážící protein (fúzní proteiny)
Green A	CoA proteiny, HSA
benzamidin	serinové proteinasy
heparin	lipoproteiny, hormony, DNA, RNA
polymyxin	endotoxiny
konkanavalin A	gluko- a manopyranosylové zbytky
poly U, oligo-dT	poly(A)+mRNA
Cibacron blue F3G-A
>    příklad racionálního návrhu skupinově specifického ligandu
>    původně textilní barvivo
>   váže se pevně do aktiv, místa dehydrogenas namísto přirozeného substrátu NAD+
-   antrachinonová část - odpovídá adeninové kapse
-   diaminobenzensulfonát - interaguje s guanidinovou skupinou Arg zbytku
-  triazinový cyklus - atom chloru se váže v pyrofosfátovém místě
•   substituenty X a Y pak jemně dolaďují afinitu ligandu
-   nejvyšší afinitu má derivát s -COOH v meta poloze (Y)
-   vliv na velikost disociační konstanty a tím pevnost vazby na afinitní nosič
•    další aplikace - odstranění albuminu
•   vazba na nosič - substituce v místě chloru triazinového cyklu, např. Blue Sepharose
SO,H-
SO,H
SO, H
SO, H
SO, H
polycyklické barvivo vykazující jistou strukturní podobnost k NADP+ dále interagují albumin, lipoproteiny, interferon, koagulační faktory -  méně specifické - elektrostatické a hydrofobní interakce
Polystyren
>   zejména požíván jako materiál pro mikrodestičky
>    nejjednodušší imobilizace - adsorpce proteinů na povrch na základě hydrofobních interakcí ("coating" protilátek)
- třeba vysytit zbývající vazená místa vhodnou inertní bílkovinou (albumin, kasein, želatina, sušené mléko bez tuku,...)
>    imobilizace malých molekul - třeba kovalentní vazby
>    modifikace PS - nitrace a redukce poskytnou povrchové
aminosk	upiny				
hO	HNO3, H2S04 ,     1	-G	Zn, HCl \	-G	^NH2
	1		^N02		
komerčně dostupné (Nunc) i modifikované mikrodestičky
-   "vážící aminosloučeniny"
-   se streptavidinem
Monolitické kolony
1   poresní chromatografické sorbenty ve formě vyplňující celý separační prostor
-   Hjerten 1989 - PAG - "continuous bed"
-   Švec a Frechet 1992 - "monolith" na bázi makroporesního org. polymeru 1   polymerace uvnitř kolony (i kapilární)
-   polyakrylamid a methylenbis(akrylamid) nebo piperazindiakrylamid
-   styren a jeho deriváty, síťovadlo divynylbenzen
-   deriváty methakrylát - butylmetakrylát, methakrylová kyselina, glycidylmethakrylat, zesíťujíse ethylendimethakrylátem (Bioseparations)
>   modifikované silikagely, spečené chemicky modifikované
silikagelové částice (Chromolith, Merck) '   kombinace malých ("mesopores", vhodné
pro imobilizace ligandů, nm rozměry, difuse)
a velkých ("through pores", zajišťují tok
kapaliny, um rozměry, konvekce)

Monolitické materiály
■   porogenní rozpouštědla: A MeOH, B 75% EtOH, C 75% PrOH, D 75% dodekanol
CIMs
>   "convective interaction media" - separační monolitický materiál ve formě disků - výborné průtočné vlastnosti díky převažující konvekci
-   celý tok media jde přes separační oblast, u časticových nosičů dochází k neefektivnímu obtékání částic
-   průtočné rychlosti až o řád vyšší bez vlivu na separační vlastnosti a vazebnou kapacitu materiálu
-   kombinovatelnost různých materiálů v jednom "sloupci" - sériové spojení různých disků
CTtf* mntnlins
Column volonte
How tato applied
lime - loWňQ fiCV}
Tims-station fWCV)
Time- eůtíilib&tiofí ($CV)
Jims- totalocnun
Q34tn!
tmtlmln t1l.acwmtol
QAmiA
Porom particle
I ml
Iml/min
dCVMai
fitted with standard 1/16~ 0DUtiFlQ-32VALC0-type connectors, me column tan be fitted to any LCHPLC. or RA system.
S mín
Tne nouslng csn He supplied In
two different plastic versions:
POM (tmie s white) end
PEEK (brown).
Disks are easily placed Into the housing allowing simple column Handling: last, efficient, and Inexpensive screening of different chemistries.
The housing can accommodate up to 4 disks By packing the same chemistry, the volume (capacity) and length can be Increased, by packing different chemistries, one can perform Conjoint Liquid Chromatography (CLC).
Kombinace AC / IEC     Selektivní frakciona c e
Quantification ol impurities in IgGs
Transferrin and albumin are often present in IgG concentrates and are considered impurities. It is important to determine their concentration in order to obtain a well-characterized biological product. Two CIM® Protein G disks and one CIM® quaternary amine (QA) monolithic disk were placed consecutively into one housing forming a CLC monolithic column allowing a complete separation of all three proteins in less than 5 minutes. Underthe applied binding conditions, the IgGs were captured on the Protein G disks while transferrin and albumin were bound to the QA disk. Subsequently, transferrin and albumin were eluted separately by a stepwise gradient using sodium chloride, whereas the IgGs were released from the Protein G ligands by applying a low pH. This validated method permits the quantification of albumin and transferrin in IgG concentrates.
From:BrsnoviCetal. (Oclapharms), J. Immunol. Meth, 2002, 271, 47-50
				>
| o.ořs 1 S   0.O5S-1 8 °-°35-				
S		1		
	,.r			
				
Peak 1: Transferrin Peak 2: Albumin Peak 3: IgGs
pH
0.25 ml (amount of IgG sample was 8mg)
20mMTriS-HCI(pH7.Q)
20mM Tris-HCl + 1 M NaCl (pH 7.0)
Q.1MŮIycírie-HCl(pH2.6) R m* lala   4 ml/min Column     2ClMc,ProteííiGůísks + 1 ClM^QA disk
Bradykinin (BK)           Bovine serum           Succinyiated BSA       Conjugate ofBK with
1.5mg/mt                  afbumin (BSA)          ßSA-S) 3.0mg/mi     BSA (BSAS-BK)
disk                          3-0 mg/ml disk         disk                          7.4 mg/mi disk
Sample     500 pi rabbit blood sera (proteins: 2 mg/ml) Buffer A     10mM phosphate, 15ÜmM NaCl (pH 7.0) Buffer B    10mMHCI(pH2.Q)_____________________
I mobilizace enzymů
'   enzymy - průmyslové použití
-   biokatalytické konverse
-   bioanalytické aplikace, enzymové sensory
1   ekonomický aspekt - snížení výrobních nákladů enzymových procesů
díky opakovanému použití 1   dlouhodobá stabilizace enzymové aktivity >   snadná separace výsledného produktu
-   dvoufázový systém, enzym zachycen na heterogenní fázi
-   substrát, produkt volně v roztoku
-   realizace kontinuálně pracujících procesů (enzymové reaktory) 1   nevhodné, pokud je i enzymový substrát nerozpustný
Ideální nosič enzymu
■   levný, inertní, mechanicky pevný, chemicky stabilní
■   zachovává nebo zvyšuje specifitu enzymu (dána poměrem A^KJ
■   snižuje inhibici enzymu produktem
■   posunuje pH optimum enzymu žádaným směrem
■   zabraňuje mikrobiální kontaminaci
■   omezuje nespecifickou adsorpci
Způsoby imobilizace
•    a adsorbce
■    b kovalentní vazba '   c zachycení v polymeru,
"entrapment" '   d zachycení v membránovém váčku, "cofinement"
Volba nosiče
■    nízká cena (po zničení enzymové aktivity se vyhodí)
•    drahé nosiče - při malém rozsahu procesu, případně pokud je lze použít opakovaně (opakovaná imobilizace enzymu)
•    uplatní se forma, tvar, mech. stabilita, hustota, porosita, distribuce velikosti pórů, povrchový náboj (posun pH optima reakce), hustota reaktivních skupin (vazebná kapacita)
•   speciální vlastnosti
-   magnetismus
-   rozklad nežádoucích produktů (Mn02 a peroxid vodíku)
-   povrch s redukčními vlastnostmi (Ti02)
Geometrické uspořádání
■    částice („beads")
-   definovaná velikost a porosita
■   filmové povlaky
-  tenké vrstvy na vhodném neutrálním nosném materiálu •   membrány
-   současně je možné realizovat biokatalytickou reakci a separaci na základě rozdílné velikosti substrátu a produktu
■   vláknité materiály
-   vysoký podíl povrchu - velká objemová aktivita 1    pěny - zachycení uvnitř (polyurethany)
Struktura
-   mikroporesníO.1 až 10 nm
-   mesoporesní 3 až 10 nm - srovnatelné s velikostí enzymů
-   makroporesní 8 až 1000 nm, povrch 25 až 100 m2/g
-   neporesní - výborná průtočnost, ale malá kapacita a malý povrch
-   gelovitá - nemá stálé póry, ty vznikají až při nabobtnání; obdoba neporesního uspořádání
Adsorpce enzymů na nosič
■   jednoduchý, široce použitelný postup - velmi mírné podmínky, zachování aktivity - není kovalentní vazba, není narušení konformace
■    reversibilita - jak enzymu (purifikace), tak vlastní matrice - obojí lze regenerovat a použít znovu
■    možnost vysokých obsahů (až 1 g enzymu na 1 g nosiče)
■   ale slabá interakce - enzymy se mohou postupně spontánně uvolňovat z matrice
■   zúčastněné interakce
-   nespecifické (van der Waalsovy síly, vodíkové můstky, hydrofilní interakce): CPG, silikagely
-   biospecifické - přes ligand interagující s enzymem (mimo aktivní místo)
-   interakce s imobilizovanými barvivy nebo ionty kovů
-   iontové interakce (ionexy)
-   hydrofobní interakce: PET, HDPE, polyethylentereftalát, latex (polystyren), poly(ST-DVB), amberlit XAD, silikáty, zeolity, talek
■    částečná desolvatace v průběhu vazby na nosič, může docházet ke změnám konformace
-   stabilizace, změny aktivity a specifity katalyzované reakce
Iontové interakce
■   syntetické pryskyřice (SP)
-   kopolymery akrylamidu a kys. maleinové nebo itakonové, fenolformaldehydové kondenzáty
■   SP s povrchovými skupinami - Dowex, Amberlit, Duolit
■    polysacharidové deriváty - DEAE-celulosa, DEAE-dextran, DEAE-Sephadex, CM-celulosa, CH-Sepharosa, AH-Sepharosa, Q-Sepharosa, S-Sepharosa
-   DEAE ... diethylaminoethyl, CM ... -0-CH2-COOH, CH ... -NH(CH2)COOH, AH ... NH-(CH2)6-NH2, Q ... -CH2-N+(CH3)3, S ... -CH2-S03H
-   všeobecně velmi hydrofilní materiály, náboj závisí na pH okolního roztoku
■    důležitou roli hrají podmínky, zejména pH, při adsorpci
Invertasa	Typ nosiče	
% vazby	DEAE-Sephadex (anex)	CM-Sephadex (katex)
pH2.5	0	100
pH4.7	100	75
pH7.0	100	34
Kovalentní imobilizace enzymů
>    poresní / neporesní nosiče, vzájemná velikost pórů a molekul enzymu
>    povrchová hustota navázaných molekul
1   reaktivní skupiny vhodné pro kovalentní imobilizace
■   a anhydrid, b karbonát, c aldehyd, d epoxid, e azid, f isothiokyanát, g nitrofenylester karboxylové kyseliny, h azlakton
■   typické množství 0.02 g enzymu na 1 g nosiče
	Relativní užitečnost aa pro imobilizaci						
	AA zbytek	Obsah	Dostupnost	Reaktivita	Stabilita spojení	Použití	
	Asp	+	++	+	+	+	
	Arg	+	++	-	+	-	
	Cys	-	+	++	-	-	
	cystin	+	-	+	+	-	
	Glu	+	++	+	+	+	
	His	+	++	+	+	+	
	Lys	++	++	++	++	++	
	Met	-	-	+	-	-	
	Ser	++	+	+	+	+	
	Thr	++	+	+	+	+	
	Trp	-	-	-	+	-	
	Tyr	+	-	+	+	+	
	C konec	-	++	+	+	+	
	N konec	-	++	++	++	+	
	sacharid, zbytek	- ~ ++	++	+	+	+	
							
