Molecular Ecology mravenec DNA Msat paternita - barvy ATGCCGATTACCACACAGCTAATGCCGATTACCACACAGCTAATGCCGATTACCACACAGCTAATGCCGATTACCACACAGCTACTGATGGAAAGTCCT GCATC Fig1 J. Bryja, M. Macholán – MU, P. Munclinger - UK Co je molekulární ekologie? Uměle vytvořený obor vymezený technickým přístupem. Na ekologické problémy hledá odpověď pomocí molekulárních metod. (Zoologové a botanici nakoupili cyklery a sekvenátory, snažili se je využít i k něčemu jinému než je taxonomie => vznikla molekulární ekologie) Pracuje na různých úrovních variability DNA (genom, jedinec, populace, skupina populací) Je to vlastně aplikovaná populační genetika HM00363_ HM00361_ Klasické ekologické problémy a metody + Molekulárně-genetické metody Proč používat molekulární metody v ekologii? • •Často nelze jinak •paternita – páření často skryté a nemusí vést k oplození • •identifikace z trusu, chlupů - pohyb jedinců skrytě žijících druhů • •izolace populací – nemusí být zřejmá •počet migrantů – nelze sledovat naráz všechny jedince • Její význam vzrůstá ... •Je překvapivě kompaktní •Je populární - Molecular Ecology (od 1992) – dnes 24 čísel za rok •ISI Journal Citation Reports® Ranking - 2008: 6/124 in Ecology; 5/39 in Evolutionary Biology; 46/276 in Biochemistry & Molecular Biology; Impact Factor: 5.325 •Vyšly i její učebnice •Na řešení velmi odlišných problémů používá obdobné metody •Snad se dá tedy i přednášet ... • • Vychází z populační genetiky •Slavní zakladatelé moderní syntézy, třicátá léta •Matematické modely spojující genetiku a evoluční teorii • • wright-sewall9 Hypothetical adaptive landscape Ronald Fisher Sir Ronald Fisher photo of Haldane addressing a political rally Ronald Fisher J. B. S. Haldane Sewall Wright adaptivní krajina JBS Haldane Obsah přednášky •Příbuznost (neutrální znaky) –identita (stopy stejného jedince, klony) –paternita, vzdálenější příbuzní –vztah populací (izolovanost, výměna migrantů) –fylogeografie (historie šíření) –hybridizace, hybridní zóny – •Geny pod selekcí –MHC, MUP, ABP, reprodukční proteiny –geny pro zbarvení – • • •Ochranářská genetika ? vrány vydra face Technické výlety (omezeně) Analýza dat Msat paternita - barvy Fig1 Organismy üDiploidní s pohlavním rozmnožováním ü üVětšinou obratlovci ü üBudou ale i třeba motýli nebo slávky ü üRostliny fungují často jinak! Ale určitě i o nich bude řeč. [USEMAP] Příbuzné přednášky, tj. co se zde objeví jen okrajově? •M. Macholán, J. Bryja - Genetické metody v zoologii • •M. Macholán - Evoluční biologie • •J. Zukal – Behaviorální ekologie • •S. Pekár – Ekologie populací • •aj. (molekulární ekologie „prorůstá všude“) • Kolokvium •Zpracování review a prezentace na určité téma • •Proč (problém) – Jak (metody) – Příklad • •Např. Analýzy paternity: EPC – mikrosatelity (CERVUS) – posun v náhledu na párovací systém u pěvců Úrovně variability DNA •druh – fylogenetické analýzy (fylogenetická systematika, identifikace druhů – „barcoding“) Úrovně variability DNA •populace – studium speciace, fylogeografie Úrovně variability DNA •populace – populační biologie, ochranářská genetika) Pracovní_hýli ? Úrovně variability DNA •jedinec – analýzy příbuznosti (behaviorální ekologie, např. analýzy paternity) Genotypizace – analýza genotypu •stanovení formy určitého úseku DNA (alely, haplotypu) • 1)izolace celkové DNA z tkání 2)amplifikace požadovaného úseku DNA (PCR) 3)studium variability daného úseku (lokus) 4) Způsoby získání DNA z volně žijících živočichů 1.destrukční – živočich je usmrcen kvůli získání tkání potřebných na genetické analýzy 1. 