							
Orientace enzymu
■    nesmí dojít (a) ke změně konformace vazebného místa, aby docházelo k optimální vazbě substrátu (b)
■    nevhodné je nepřístupné aktivní místo (c) v důsledku sterické zábrany
■    méně efektivní až nefunkční může být vazebné místo deformované v důsledku distorse (d)
■   v obou případech může pomoci "oddálení" molekuly enzymu od nosiče použitím vhodně dlouhého raménka (spacer, linker,...)
Zachycení enzymu v polymeru
■    může se jednat o čistě fyzikální zachycení na základě velikosti
-   v gelu, zapolymerování uvnitř vhodné matrice
■    kombinace zachycení a kovalentní vazby
-   derivatizace lyzinových zbytků akryloylchloridem CH2=CH-CO-CI
-   vzniklý na enzym vázaný akrylamid se pak kopolymerizuje s klasickou směsí akrylamidu a bisakrylamidu
■   vhodné pro imobilizaci "komplexnějších" systémů obsahujících daný enzym (buňky, organely,...)
■    metoda je vhodná pouze pro enzymy účinkující na nízkomolekulární substráty
■   stabilita chymotrypsinu
■   v závislosti na způsobu imobilizace
-   volný (a), derivatizovaný akryloyl Cl (b)
-   zachycený v polymethakryl. gelu (d), kombinovaně (c)
Silové matri
•   enzym se zachytí v průběhu přípravy gelu
- alginát, chitosan, želatina, PAG, PVA plus MNOHO dalších polymerů
•   vznikne tak monolitický materiál
enzym se nechá vsáknout do hotového gelu ve formě kuliček
(Sepharosa, Sephadex) a následně se chemicky zesíťuje
(glutaraldehydem)
prosté zesíťování nedává geometricky definované tvary
"smart" polymery - mění vlastnosti pod vlivem externích vlivů (pH, teplota, iontová síla) a mohou tak cíleně např. uvolnit vázaný enzym do roztoku
Sol-gel imobilizace
■   sol-gel proces - vznik „skla" hydrolytickou polymerací monomole-kulárních prekursorů (CH30)4Si tetramethyl-o-křemičitan (TMOS):
(CH30)4Si + H20    ^^     (CH30)3Si-OH + CH3OH
2 (CH30)3Si-OH     ^^     (CH30)3Si-0-Si(CH30)3 + H20
2 (CH30)3Si-OH     ^^     (CH30)3Si-0+-Si(CH30)3 + OH"
y          H                      SOl
enzym  ^^^      /   gelovatění SixOy(M-OH)z(t-OH)4x.2y.2z     gel
■/
zachycení v pórech /     stárnutí a vysychání
SixOy + zH+ + (2x-y-z) H20     xerogel (mech. stabilní)
Zachycení v membránových systémech
•   enzym je od pracovního prostředí oddělen semipermeabilní membránou, průchozí pro substráty a produkty
•    membránová dutá vlákna "hollow fiber membranes" obsahují enzym uvnitř, pracovní roztok proudí okolo
-  povrch membrány i více než 20 m2/l
•   jednoduché - není třeba nic optimalizovat
•    relativně drahé
membrána může být i ve formě váčků ("droplets")
-   enzym se rozpustí ve vodném roztoku 1,6-diaminohexanu
-   disperguje se v roztoku 1,6-hexandiové kyseliny v chloroformu
-   vzniknou kapičky enzymu obalené tenkou membránou z nylonu (Nylon-6,6)
je možné použít i liposomy s enzymem uvnitř
Srovnání imobilizačních postupů
Charakteristika	Adsorpce	Kovalentně	Entrapment	Zachycení v membráně
Příprava	snadné	obtížné	obtížné	snadné
Náklady	nízké	vysoké	střední	vysoké
Vazebná síla	různé	silné	slabé	silné
Unik enzymu	ana	ne	ano	ne
Použitelnost	široká	selektivní	široká	univerzální
Pracovní problémy	vysoké	nízké	vysoké	vysoké
Matricové efekty	ano	ano	ano	ne
Velká difúzni bariéra	ne	ne	ano	ano
Ochrana před mikroby	ne	ne	ano	ano
I    imobilizace na pH optimum enzymu
náboj nosiče posouvá pH optimum
důsledek partitice H+ iontů v mikrookolí enzymu na povrchu nebo v
pórech nosiče
posun pH pracovního roztoku může být výhodný pro zlepšení
rozpustnosti substrátu či produktu
nativní enzym v roztoku
imobilizace na kladně nebo záporně nabitý nosič
UjJuzní vlivy
substrát se musí dostat z okolního prostředí do aktivního místa překonává se nemíchána vrstva na povrchu nosiče - externí difúze poté se pohybuje uvnitř pórů nosiče - interní difúze koncentrační gradienty substrátu a produktu v případě poresního nosiče
a pouze reakce a interní difúze b navíc partitice S a P v mikro prostředí nosiče c jako a, navíc externí difúze d kombinace difúzních a parti-tičních efektů
partitiční vrstva je cca 1000x tenčí než difúzni vrstva
Difúzni kontrola enzymové konverze
1   při imobilizování velkého množství enzymu se jeho aktivita jakoby zdánlivě ztrácí
1   efektivní aktivita enzymu na nosiči je mnohem menší než teoreticky navázaná - důsledek difúzních problémů - omezený pohyb substrátu
>   pozitivní projev - zdánlivá stabilizace imobilizovaného enzymu
aktivita
nalezená aktivita
skutečně přítomná
nalezená
vnesená aktivita
cas
Enzymové biosensory
>    imobilizace enzymu na povrch fyzikálně-chemického převodníku
>   využívají se postupy imobilizace zmíněné dříve i další speciální metodiky
1   nejčastější jsou enzymové elektrody - kombinace enzymu a
elektrochemického převodníku 1   enzymové optody (optrody) - analogie, nosičem je ale obvykle
světlovod (optické vlákno)
Rozdělení membir
■   membrána = porézní prostředí, rozdělení:
■   hrubě porézní - póry nad 5 nm (skelná frita), permeabilitu ovlivňuje rozdíl hydrostatického tlaku na obou stranách, osmotický tlak se neuplatňuje (pokud polymer membrány neinteraguje s rozpouštědlem); permselektivita je velmi špatná až žádná (prochází všechny látky)
■   jemně porézní - póry 1 až 5 nm (např. acetylcelulosa), rozpouštědlo prochází konvekcí a difúzí, permeabilita je dána velikostí rozpuštěných látek
■   neporézní (husté) - nevykazují porézní strukturu, rozpouštědlo prochází pouze difúzí
Příprava membrán
■   je potřeba pečlivě kontrolovat podmínky (vlhkost, teplota), které silně ovlivňují vlastnosti vznikajících membrán
■   fázová konverze - roztok polymeru ve vhodném rozpouštědle se nalije na pevný povrch a vyčká se odpaření rozpouštědla
-   polyvinyl chlorid (tetrahydrofuran - THF), acetylcelulosa (aceton), polyethersulonát (dimethylsulfoxid) nebo polyurethan (THF, aceton)
-   vyšší vlkost a nižší teplota okolí - vznikají větší póry
-   nalití roztoku polymeru v org. rozpouštědle nemísitelném s vodou na vodní hladinu, zde se na rozhraní utvoří asymetrická membrána
■    poivmerace z mono či oligomerů přímo na místě použití (tvorba „in situ") -vhodná k přípravě fragilních gelovitých membrán (polyvinylalkohol, polyakrylamid), které obsahují velký podíl vody
■   dodatečná tvorba pórů - tzv. nukleární membrány (Nucleopore)
-   vrstva polymeru se „prostřílí" urychlenými nukleony, lokálně narušená struktura polymeru se naleptá a vzniknou póry
-   velmi dobrá reprodukovatelnost a homogenita pórů o poměrně přesně definovaném průměru
-   lokální změny lze vyvolat mechanickým natahováním (polyenové membrány, obsahující krystalické a amorfní oblasti, v amorfních pak následně vzniknou póry)
Úpravy membra
Nucleopore membrána
■   velikost pórů membrány lze dodatečně změnit:
■   zvětšení průchodnosti se dosáhne naleptáním polymeru membrány, které vede ke zvětšení průměru pórů
-   alkalická hydrolýza acetylcelulosy nebo polykarbonátů
■   zmenšení průchodnosti a zlepšení permselektivity se dosáhne depozicí vhodných látek uvnitř pórů
-   např. organosilanů nebo lipidických látek
■   symetrické membrány - obě strany jsou rovnocenné, průchodnost oběma směry je stejná
■   asymetrické membrány - připravují se na rozhraní dvou fází
Bi  kompatibilita
při použití biosensoru v živém organismu (in vivo) nebo v klinické
praxi při kontaktu zejména s krví (in vitro)
při kontaktu povrchu membrán s prostředím dochází k adsorpci
proteinů - zejména albuminu a fibrinogenu na povrch
pak se vytváří další vrstva krevních destiček (koagulační
trombóza)
při dlouhodobé implantaci dochází k zarůstání biosensoru tkání
postupné snižování citlivosti důsledkem snížené prostupnosti
biosensor může vyvolávat rušivé reakce u živého organismu
-   srážení krve, zánětlivé procesy
je potřeba povrch biosensoru povléknout vhodnými polymery
-   silikon, polytetrafluorethylen a zejména polyurethany modifikovat povrchní obal
-   hydrofilizace, konverze aminoskupin na hydroxyskupiny do vnější vrstvy vpravit látky omezující rušivé reakce
-   fosforylcholin, fosfolipidy, heparin
Mecha»] j^ zachycení enzymu
■    nejjednodušší - kápne se roztok biokomponenty na povrch převodníku a překryje se dialyzační membránou
■   alternativní metodou je zachycení biomolekul uvnitř vhodného polymeru (inkluze), polymerní vrstva se vytvoří na povrchu podpůrné dialyzační membrány
Zachycení v gelu
-j   želatina je často používána pro enzymové membrány; 5% roztok se rozpustí při zvýšené teplotě (až 50 °C) a přidá se enzym, promíchá se a naleje na podložku (např. dialyzační membrána)
■   Nafion je polymer rozpuštěný ve směsi alkoholů s vodou
-   používá se pro tvorbu permselektivních membrán -jako iontoměnič
-   může zachycovat biomolekuly
h[(CF2-CF2)m-CF-CF2]n-O
I CF
Nafion
\
CFo—CF-
-CF2-CF2-
-SO3H
Zachycení v PVA
polyvinylalkohol (PVA) je hydrofilní, neutrální a biokompatibilní polymer, ve vodě silně bobtná; dostupný ve formě oligomerů (90 kDa), které po zesíťování vytvoří konečný polymer radiační polymerace využívá ozáření směsi oligomerů a enzymu y-zářením (generuje 60Co)
-   vzniklé radikály vyvolají další polymeraci a zesíťování
-   výsledná membrána neobsahuje žádné nežádoucí produkty a současně je sterilizovaná
chemické síťování - triisokyanát\ (TIC), spojí postranní hydroxyly
UV polymerace - PVA obsahující styrylbipyridiniové skupiny (PVA-SbQ, 1.3%) - vůbec nejšetrnější postup imobilizace pomoci PVA
NCO
—N=C=0   .HO---------► —NH—C-O—
zesítění
O
Multifunkčni polymery
kombinují imobilizaci enzymu s polymerní strukturou nesoucí skupiny mediátorů přenášející elektrony, tzv. redox relays poly-4-vinylpyridin (oligomer kolem 50 kDa) se částečně využije pro tvorbu komplexu s osmiem (mediator), a částečně se do něj kvarternizací zavedou aminoskupiny
směs modifikovaného oligomeru, enzymu a bifunkčního činidla PEGDE (polyethylenglykoldiglycidylether) se nanese na elektrodu
4-CH2-CHJ—
pare. komplexace (1/6) + Os(bpy)2CI2
kvarternizace
+ 2-bromoethylamin
.V
Os(bpy)2CI
PEGDE
H2C-CH-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2CH-CH2 O                                                          O
M
0   ©
-I
0 ©
Zesíťování enzymu na povrchu
0=CH—(CH2)3-CH=0 glutaraldehyd
-CH=0
I,
H2N-
retikulum
Schiff ova báze -CH=N—
I   redukce (NaBH4)
-CH2-NH—
nejčastěji se používá glutaraldehyd; směs s roztokem bílkoviny v závislosti na koncentraci složek vytváří spontánně retikulum buď přímo na povrchu sensoru, nebo na vhodném podkladovém materiálu (polyamidová síťka, dialyzační membrána)
reakcí mezi aldehydovou skupinou činidla s aminoskupinou bílkoviny (postranní lyzinové zbytky) vzniká propojením Schiffova báze -   může se zredukovat na stabilnější aminovou vazbu
I mobilizace pomocí elektropolymerace
■   využívá elektrochemickou oxidaci k přípravě reaktivních monomerů, které pak spontánně vytváří polymerní film na povrchu elektrody
■   filmy se dají vytvořit i na členitém povrchu nebo na povrchu mikroelektrod (cílená modifikace)
■    pokud jsou v průběhu elektropolymerace v roztoku přítomné biomolekuly, dochází k jejich zachycení uvnitř vznikající membrány; méně se může uplatnit také kladný náboj polymeru
■   vlastnosti membrány je možné ovlivnit přídavkem dalších látek do elektropolymerační směsi
■   tloušťku membrány určuje velikost prošlého náboje, tak se dá snadno reprodukuvatelně ovlivnit množství imobilizované biomolekuly
■    některé elektropolymerní vrstvy mohou být navíc vodivé, což usnadňuje přenos elektronů mezi elektrodou a biomolekulami
- tyto polymery jsou obvykle barevné
Polypyrrol (PPY) ■    klasický příklad, provádí se oxidací 50 až 200 m M pyrrolu amperometrickou oxidací při potenciálu kolem 0.8 V, jako elektrolyt se přidává KCl, pracuje se v anaerobním prostředí ■   tloušťka filmu je úměrná množství prošlého náboje (5 mC/cm2 odpovídá 13 nm), lze dosáhnout až 100 nm tlustých vrstev ■   vzniklý PPy film je vodivý, vodivost dosahuje asi 500 S/cm -  pro srovnání jsou vodivosti mědi 106, křemíku 1(H a skla 1011 S/cm). ■    obdobně probíhá elektropolymerace methylpyrrolu				
			+ X" n	
	n \ y anoaa N       -ner H			
				
Polyfenylenoxid (PPO)
velmi tenké a mechanicky stabilní filmy PPO na povrchu elektrod
vznikají elektropolymerací fenolu
nevodivé, takže elektropolymerace se samovolně zastaví, jakmile
je povrch elektrody elektricky izolován
průběžně se dá pozoroval
pokles oxidačního proudí
při vzniku filmu:
k
potenciál
Elektropolymerace fenolu
amperometricky a cyklickou voltametrií
méně stabilní jsou polyanilinové (PANI) filmy vzniklé z anilinu:
Kontrolní membráuy
elektropolymerní vrstvy jsou také vhodné pro ovlivňování transportu látek jako kontrolní membrány - polvfenvlendiaminové (PPD) filmy z 1,2 diaminobenzenu
nevodivé o tloušťce kolem 10 nm; snadno přes ně prochází peroxid vodíku, přitom jiné rušivé látky jsou odstíněny
protože zachycení bílkovin uvnitř polymeru je poměrně volné, dochází časem k uvolnění do roztoku a tím k poklesu aktivity
jiné postupy proto používají elektropolymerní film jen jako výchozí chemickou modifikaci povrchu elektrody, a film se pak dále upravuje chemickými reakcemi.
j IM  difikace elektropolymerü
polypyrrol se dá nitrovat v ß poloze a elektrochemickou redukcí nitroskupiny se získá aminoskupina vhodná pro další kovalentní vazbu biomolekul:
	f	H ">	H		H	
	-ty i	-o-	l CuN03                        /^	elektrochemická	<i	r
			acetanhydrid              ^___^	1       redukce		
V   H		j	Derivatizace PPy	\o2		\h2
jinou možností je reakce PPy s nitrobenzoylchloridem, nitroskupinu je pak možné redukovat také chemicky zinkem v kys. octové:
				r	-""N-	/N02
	h		p-nitrobenzoylchlorid		J	
			-HCl			
Lh		j		VJ		
Elektropolymerace bílkovin
elektropolymerovat se dají také vhodné deriváty biomolekul ve směsi např. s pyrrolem
k postranním skupinám enzymů je možné připojit pyrrolovajadra, takže po skončení elektropolymerace je enzym nedílnou součástí řetězce polymeru:
1.  karbodiimid N—(CHzJzCOOH---------►
2.  enzym E
//
O
N—(CH2)2-CS
NH^e)
■   podobně je možné využít i derivát s koncovou aminoskupinou
Aktivace inertních povrchů
■   pracovní povrch sensorů tvoří malá skupina poměrně inertních materiálů: sklo, křemík, různé modifikace uhlíku (grafit, skelný uhlík, kompozitní směsi) a ušlechtilé kovy (zejména zlato a platina)
■   některé biomolekuly se na tyto materiály adsorbují s různou pevností, avšak spolehlivá a dlouhodobě stabilní imobilizace vyžaduje kovalentní vazbu mezi biomolekulou a povrchem
■   prvním krokem imobilizace jsou aktivační postupy, které na málo reaktivní povrch sensoru zavádějí reaktivní skupiny schopné pak kovalentní vazby s biomolekulami
Spontánní vznik monovrstev ■    monovrstvy (SAM, „self-assembled monolayer") -   molekulární soubor vzniklý samovolnou organizací molekul aktivního surfaktantu na nosném substrátu, který se ponoří do jejich roztoku ve vhodném rozpouštědle -  tři části molekuly - povrchově aktivní skupina (pevně se váže na povrch, head), alkylový spojovací můstek, koncová funkční skupina (na povrchu monovrstvy, tail) ■    1940, Zisman - Pt v roztoku amfifilních molekul se stává hydrofobní - monovrstva ■    1983, Nuzzo a Allara - thioly na zlatě ■    další SAM: -   alkylsilany na hydroxylovaných površích (např. Si02) -   mastné kyseliny na povrchu kovů		
- alkylfosfoniové soli na zirkonu	mmm/}	
	f\u	
	Si	
		