2. nedestrukční (invazivní) – živočich je odchycen a je mu odebrán vzorek tkáně nebo krve n 3. neinvazivní – zdroj DNA je „zanechán za živočichem“ a je získán bez potřeby odchytu, manipulace či dokonce pozorování Izolace DNA •rozmanitý biologický materiál – musí obsahovat buněčná jádra nebo mitochondrie s nedegradovanou DNA •dnes většinou komerční kity •velký vliv fixace vzorků • • • Fixace materiálu •čerstvá tkáň •čistý EtOH •rychlé vysušení •speciální extrakční pufry •zamražení •formaldehyd •opakované zamražování •rozvlhčování sušeného materiálu •další fixační média + - § speciální metody pro izolaci ze subrecentního materiálu (mamuti, hmyz v jantaru, neandrtálci apod.) Genetické markery •Kódující DNA (geny) •Přepisované sekvence •Genetický kód •Ovlivňují fenotyp •Podléhají přírodnímu výběru •Narůstající význam v molekulární ekologii •Nekódující DNA •Nefunkční (neznámá funkce) •Neutrální k přírodnímu výběru – větší variabilita •Většina DNA u eukaryot •Pseudogeny •Repetitivní DNA Nejčastěji používané genetické markery Sekvence DNA SNPs Mikrosatelity PCR •Z celkové DNA si namnožíme jen úsek, který nás zajímá. • •Co se bude množit? To určí primery. • •Primery – krátké oligonukleotidy komplementární k úsekům ohraničujícím místo našeho zájmu. • primer AGGGGACGTACACTCAGCTTT templát TCCCCTGCATGTGAGTCGAAA primer primer DNA templátu tento úsek se bude množit PCR Příklad programu 95°C 3 min 95°C 30 s 60°C 30 s 72°C 1 min 35x zpět 72°C 10 min Cykly (obvykle 20-40): denaturace (95°C ) nasednutí primerů (50-65°C ) elongace=polymerizace (72°C ) Nejprve však často prodlužená denaturace celkové DNA Nakonec prodloužená elongace • pcr Cycler MJ Research Cycler Eppendorf RoboCycler Stratagene „Molekulárně-genetické“ metody •analýza polymorfismu DNA •konzervativní vs. variabilní úseky (« loci ») •délkový polymorfismus (princip mikrosatelitů) CGCACATCTCTAGCTTCGATTCAGGAA CGCATCTCTAGCTTTGATTCAGGAA Mikrosatelity •VNTR („variable number of tandem repetitions“), SSR („simple sequence repeats“) •jednotlivé alely se liší délkou • TTCAGGCACACACATCTCTAGCTTCGA 27 bp TTCAGGCACACATCTCTAGCTTTGA 25 bp genotyp diploidního jedince: 25/27 „Molekulárně-genetické“ metody •analýza polymorfismu DNA •konzervativní vs. variabilní úseky (« loci ») •sekvenční polymorfismus (princip SNPs): CGCATCTCTAGCTTCGATTCAGGAA CGCATCTCTAGCTTTGATTCAGGAA genotyp diploidního jedince: C/T Studium variability nasyntetizovaného úseku 1)délkový polymorfismus •elektroforéza Rozdělení fragmentů DNA podle velikosti •Agarosa - Hrubé rozdělení (do rozdílu 15 bp) • •Polyakrylamid – Přesnější rozdělení (4 bp) • •Sekvenátor, fragmentační analýza – nejpřesnější (fluorescenčně značené PCR fragmenty, např. značené primery) tools_1a 3LOKCELE detektor laserový paprsek - + Studium variability nasyntetizovaného úseku 2)sekvenční polymorfismus •sekvencování •SNP („single nucleotide polymorphism“) analýza – např. RFLP, SSCP aj. CCGATCAATGCGGCAA CCGATCACTGCGGCAA T G Typ získaných dat počet lokusů počet jedinců počet populací počet vzorků v 1. populaci počet vzorků v 2. populaci, atd. genotypy, tj. velikosti fragmentů v populaci geografické koordináty pop1 pop2 formát GenAlex http://www.anu.edu.au/BoZo/GenAlEx/ Obsah přednášky •Příbuznost (neutrální znaky) –identita (stopy stejného jedince, klony) –paternita, vzdálenější příbuzní –vztah populací (izolovanost, výměna migrantů) –fylogeografie (historie šíření) –hybridizace, hybridní zóny – •Geny pod selekcí –MHC, MUP, ABP, reprodukční proteiny –geny pro zbarvení – • • •Ochranářská genetika ? vrány vydra face