		
spontánní vznik monovrstev
Au-S monovrstvy - vznik velmi pevné vazby mezi zlatem a sírou
Au
+ S-(CH2)2-NH2 S—(CH2)2-NH2
Au
|—S—(CH2)2-NH2 I— S—(CH2)2-NH2
Adsorpce thiosloučenin na zlato
Organizovaná vrstva      zmenšení hustoty skupiny zředěním inertním thiolem
nejběžnějším příkladem je velmi pevná adsorpce thiosloučenin na povrchu zlata vhodnou volbou dalších funkčních skupin thiolu nebo disulfidu lze získat reaktivní skupiny využitelné pro další imobilizační kroky
Thiosloučeniny
používají se thioly obsahující v molekule další vhodnou funkční skupinu
aminoskupina - nejběžnější, monovrstvy na bázi krátkých řetězců - dobře prostupné, vhodné pro elektrochemické aplikace
hydroxyskupina - slouží spíše pro inaktivaci povrchu, vnesení hydrofilního charakteru a zabránění nespecifickým vazbám biomolekul butanol 12-merkaptododekanol, 16-merkapto-hexadekanol
merkapto-ethanol / propanol /
karboxyskupina - vhodná pro aktivaci pomocí EDC/NHS
MUA, merkaptoundekanová k.
merkapto-octová / propionová
/...
HS	"""^COOH
HS	/-^^.COOH
HS	-l-C-kcOOH
Speciální thiosloučeniny
•   bis(N-hydroxysukcinimidester) kyseliny 3,3'-dithiopropionové (DSP) - váže na zlato, vnáší reaktivní NHS skupiny pro vazbu biomolekul
PEO (polyethylneoxid, nebo jinak EG, ethylenglykol) jako koncová hydrofilní skupina
CH2CH2-CO-0
CH2CH2-CO-0.
DSP
■   případně nesoucí na konci ještě biotin - smíšené SAM, kontrolovaná hustota biotinových zbytků
■   11 -merkaptoundecylfosforylcholin - biokompatibilní povrchy
-N+(CH3)3
SAMs
vždy vzniká monomolekulární vrstva,
která může být tak hustá, že povrch je
prakticky elektricky izolován
naopak adsorpce krátkých thioderivátů
často zlepšuje elektrochemické odezvy
bílkovin a jiných látek (usnadněná výměna elektronů s cyt c)
hustotu a kompaktnost vrstvy lze určit elektrochemicky
-   na základě signálu vhodné elektroaktivní látky (ferrikyanid)
-   nebo sledovat pokles vodivosti povrchu v průběhu vzniku SAM
/	
	
I Adsorption	
(SJaíA^	
0	Organization
1 *J//////M .1	
^ AlJcnSillOO)
X(CHZ)„SH + Au" -* X(CH2)nS-Au' +yaH.
Odezva ferrokyanidu
lineami voltamogram
O'
j S(CH2)„-X
£(mV)
Povrch zlata
v zásadě může být jakýkoliv (zlato je inertní vůči oxidaci) pro dobrou kvalitu SAM je nejlepší povrch Au(111)
-   připravitelný termálním naparováním ve vysokém vakuu
-  tloušťka 100 až 200 nm optimální nosičem křemík nebo sklo (slída, křemen,...)
adhezi zlepší mezivrstvička (1-5 nm) Ti nebo Cr, poté povrch lépe snáší kapaliny i agresivnější chemikálie (neodchlípne se) zvýšení hrubosti povrchu (např. pro SERS)
-   elektrochemické leptání
-   nanesení vrstvy nanočástic zlata čištění povrchu zlata
-   aqua regia zředěná, HCI:HN03:H20 3:1:6
-   piranha, H2S04:H202 poměr
-   elektrochemické cyklování 0.17 až 1.87 V
-   UV ozáření, následně oplach ethanolem
-   čerstvý povrch se rychle na vzduchu kontaminuje (stává se hydrofobnějším)
Depozice thiolu
obecně doporučovaný postup:
1 mM roztok thiolu v ethanolu po dobu 16 až 24 hod, následně oplach
ethanolem
-   kratší časy (1-2 hod) - monovrstva nemusí být úplně kompaktní ani dokonale organizovaná (crystalinity)
-   objemné thiosloučeniny - může pomoci zahřátí (60 °C)
-   změny podmínek (optimalizace) mají často na výslednou monovrstvu zanedbatelný vliv
alternativní rozpouštědla
-   voda, hexan, toluen, THF, dichlormethan, acetonitril, DMF
-   rozpouštědla s dlouhými uhlíkatými řetězci - defekty v monovrstvě (kontaminace rozpouštědlem)
depozice par thiolu (v proudu dusíku, nebo ve vysokém vakuu)
chemický proces:
-   vývoj vodíku se nevylučuje
-   v přítomnosti kyslíku může přecházet na vodu
Au + R-SH-------------►   Au-S-R   + 1/2 H;
2Au + RS-SR                     2 Au-S-R
Postupná organizace na povrchu
nejprve velmi pohyblivé, náhodně rozmístěné molekuly nad kritickou mezí začnou vznikat ostrůvky z několika molekul až dojde k pokrytí celého povrchu a začnou vznikat husté domény, fungující jako nukleační místa nakonec je celý povrch pokryt organizovanou strukturou
-   mohou v ní být ale malé defekty
-   pinholes, průměr kolem 0.25 nm
povrch zlata se může částečně rozpouštět, zejména v konc. roztocích thiosloučenin
c^^N —	-S>*V^	
1	~-*V^Y>	1
1                                                                                1		
1		1
Smíšené monovrstvy
současná adsorpce dvou různých thiosloučenin - vznikne smíšená vrstva tvořená oběma komponentami roztoku obecně složení monovrstvy neodpovídá složení nanášecího roztoku více se váží delší thioly a méně polární thioly méně se váží thioly s polární nebo dokonce s nabitou koncovou skupinou
méně se váží thioly s objemnými koncovými skupinami silný vliv na složení má povaha rozpouštědla -  nejméně rozpustný thiol se váže přednostně při vyšší teplotě nemusí vznikat smíšené monovrstvy, ale oddělené oblasti tvořené např. krátkými a dlouhými thioly
' 'Ulii//líh
Au
lze použít i asymetrické disulfidy R-S-S-R'
v existující monovrstve lze nahradit již adsorbované thioly novými z
roztoku (displacement), probíhá zejména v oblastech rozhraní
Stabil           o-SAM
■    obecně je stabilita monovrstev velmi vysoká za normálních laboratorních podmínek
-   snáší až 1 M roztoky kyselin a zásad
■    při uchovávání na vzduchu lze za cca 20 dnů pozorovat změny úhlu alk. řetězců - postupná oxidace atomů síry na povrchu zlata
-   vznik sulfidů RS" až sulfonátů RS03"
-   vzdušnou oxidaci výrazně urychluje UV záření
■    nestabilní v přítomnosti:
-   silná oxidační činidla (piranha, halogeny, ozon, peroxid vodíku)
-   činidla atakující zlato (jodidy, kyanidy, aqua regia)
-   organická rozpouštědla
-   zahřívání nad 70 až 80 °C, při 300 °C kompletní desorbce
-   elektrochemická reduktivní desorbce pod -1.5 V (reverzní děj k adsorpci)
-   elektrochemická oxidace (0.5 až 1.5 V) v alkalickém (0.1 M KOH) nebo neutrálním prostředí
Vlastnosti thio-SAM
■ tloušťka a stupeň pokrytí
-  elipsometrie
•   polarizace světla odráženého od modifikovaného povrchu závisí na tloušťce a indexu lomu nanesené vrstvy
-  povrchová plasmonová resonance (SPR)
•   p-polarizovaný koherentní paprsek se odráží hranolem umístěným pod sklíčkem s napařenou tenkou vrstvičkou kovu
•   při jistém resonančním úhlu se část světla absorbuje díky excitaci volných elektronů ve vrstvičce kovu (plasmony)
•  jev závisí na tloušťce a indexu lomu nanesené modifikující vrstvy
•  funguje v suchém stavu i v kapalině - studium vzniku filmů in situ
-  piezoelektrické křemenné mikrovážky (QCM)
•   resonační frekvence vibrujícího krystalu závisí na jeho hmotnosti, včetně pevně adherovaných modifikujících filmů
•  funguje v suchém stavu i v kapalině - studium vzniku filmů in situ
IK st»ur«	PjjljrLrcr		dtíleclor
	-   x /----- IHLinrlljVtjť	nffaĽť	^-°
Vlastnosti thio-SAM
struktura a chemické složení
-  FTIR spektroskopie
•   IR paprsek se odráží pod malým (grazing) úhlem od povrchu monovrstvy
•   je možné vypočítat orientaci funkčních skupin v monovrstvě
-  SERS (surface enhanced Raman spectroscopy)
•   je potřeba hrubý povrch pro zvýšení intenzity
•   citlivé na funkční skupiny blízko povrchu kovu (0.35 až 0.7 nm)
•   funguje v suchém stavu i v kapalině (normální Ramanovo spektrum je zanedbatelné)
•   informace o chemickém složení povrchu
-  X-ray fotoelektronová spektroskopie (XPS, ESCA)
•   měří se energie elektronů vyražených z obalu atomů po ozáření rentgenovým paprskem ve vakuu
•   specifické pro atomy - elementární analýza monovrstvy, schopnost rozlišit i oxidační stavy (amino x nitro)
detector
X-ruy beam
monolayer surface
Vlastnosti thio-SAM
■ struktura a chemické složení...
-  SIMS (secondary ion MS)
•   vzorek se bombarduje primárními ionty, obvykle Ar4" nebo Xe+
•   detekují se vyražené sekundární ionty
-  difrakční techniky
•   GIXD (grazing incidence X-ray diffraction) malý úhel dopadu, analýza reflektivity a rozptylu, informace o mol. struktuře, tloušťce a indexu lomu
-  elektrochemické techniky
•   cyklická voltametrie - odezvy redoxní proby - blokování elektronového transportu při vzniku kompaktní monovrstvy
•   impedanční techniky - snižování vodivosti
primary ions SM	^	detector w o Ö       secondary inns
m.m	layer surface	
Vlastnosti thio-SAM
'   povrchové vlastnosti
-   kontaktní úhel - smáčitelnost
-   kapka umístěná na zkoumaném povrchu, velikost úhlu závicí na hydrofobnosti povrchu
TABLE L.    Advancing contact		in c	cs of	water on Ulms
prepartd by adsorption of HSíCH; }„			X on	goW™
X	rr		Contact angle, (deg)	
(CF3J5CF3	ä			119
CHj	21			111
CH=CH,	17			105
»COCF,	II			93
COjCHjCHj	1»			39
Cl	II			39
OCH,	1 1			S3
CN	Zl			74
CONHCH3	II			76
CO, CH,	1(1			74
Í)H	II			<I5
CONH:	1(1			<\S
COOH	10			<I5
-  hydrofobni	hydrofilní
P^ H	
^7:	
	r _ -_--^
	
AFM / STM studiu
■   STM, merkaptoethansulfonova k., w=30 nm - zřetelné poruchy struktury (pits, pinholes)
____//'-/Á<\
oktadekanthiolová vrstva
-   zobrazení výškových profilů
-   periodicita odpovídá rozměrům daným molekulovými modely
0.05 0.00
I     S
E 0.05
i/jRM/w
3      6      9     12    15     18    21
^Aa^a/W-Aí
2V3  4v5    6/3   SV3 10v3 12v3 Distance (a, a-0.288 nm)
Thio-SAM na povrchu Au koloidů či nanocastic
vytvoření Au nanocastic v přítomnosti thiolu, v org. rozpouštědle
reakční poměry (Au ku RSH) ovlivní velikost nanocastic disperse klasického Au sólu v ethanolu obsahujícím thiol třepáni Au sólu s roztokem thiolu v toluenu
AuCl4    (aq.)----------------*- AuCl4   (org.)
AuCIj   (org.)
iŕw SH
N
\//
Au
/5ť
\\
Další derivatizace povrchu Au nanocastic ■   kombinace se silanizačním thiočinidlem:			
	(McO^Si-^             -SHOMti) HAĽf:ij(aq)            .  „,„„    -    ,   btOK             ^S/7> HSfCH^SiíOM^™4 fílC5)   -------^                 t^Vs—SilOMe,) (MeO)jSi            SKOMe,}		
			
■    následuje hydrolýza: ■    lze i opačně umístit Au nanočástice na silanizovaný povrch		SH; ■/TV 4-    >l^ >                                NH; NH2	
			
Dynamické povrchy - světlocitlivé
■    deriváty azobenzenu: cis-trans isomerizace, po osvětlení
-   UV (366nm) - cis isomer
-   modré (436nm) - trans isomer
■   změna konfigurace vede ke změně polarity
■    pohyb kapky po povrchu poháněný světlem
UV light
I I l I 1 I
Olive al 'droplet
1	|     *              light
BIue light	um
Same proceduře wHh a reverse direction shown above	
9 N	
N   -	
/	OH
\	/
S	\ / O
\	\
<	/ \
SH	SH
Dynamické povrchy - redoxní aktivace
1   elektrochemická oxidace na chinon vede k aktivaci povrchu kondenzace s derivátem stimulujícím adhezi buněk________
cílená kultivace
HN..
ca1

RGD-Cp

V1™
C/S/    ™^™        rpYť    RGD-Cp,
reduction
5      S      S"   S
S'    S      S     í
Dynamické povrchy - změny polarity
v závislosti na aplikovaném potenciálu elektrody vykazuje její povrch hydrofilní nebo hydrofobní charakter
Precursor Monolayer
(-)
-egpP|e
+ e"
Hydrolysis
Hydrophilic Monolayer
© ' ©
Hydrophobic
Monolayer
Hydrophobic j Alky I Chain
Hydrophilic Carboxyläte .g group
©     - Sultur
Gold Electrode
DymissůzkB pDV/sjjy - iiJuaaiiaJiuj
SAM oligonukleotidové proby specificky rozpozná virální NA polymerasa dosyntetizuje druhé vlákno, přitom ho označí redoxní molekulou ferrocenu tím je umožně přenos elektronů z donorového enzymu GOD
(I. Willner)
dCTP.dATP.dGTP +Ftirocene-(IUTP
(1) '5-HS- (CH2)Í.CCCCCACGTTGTAAAACGACCGCCAGT.3'
9     9
FC = HO-P-O-ff-
"LT
■nd
CH=CH-CH2-NI
(2)
Dyn si ssj j ské povrchy - nanowiring
komunikace enzymů s elektrodou prostřednictvím chemického „nanodrátku" -   „wired enzymes", rychlost přenosu elektronů řádově vyšší než reakce s kyslíkem
Dynamické povrchy - nanowiring
'    komunikace enzymů s elektrodou prostřednictvím uhlíkové „nanotrubky" 1    SWCNT, single-wall carbon nanotube 1    komunikační kanál mezi elektrodou a enzymem 1    kalibrace pro glukosu při různé délce nanotrubičky -   a 25, b 50, c 100, d 150 nm
<2J>
Glucose
Gluconic acid  "      ™
apo-GOx
60			c				4	•	#
50						*			
40					m				h •
//|iA 30				*	*	*	*		
20			•	*			T	T	c T
II)		■	♦	V	T	'			(I
			T		m	m	■	■	
0	*	■	■					,   ,	,
0    20  40    60    80 100 120 140  160 [Glucose] t mM --------*■
clJená lokální íiujd bJJizace
primitivní postupy - „pin printing" - hrot
se namočí v roztoku činidla a
mikrokapka se přenese do žádané
pozice na čipu
velikost spotů je 100-300 um, až 10 tisíc
prob na čipu
horší reprodukovatelnost, pomalost
nízká cena, laboratorní příprava
		lilií           .A		
				
	^ll^fc^     "^			
				
	Ti	i j °|'B	I.	
Ink-jet printing
reagent
I   piezoelektrický element
rezervoár
skleněná membrána
ústí    mikrokapka (100 pl) mikropumpa (struktura vyleptána v k řemíku)
Ink-jet tisková hlava
alternativní metoda přípravy DNA čipů - „tisk" reagencií na podklad - obdoba
inkoustových tiskáren
základem je struktura rezervoáru vytvořená v křemíku (micromachining), překrytá
velmi tenkou skleněnou membránou, na kterou přiléhá piezoelektrický element
(aktuátor)
rezervoár se naplní reagentem, poté nad ústí pumpy posune žádaná pozice čipu, a
na piezoelektrický aktuátor se přivede puls napětí
piezoelement se mechanicky deformuje, zatlačí na membránu, čímž dojde k
vystříknutí mikrokapky reagentu
rychlost „tisku" je 1 až 6 kHz
Ink-jet printing ■    rozptýlení kapky na povrchu brání předcházející modifikace čipu ■    hydrofilní místa pro imobilizaci prób navzájem oddělené hydrofobními úseky (surface tension wells) ■    nanášené kapky reagentů se nerozpíjí, povrchové napětí je drží uvnitř dané pozice ■ Jp                 pohyb pole	reakční kroky probíhají naráz na všech pozicích čipu promývání a pomocné reakce se
1                                                                         1	
ink-jet pumpy |U|U|U|U|     ■	provádí pro celý čip společně pro 100000 pozic trvá prodloužení o jednu bázi asi 5 minut syntéza souboru o délce 25 bází zabere 2 hodiny.
C          A           G           T zásobníky aktivovaných bází Syntéza souboru DNA prób	
Subtraktivni techniky
■   vytváření struktur či obrazců pomocí odstranění přebytečných částí
■    leptání
■    FIB (focused ion beam) milling
■    laserové opracování
-   machining, pulzy různého trvání
■    ultrazvukové vrtání
-   25 u.m amplituda při frekvenci 20-100 kHz
-   bezstresove opracování křehkých materiálů
■   tradiční technologie
-   NC frézky, vrtačky,...
ukturace povrchu
■   surface patterning
■    cílem je imobilizovat danou biomolekulu pouze v určitém geometricky definovaném místě povrchu
■   využití pro konstrukci různých typů souborů (arrays) detekčních elementů nebo multikanálových biosensorů
■   technika tisku - plastové "razítko" se namočí v modifikačním roztoku a motiv se přenese na povrch
PDMS
_Ľ^3___Lu
_ľs:
Phomresisi pattern (1-2 jim ihiekriess)
PDMS is peeled riway froiti [he im aítér
PDMSisexpusiťíitoa
solution containing HS(CH2)|}CH.,
Alkanetniol Stomping onto gold tcanifets ihiol
PDMS
-Au ■::<») 11:11) 1 Tili nm)
1 Remove PDMS 1------Hydrophobic SAMS(oa 2 nm)
si
W;i-lIi with a sol uti rai of HS(CH;,)]sCOOH
Strukturace povrchu
■   surface patterning
PDMS razítko
5 m M oktadekanethiol
„namočené" razítko (SH-(CH2)17-CH3)
;H3CH^sf CHXHxf J
????????
_?_5______ÍJ,
Litog^ Jj
■   tenkovrstva technologie nejen pro výrobu elektronických součástek, ale i mikroanalytických planárních systémů
■   základním materiálem je křemík („silicon wafer")
■   techniky přenosu kopie výchozího motivu („master pattern") na povrch pevného materiálu
Fotorezist
modifikovaný materiál se pokryje tenkou vrstvou fotocitlivého materiálu - fotorezist (spin-coating)
ten se pak osvětlí přes masku nesoucí žádaný motiv
fotorezist - pozitivní nebo negativní
i
křemíkový substrál
termální oxidace (vznik Si02)
l     J nanesení fotorezistní ■ x   vrstvy
v osvit přes masku -/definování tvaru
vyvolání
nanesení vrstvy (kov, izolace, \biovrstva, membrána.
) odstraněn í fotorezistu
■ schéma pracovního postupu
Fotolitografická maska
ukázka masky pro celý wafer (vlevo) vpravo pak výsek pro 20x20 elementů
VvM
DNA biočipy (DNA microarrays)
plátek křemíku (wafer, 5x5 inch, tj. 12.5x12.5 cm)
z něho 49 až 400 jednotlivých sensorů (chips, 1.28x1.28 cm)
na každém čipu až 1.4 milionu pozic (features, 11x11 um)
v každé pozici několik milionů kopií stejné oligonukleotidove próby
s danou známou sekvencí
jvJuJifikace povrchu
kombinace chemické reakce a UV ozařování fotolitografie, fotosenzitivní imobilizační procedura
Jim p ;'"
Mask
Light (dapľíil action)
■ Mas<
I  I I  I  I            I  I  I I  I
DOODO      ►OOOOO
*>*>*><><>
I   I   I ► QHOHDOO
iiiii
I   I   I   I   I TTOOD
[G A T C G
1 -iiwrJčÁ Ť Á Ť AGCTG TT CCG
\Uho<
'SSSSS    feptat   ^Š^
II              I   ^       I  I  I  I  I
TTOHOHO^     TTOOO
GereChip*
Mi"r-jarrá>'
Array
Výroba DNA čipu
silanizovaný povrch sensoru, každý atom Si je zárodkem próby
navázání spojovací části „linkem", ten zakončený fotocitlivou blokovací skupinou           ^
1 ■■■   ft ■■■   ft   -   ft-   *   -   ft-    ft-   ft-   ft — ft — ft- ft— ft-     ft-   ft--   ft-   ft—   i
UVibr
ozáření přes masku - odstranění blokujících skupin (deprotekce)
navázání prvního nukleotidu (A)
i      *      *      *      4
..V......
Výroba [2)
TT
i      t      i      p
■■■■
■    ozáření přes masku č. 2
■    ozáření přes masku č. 3
I    UV Loht   .
■    navázání dalšího nukleotidu (C)
II—  »i-   U-   ■~H-*lľ-   P—  ii —   h-   t-"   h-   ■( —  H "   II —   P-   t — íl
■    další nukleotid (G)
n     r.      '.,      '.
T             ŤŕSäTii             j              r-»1 JV-.T             j             f**',,-*i             I
■^■■■•■.■^■^a ■•■■■,■.■■<■
—~—r
mmmmm
.■■■.-.■.■.■■-...■.■■■.■.■■-■■.-.■.

ľzn
■   maska č. 4
ŤlílípTpl.....■.■.■.■■■■.■■ mntmtttitíttt-• - »-*- s- s- s - í- *- í- »-a- ■ - a- *.-s- »-b- > .            1            1            1            F            1            .            ■                         1            1            1            1

PMH 0
_
zabránění dalšího růstu chybné sekvence - ukončovací báze („capping agent") po každém kroku
Výroba (3)
4
i        l        L        [        L        L        .        L        L        [        l        t        l
1         I          I          I         F         I         1         I         J         I         I          I         1
"I         rucnu         I         Ft*.**}
■   další (T), ale výskyt chyby!
üb;::::	í wägt ■ľ  Tu           T?  T-j  T>-  T*   T f  - *   T v ä: 2ÉB± iíľ   ■ .■■■■■.p.p.11-
■:■,■:■.■   ■    ■   ■   ■ M,lvt<t,|    Hl ■ >■■■ ......... ■■■■■■■■■ ■    ■    ■    ■    ■     »-'       »,   T	
B.á.ž.A.á.B-.a.Lá	
tttt::iľ:j'TTTT'^	
	
	
										
	Hotovo!	SISIS	■  ■■■ T        T        T        T ■   m ■ ■	t : T ■ ■ ■ ■ ■■' L       L 1         1 S-  9-1         '		r    t i i ■ ■ ■ i ■ i ■ T :: L	ľ       ľ       ľ       T T        T        T        T ■■^? ÍÍÍÍ ■■■■ L        L        l        L. -   S-   S"   Si         Si í    1    I    t			
■    konečný stav po odstranění „capping agents" a protekt. skupin, následuje zabalení „packaging" do „cartridge" ■    pro 25-mer potřeba obvykle méně než 100 masek (teor. maximum) ■    problém: přesahy mezi jednotlivými zónami (odrazy, rozptyl,		T        T        T       T        T	:::: i    i    i    i :::: T         T         T         T ■  m ■ ■							
		T       T       T       T        T L       L       í.       L       L ■ — a— a- a- a	m L        L       t.       L 1        1        1        1 -9-9-  S>-  S>-							
	vnitrní ozářeni,...)	Wafer								
	> .v	ukázka části oblasti proby po hybridizaci (AFM, šířka obrázku je 2 um)								
										
Nanostrukturace povrchů pomocí SI^jjJ
1   skenovací raménko s hrotem slouží k vytváření obrazců na
modifikovaném povrchu 1   techniky:
STM litografie - aplikuje se proudový puls
I
S
AFM litografie
-  škrábání, scratching
-  "ťukání", dynamic plowing
AFM oxidační litografie
AFM konstrukční litografie
AFIjJ ss-fíi-JisjjIng
■   AFM zařízení jako nástroj pro modifikace povrchů
■   vyškrábání motivu v polymerní vrstvě pomocí ostrého hrotu
-  PTCDA, 3,4,9,10-perylentetrakarboxydianhydrid
skenování
I
zápis                        skenování
u,*
I    2.    "•"
I
f
Lokální anodická oxidace
1   na povrch AFM hrotu se aplikuje potenciál 1   v místě přiblížení hrotu k povrchu dojde k elektrochemickému vytvoření struktury oxidace povrchu titanu nejčastěji
Fantazii se meze nekladou ...
1   "nanoobrázky",...
J     Fl]g |  kHeu  |  Efllt  |   Tonil   |  frpgrt* Ion |      ňP   J |        HfttH.ttDT
a*J:u
l^äStent&ömil
MB           íaSB          1MB
Hl i im>h
1l 1 l»l
Srovnání technik pro cílenou imobilizaci
Techniky vhodné pro rozlišení pod 100 nm	Přímá kovalentní vazba biomolekul	Řízený proces v kapalině	Různé typy povrchů a modifikačnich činidel	Nízká cena	Vhodné pro rozlišení až 10 nm
Chemomechanical Patterning/Nanograftin g	ano	ano	ano	ano	ano
Dip Pen Nanolithography	spíše ne	ne	ano	ano	difúzni limitace
Microcontact Printing	spíše ne	ne	ano	ano	asi ne
AFM Mechanical Scribing and Nanoindendinq	ne	ne	ne	ano	ano
c-AFM Oxidation	ne	ne	ano	ano	ano
UHV STM Patterning	ne	ne	ne	ne	ano
E-beam Lithography	ne	ne	ano	ne	asi ne
UV Photolithography	ne	ne	ano	ne                asi ne	
Kam to směřuje...
■   představivost a fantazie, definování cíle
výběr vhodných detekčních elementů
-  z čeho budeme stavět (aminokyseliny, nukleotidy,...)
vytvoření knihovny na základě kombinatorických postupů
-   všechny možné variace z daných stavebních kamenů
paralelní testování vlastností molekul z knihovny
-   nalezení vhodných detekčních zpracování a výroba analytického systému
-   optimalizace výrobního procesu
vysoce paralelní analytický proces
-   citlivé elementy ve formě 2D pole, oskenování (opticky, elektricky, magneticky,...), začlenění dat do databáze
matematické prohledání a prezentace, rozhodnutí
-   zpřístupnění výsledku uživateli v pochopitelné formě
Příprava imunokonjugátů
■  imunogeny - nosné bílkoviny modifikované
nízkomolekulárním antigenem (= hapten, sám o sobě nevyvolá imunitní odpověď)
-> značené protilátky a antigény - tracery pro imunostanovení
Imunogeny
■    imunogenicita - schopnost molekuly stimulovat imunologickou odpověď a následně tvorbu specifických protilátek
■    imunogen
-   cizorodost pro organismus, nevlastní původ, aby nebyl imunitním systémem ignorován
-   dostatečná velikost - aspoň 6 kDa, jinak se pouze naváže na receptorove m Ig M na membráně B lymfocytu, ale není pohlcen endocytosou
-   chemická komplexnost - např. velké homopolymery z aminokyselin a jednoduché polysacharidy jsou zřídka imunogenní
■    biomakromolekuly jako imunogeny
-   sacharidy -jen pokud jsou dostatečně komplexní, nebo jako součást glykoproteinů
-   proteiny - dostatečně imunogenní; peptidy - příliš malé, je třeba je navázat na nosnou bílkovinu
-   lipidy, nukleové kyseliny - neimunogenní, musí být navázány na nosnou bílkovinu
■    malé molekuly - hapteny
-   fungují jako antigény (epitop, váží je protilátky)
-   nefungují jako imunogeny, musí být konjugovány s nosičem
Nosné bílkoviny
■   volba dle imunogenicity, velikosti a dostupnosti funkčních skupin pro navázání haptenu
■    KLH, keyhole limpet hemocyanin
-   z přílepky (měkýš) Megathura crenullata, kuproprotein vážící kyslík
-   mcKLH - z uměle pěstovaného organismu (mariculture) - lepší homogenita preparátu, lepší rozpustnost, v roztoku opalescentně namodralý
-   velikost 450 kDa až 8 M Da, je agregátem, stupeň agregace závisí na pH, nad pH 8,9 disociován na podjednotky
-   může být hůře rozpustný, roztoky často se zákalem, NaCI zlepšuje rozpustnost
-   má k dispozici hodně lyzinových zbytků
-   fylogenetický vzdálený savcům
■    OVA, ovalbumin
-   z vaječného bílku, 45 kDa, dobře rozpustný, i v DMSO
-   využíván hojně i při screeningu protilátek
BSA, bovine serum albumin
-   albumin tvoří asi polovinu proteinů plasmy, stabilní a dobře rozpustný
-   67 kDa, pl 5.1, jediný Polypeptid obsahující 59 lyzinových zbytků, z nichž 30 až 35 je využitelných pro imunokonjugační postupy
-   pro konjgace je nejlepší frakce V, vysoce přečištěná
-   využíván nejen jako nosič v imunogenu, ale i při screeningu protilátek a při blokování pracovních povrchů
-   cBSA, cationized BSA - povrchové karboxyly derivatizovány ethylendiaminem pomocí EDC, zvýšení pl na 11
NH2                                                                   ?i      NH,  ů
HOOC       l,COOH                               NH^CH^NH-1^!2  |!-NH(CH2)2NH2
h2n-TbsaVnh2       nh2(ch2)2nh2  ^          H2N/bS^_NH2
HOOC      T^   COOH                               NH,(CH,),NH—ifT    \—NH(CH2)2NH2
NH,                                                2'     2'2         \\       WH .    'A
-   lepší imunogen než nativní BSA (stačí ho méně), netřeba kompletní Freudovo adjuvans
-   vyšší afinita k záporně nabité membráně antigen-prezentujících buněk
-   pro konjugace lze využívat EDC bez nebezpečí postranních reakcí
Konjugace haptenu
■    protilátky jsou produkovány proti navázanému haptenu, ale i proti epitopům nosiče - význam selekční procedury pro nalezení těch správných
■    optimalizace imunogenu - zkusit různé nosné proteiny a různé hustoty navázaného haptenu
■    obvykle se využívá povrchová aminoskupina nosné bílkoviny, ke které se pomocí heterobifunkčního crosslinkeru připojí hapten
-   inkubace nosiče s crosslinkerem (nadbytek)
-   odstranění přebytku crosslinkeru
-   inkubace s molekulou haptenu
-  jednoznačný průběh reakce
■    pozor při volbě reagující skupiny haptenu
■    mimo oblast epitopu                         v oblasti epitopu
vysoká specifita Ab                    ^^^4   malá specifita Ab
\mi\in-A-iiu3
imunogen se aplikuje experimentálnímu zvířeti (myš, morce, králík, koza, kůň,...) injekčné v přítomnosti tzv. adjuvans
-   přípravek stimulující imunitní odpověď
-   FCA, Freudovo kompletní adjuvans - emulze vody v oleji plus mrtvé buňky Mycobacteria
•  emulze zadržuje imunogen v místě aplikace po delší dobu
•   buňky Mykobacteria přitahují do daného místa makrofágy a další imunitní buňky
-   FIA, Freudovo inkompletní adjuvans -jako FCA, bez Mykobacteria
-   ve vodě rozpustné polysacharidy - méně účinné než FCA, méně zatěžující pro organismus
-  Alum - hydroxidy hlinitý a horečnatý
Screening protilátek
>   konjugat haptenu s nosičem vyvolá tvorbu různých druhů protilátek, specifických proti různým částem imunogenu proti nosil
(nežádoucí) i
proti epitopu haptenu^^^. (požadované)
proti spojovacímu úseku (bridge-specific, nežádoucí)
-   nalezení vhodné protilátky zajistí screening pomocí haptenu imobilizovaného na jiný nosič a jiným způsobem, než v případě imunogenu (opakuje se pouze epitop)
•   protilátky
-   koncentrace vs. titr - různé pojmy
-   celková koncentrace molekul protilátky (molární, mg/ml,...) bez zahrnutí funkčních parametrů (i poškozené či částečně denaturované neaktivní),
-  titr = zředění dané protilátky vhodné pro daný typ imunostanovení
Určení koncentrace protilátky
1   při 280 nm má roztok čistého IgG 1 mg/ml absorbanci 1,35 1   stanovení IgG v komplexních roztocích (sérum, ascitická tekutina, extrakt z tkáňové kultury,...)
-   použije se latexové precipitační stanovení
-   latexové částice potažené protilátkou proti měřenému IgG (napr. anti myší,...)
-   monodisperzní částice volně v roztoku vykazují vysokou absorbanci při 340 nebo 405 nm
-   v přítomnosti cílové protilátky dochází k agregaci částic a k poklesu absorbance
-   rychlost -5 min
-   vysoká citlivost - rozsah 10 - 300 ng/ml
Absorbance	\
	Particle Size OO   __>   fQ oo     > tb
Fragmentace protilátek
pro mnoho účelů nepotřebujeme celou molekulu protilátky, ale stačí nám pouze menší část nesoucí vazné místo
-   menší molekula - méně nespecifických interakcí
-   snazší konjugační reakce, menší enzymové konjugáty
-   fragmenty vznikají štěpením proteinasami, nejlépe imobilizovanými na vhodný nosič
■   f ragmen	ty z molekuly i	monoglobulinu G				
V	%#	#     #	#	f		m
kjG	F)ab'fe	Falľ                         Fab	Fv	"r IgG"		FC
						
F(ab'fc (110.000 daltons)		Heavy Chain IgG (150.000 datons)		JFsb (50,000 datonsea.}		
Fc Fragments	Immobilized Ficin 1 m M cysteine Immobilized Pepsin		Immobilized Ficin 10 mM cysteine Immobilized Papain	r Ft (50.000	r 1 altGns}	
Fragmentace IgM
lg M ... příliš velká molekula náchylná k nespecifickým vazbám, špatná penetrace v histochemických aplikacích - potřeba vytvořit menší vazné molekuly poněkud odlišné výsledky pro IgM různých organismů
Mouse IgM
IflM			%#	F(ar/)2 (150,000 daltons)
			#	Fab-H (45,000 daltons)
		Immobilized	V	"IgG" type-M (200,000 daltons)
		7    Trypsin		
TJ	!	\	#	Fc 5m-H (340,000 daltons) H-hLimar only M-niuiJsc íjnly
K VYHÍv     (150,000 daltons)           ľ /$? Fab                             '-<%r   (45,000 daltons)      Vm			^ "IgG" type (200,000 daltons) ^"rlgG" (110,000 daltons)	
			ffl\	
'W    (25,000 daltons)     \j-			U    Inverted "IgG" (Mouse) M (200,000 daltons)	
pšení specifity bJuJiiterakce
■    blokování pracovního povrchu
-   cílem vysytit nespecifická vazebná místa (nosiče, sensoru, mikrodestičky,...) vhodnou inertní látkou
-   dosáhnout nižšího pozadí signálu
-   na interakci se účastní řada faktorů, úspěšné blokování je tedy výsledkem empirických pokusů
•   blokovací roztoky
-   buď v PBS (phosphate buffered saline) nebo v TBS (tris buffered saline; ALP jako značka nemá ráda fosfát)
-   inertní proteiny: 1% kasein, 1 až 3% albumin (BSA)
-   komplexní směsi: sušené beztučné mléko (může obsahovat biotin), rybí sérum (steelhead salmon serum, fylogenetický vzdálené savčím bílkovinám)
-   detergenty - Tween 20 nebo Tween 80 - adsorbují se na hydrofobní povrchy a tím je učiní hydrofilní
■    promýváni afinitních komplexů
-   roztoky obsahující nízké koncentrace (kolem 0,05%) detergentu - přeruší pouze nespecifické interakce proteinů
-   Tween 20 a 80, Triton X-100, Nonidet P-40, Brij-35, CHAPS, CHAPSO
Charakterizace biokonjugátů a mobilizovaných nosičů
■   separace z reakční směsi
■   určení stupně substituce
■   další charakteristiky
■   uchovávání
Izolace biokonjugátů
separace od nezreagovaných složek konjugační směsi odstranění nízkomolekulárních komponent
-   nejjednodušší je dialýza v celulosovém střívku - přes noc, v chladu, vyměnit několikrát dialyzační roztok
-   rychlejší s centrifugačními či jinými mikrodialyzatory, konjugát málo stabilní, vhodné pro malé objemy
-   rychlá separace na vhodné odsolovací koloně
-p
0.1 ml 5 M NaCI proti 11 vody
Za koncentrován í biokonjugátu
■   zahuštění
-  tlakové ultrafiltrační systémy
-   dialyzační trubice a vně činidla odnímající vodu (PEG, Sephadex)
-   centrifugační evaporátory - šetrné podmínky
-   lyofilizace - použít zředěný nebo těkavý pufr
-   vakuová pomůcka na obrázku...
■    konjugáty tvořené dvěma biomakromolekulami
-   chromatografické přečištění
-   vhodná afinitní separační technika
-   isolace protilátkových konjugátů od zbylého enzymu (vadí!)
•   imobilizovaný antigen
•   protein A/G/L
Stupeň substituce
■   vzniká barevný či fluoreskující produkt - spektrální vlastnosti
■    diferenciální metoda, stanovení:
-   zbylého nenavázaného ligandu
-   zbylých neobsazených skupin biomakromolekuly yen pro "malé" ligandy)
■   stanovení navázaných molekul ligandu vhodnou specifickou reakcí
■   změření změny molekulové hmotnosti konjugátů oproti výchozí biomakromolekule
-   gelová permeačníchromatografie
-   elektroforesa v PAG v nedenaturujícím uspořádání
-   hmotnostní spektroskopie
■    hydrolýza a charakterizace vzniklých produktů
-   proteolytické štěpení, mapování štěpů
-   úplná hydrolýza, stanovení aa či detekce uvolněného ligandu
■    detekce barevného postranního produktu konjugační reakce
-   žlutý p-nitrofenol při použití p-nitrofenylkarboxylesteru jako aktivované matrice
-   pyridin-2-thion (£343 = 8080 NM cm1) při vazbě -SH na pyridyl-2-thioaktivované nosiče
Absorbance
■    při výrobě biokonjugátu dojde ke změně spektrální vlastnosti produktu (navázání barviva nebo fluoroforu na nosnou bílkovinu)
■    kvalitu konjugátu lze posoudit na základě změněných spektrálních vlastností
•   některé konjugační reakce poskytují barevné produkty díky vzniklému můstku - diazotační postupy
1.2			
		--------albumin	
1.U		--------albumin-N=N-hapten	
0.8			
0.6			
0.4			
0.2			
			
	......"   ■■       '  "-=-> ■■       ■      -		
500        E l (nm)
UV-VIS spektra albuminu a konjugátu albuminu s haptenem, připravený diazotační metodou. Měřeno v 50 m M fosfátu pH 7.0, koncentrace bílkovin 1,5 mg/ml.
Stanovení aminoskupin
>   volná aminoskupina s kyselinou 2,4,6- trinitrobenzensulfonovou (TNBS) dává barevný oranžový produkt
-   měřitelný při 335 nm (v 200 mM HCl s 2% SDS)
-   změřená absorbance se porovná s kalibrací pro vhodný standard, např. aa
pro vysoce citlivou fluorescenční detekci volných aminoskupin lze použít o-ftaldialdehyd (OPA) v přítomnosti 2-merkaptoethanolu
-   produktem je fluoreskující sloučenina (360 / 455 nm)
-   použije se opět kalibrace na standard
äuJiljydrylové skupiny
>   Ellmanovo činidlo, 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoová kyselina)
-   reaguje s volnými SH skupinami za vzniku disulfidu
-   uvolní se kyselina thionitrobenzoová - intenzívně žlutá barva
-  £412= 13600 M1 cm1					
HOOC       Ellmanovo činidlo   COOH	R—SH	HOOC	—S—S—R  +	HS—	COOH
Biotinové zbytky
1   stanovení úrovně biotinylace má význam při hodnocení průběhu konjugace a při kontrole reprodukovatelnosti procesu
■   využívá se 2-(4'-hydroxyazobenzen)-benzoová kyselina (HABA)
-   po navázání na avidin vykazuje silnou absorbanci při 500 nm
-   £ = 3.55-104 M1 cm1 (HABA4:avidin)
1   pokud se v prostředí nachází volný nebo vázaný biotin, vytěsní molekulu HABA z vazebného místa a proporcionálně se sníží absorbance
1   principem je rozdíl afinit obou molekul k avidinu, Ka je
-   1,3-1015 IW1 pro avidin
-   6-106 M1 pro HABA
1   může být zajímavé porovnat získané hodnoty pro celý nativní biotinylovaný protein a pro stejný konjugat předem hydrolyzovany např. pronasou na menší fragmenty
-   lze tak posoudit množství celkového a snadno dostupného biotinu v molekule konjugátu
Biotin vážící místa
■   Velmi užitečné může být stanovení vazebných míst pro biotin na imobilizovaných molekulách avidinu nebo streptavidinu
■    derivát biotinu s p-nitrofenolem je bezbarvé činidlo, které se naváže na imobilizovaný avidin
■    po opláchnutí nosiče se v alkalickém prostředí zhydrolyzuje esterová vazba a uvolněný nitrofenol je v tomto prostředí intenzívně žlutý
■   jeho množství odpovídá biotin-vážícím místům, t410 = 18300 M-1 crrr1
	O x HN         NH
biotin-p-nitrofenylester	
rY°Yx/N	^^^S
JL^    o 02N      ^^	
MALUJ
■    matrix assisted laser desorption ionization
■   v přítomnosti pomocné molekuly lze ionizovat i proteinové konjugáty
-   do asi 100 kDa
-   z MS spektra se určí mol. hmotnost konjugatu
-   porovnáním s mol.hmotností výchozí bílkoviny se dá určit stupeň substituce
■   naštěpení konjugatu a výchozího proteinu sekvenčně specifickou endoproteasou (trypsin, štěpí na karboxy konci Arg a Lys)
-   úprava štěpů - redukce a alkylace
-   MALDI analýza štěpných produktů - "vymizení" určitého peptidu u konjugatu svědčí o modifikaci v jeho aminokyselinách
-   místo srovnávacího proteinu lze použít "teoretické" štěpení známé sekvence z proteinové databáze
o i___i_____■_____i_____■_____i_____i_____i_____■_____i_____■_____i
64             65             66             67             68             69 ______________________________Miz (kDa)_______
Enzymy jako bioligandy
>   mohou být barevné
-   peroxidasa - červená
-   flavinové oxidasy -žluté
1   v imunokonjugatech spolu s protilátkou či antigenem = tracer
-   vždy změřit enzymovou aktivitu konjugatu (kolik procent z původně přítomné aktivity se zachovalo = vhodnost způsobu konjugace)
-   stanovit také koncentraci bílkoviny (specifická enzymová aktivita)
-   v literatuře velmi často údaje typu X-krát zředěný tracer, aniž by se uvedla výchozí koncentrace...
Chromatografické nosiče
běžné nosiče - schopné vázat volné aminoskupiny ligandů či biomolekul; určení výchozí vazebná kapacity:
-   derivatizace nosiče diaminem (ethylendiamin, 1,3-diaminopropan)
-   stanoví se množství získaných aminoskupin pomocí ninhydrinové reakce
-   slouží obecně pro kvantifikaci aminoskupin, zejména v případě aminokyselin
-   vzniká růžovofialové zbarvení, £570 = 8750 M_1 cnr1
O                     R^ //                            /	^NH2		o II					f?
íYy-    L		PT	\	^OH		■    f	V	x°H
o  ninhydrin		KJ-	O	N—C—R H     H2		K		~-(       N=C—R \ _   H     H O
	O			ť^r	O	-NH2	R^	^OH
				UC				
OH            O					OH			
Stanovení imobilizovaných bílkovin
■   u bílkovin je výhodné použít jejich redukční vlastnosti v alkalickém prostředí vůči iontům Cu2+
-   vzniklá jednomocná měď Cu+ se pak stanoví jako barevný komplex pomocí kyseliny bicinchoninové (BCA), Cu+(BCA)2
-   reakce není příliš specifická a reagují také jiné redukující látky (aminy, hydrazidy, redukující cukry aj.)
-   zbarvení se měří při 560 nm
■   kvalitativní průkaz přítomnosti bílkovin na modifikovaném nosiči lze také provést použitím Coomassie Blue 250 (Bradfordové činidlo), kdy vzniká adsorpční modrý komplex (595 nm) s imobilizovanými proteiny
I mobilizace na povrch sensorů
■    pro stanovení množství navázaného ligandu omezeně použitelné i metody zmíněné pro pro biokonjugaty nebo chromatografické nosiče
-   komplikací je velmi omezená vazebná kapacita poskytující pouze malá množství stanovitelných barevných produktů
■    imobilizace biomolekul na povrch přímých afinitních sensorů se ale velmi často provádí „online":
-   sleduje se změna specifického signálu v reálném čase
-   signál odpovídá množství biomolekul vázaných na povrch, je tak přímo výsledek imobilizace „vidět" a je ihned známo, jaké množství bioligandu se imobilizovalo
-   výhodou je jednoduchá možnost připravit citlivé povrchy s požadovanou hustotou bioligandu
■   tímto způsobem fungují optické sensory na bázi rezonance povrchovým plazmonů (SPR) nebo piezoelektrické sensory (křemenné chemické mikrovážky, QCM)
■    u QCM lze navázaný bioligand pohodlně přímo „zvážit" stanovením rozdílu rezonanční frekvence sensorů v suchém stavu před a po imobilizačním kroku
■    rozdíl je přímo úměrný změně hmotnosti po navázání biomolekul
Imobilizace v reálném čase
■   signál sensoru je úměrný množství navázaných biomolekul - záznam imobilizace tedy poskytne přesné informace o navázaném množství
■    ukázka imobilizace protilátky na sensor lAsys (optický systém rezonančního zrcadla)
-   aktivace glutaraldehydem
-   vazba protilátky
-   vysycení zbylých vazeb, míst inertní bílkovinou
-   rozdíl signálu se bere v přítomnosti pufru, tím se vyloučí skoky signálu dané různým složením imobilizačních roztoků
Zobrazení označeného ligandu
■    imobilizovaný ligand se označí pomocí např. fluorescenčně značené protilátky, obraz povrchu se získá pomocí fluorescečního mikroskopu nebo skeneru (nižší rozlišení)
■    ukázka zviditelnění imobilizovaného proteinu pomocí specifické protilátky značené fluoresceinem, sken intenzity a pseudoobarvení
%_________________________________________________
■   porézní        kontrolní           porézní             porézní      kontrolní
(elchem. oxidace)                  (ox. parami HF)                         povrchy Si
O D
							
		albumin             ^*-—X					
			deaktivace) x f     p			i	
	Sensor se silanizovaným povrchem (volné -NH2)			^-*~-M			
				1     Pi			
	1000 -						
R		^-------------P7		navázané			
(arc s) ■		ŕ		množství			
500 -				Ab (bioligand)			
0		glutaraldehyd i (aktivace)		/			
				i			
							
	0	20	40     f (min)     60				
Zobrazení modifikovaného povrchu
mikroskopie na bázi meziatomovych sil (AFM) poskytuje 3D „plastický" pohled na povrch -  přítomnost imobilizovaných
biomolekul lze hodnotit na
základě profilometrické
analýzy AFM obrazů tapping mod, image xy 500x500 nm histogram pro Z, z osa 0 až 5 nm
A
AFM measured height
AA
AFM measured height
A
AFM measured height
I   Non-specific      I   Specific * Antig&n     A antibody           A antibody