Ochranářská genetika Význam genetické variability pro efektivní druhovou ochranu DNA Msat paternita - barvy CRW_0001 kopie 2 DSCN4561 foto Jan Roleček Ochranářská genetika („conservation genetics“) n nVyužití genetických metod v ekologii = molekulární ekologie nstudium genetické variability přírodních populací a faktorů, které ji ovlivňují nVyužití genetických metod v ochranářské biologii = ochranářská genetika nPCR (90. léta) – počátek skutečné ochranářské genetiky (neinvazivní metody - již není potřeba destruktivního vzorkování) nod r. 2000 - Conservation Genetics nrecentní review a knihy n ConsGenfig congen_kniha primer ConGen Frankham Úvod nÚvod – proč studovat genetickou variabilitu volně žijících druhů nMetody ochranářské genetiky nAplikace na různých úrovních genetické variability nSoučasné nedostatky a budoucnost ochranářské genetiky Obsah přednášky PROČ JE VŮBEC GENETICKÁ VARIABILITA DŮLEŽITÁ ? Genetická variabilita jako ukazatel efektivní velikosti populace nneutrální genetická teorie: He=4Neµ/[4Neµ+1] n nmutation-drift equilibrium n nsrovnání různých populací a jejich Ne br05f01 Úvod Ne – effective population size nvelikost ideální populace (náhodné páření, rovnoměrný poměr pohlaví), která ztrácí genetickou diverzitu stejnou rychlostí jako aktuální populace novlivněna genetickou a věkovou strukturou, poměrem pohlaví, intenzitou inbreedingu atd. n nvývoj genetické variability v malých populacích závisí na Ne více než na N n nNe/N » 0.11 (Frankham 1995), ale velká variabilita n Důsledky poklesu Ne He=4Neµ/[4Neµ+1] Snížení pozorované variability (He) – nejčastěji neutrální markery (mtDNA, mikrosatelity atd.) Pokles adaptivní variability – snížení adaptivního potenciálu (tj. schopnosti přizpůsobovat se změně prostředí) Úvod Ne » 500-1000 = zajištění adaptivního potenciálu Genetický (náhodný) drift Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa AA AA AA AA AA AA aa aa aa aa aa aa aa aa aa aa Bariéra toku genů, např. fragmentace biotopů AA AA AA AA Aa Aa Aa Aa Aa Aa AA Aa Aa Aa Aa Aa Aa AA aa aa Snížení He a Ne Úvod Intenzita driftu závisí na velikosti populace 25 jedinců 100 jedinců POČÍTAČOVÉ SIMULACE VELMI VÝZNAMNÝ VLIV V MALÝCH POPULACÍCH !!! Odhady Ne nFST = 1/(4Ne.m +1) nrecentní přístup: coalescent theory methods nTMVP (Beaumont 2003) nCoNe (Anderson 2005) nMLNE (Wang and Whitlock 2003) nMSVAR (Beaumont 1999) nejméně 2 časové vzorky populace stačí 1 vzorek Populační genetika TMVP NA – ancestral Ne N0 – recent Ne - testuje i rozdíly NA a N0 - přesnější odhady pokud je více časových vzorků, ale stačí jen dva MLNE - zároveň s Ne odhaduje i m MSVAR - stačí jeden vzorek mikrosatelitových dat NA vs N0 Populační genetika Metodické přístupy n n 1) Populační genetika – efektivní velikost populace, tok genů, „bottleneck“, příbuznost, atd. ... neutrální variabilita (např. mikrosatelity) 2) Fylogeografie – historický původ populací a jejich fylogenetické vztahy, ESU ... většinou neutrální variabilita 3) Speciální přístupy – neinvazivní genetické metody, vztah genetické diverzity a životaschopnosti populací, experimentální „conservation genetics“, selektované znaky (adaptivní i škodlivé) 1) Populační genetika nstudium struktury populací nnejčastěji neutrální znaky - mikrosatelity nefektivní velikost populace Ne ntok genů (sex-specific) n„past bottleneck“ npůvod jedinců („assignement tests“) npříbuzenské křížení (inbreeding), atd. n„founder contribution“ n nBayesiánské analýzy (např. program nSTRUCTURE, GENELAND aj.) n- identifikace subpopulací („management units“), n- identifikace hybridů n- identifikace geografických bariér toku genů n A B C D Populační genetika Rhinolophus ferumequinum Genetická struktura populací drift, mutace a migrace n nDrift → diferenciace subpopulací díky fixaci alternativních alel n nMutace mohou zvýšit diferenciaci (odlišit subpopulace) ale riziko homoplázií n n n AA AA AA AA AA AA aa Aa AA aa Aa AA aa Aa Aa aa AA AA aa aa aa aa aa aa Aa Aa Aa Aa drift Stanovení ESU („evolutionary significant units“) a MU („management units“) Supplementary Fig2_100809.jpg K = 3 2) Fylogeografie npoužití fylogenetických metod na úrovni populací (nejčastěji sekvence mtDNA, jaderné markery jsou málo polymorfní) npůvod populací, jejich stáří a historické vazby ndetekce ESU („evolutionary significant units“) – lokální adaptace (mohou, ale nemusí) ndůležité pro reintrodukce br07f07 Př. Směry šíření z glaciálních refugií Fylogeografie Příklad: Castor fiber , sekvence CR mtDNA Durka et al., Mol.Ecol, 14: 3843-3856 (2005) C. canadensis Norsko, Německo, Francie Mongolsko Polsko, Litva, Rusko ESU, MU (spolu s populační genetikou) Fylogeografie 3) Speciální přístupy nškodlivá (detrimental) variabilita – detekce inbrední deprese nidentifikace adaptivní variability – lokální adaptace nexperimentální ochranářská genetika (zejména hmyz a rostliny) nneinvazivní genetické metody Příbuzenské křížení - inbreeding (Left) Absence of inbreeding: horizontal lines connect mates, vertical lines connect parents with … [Credits : Encyclopædia Britannica, Inc.] „outbreeding“ „inbreeding“ Úvod Příbuzenské křížení - inbreeding nNárůst proporce homozygotů je výrazný v malých populacích - samooplození - bratr a sestra - bratranec a sestřenice A: zdravá forma genu a: forma genu způsobující nemoc Možné genotypy: AA Aa aa Outbreeding: AA Aa Aa aa Inbreeding: AA AA aa aa nNárůst proporce homozygotů (odchylky od HWE) - efekt škodlivých recesivních alel n Úvod Inbreeding a fitness nInbrední jedinci mají nižší fitness v důsledku recesivních genetických poruch (reprodukční úspěch nebo schopnost přežívat) n INBREDNÍ DEPRESE OCHRANÁŘSKÁ GENETIKA Stanovení intenzity inbreedingu a inbrední deprese v přírodních populacích Úvod Florida panther – fixace škodlivých alel ncryptochordismus, poruchy vývoje ocasních obratlů, srsti a spermií – téměř fixovány genetickým driftem npozitivní i negativní dopady introdukce teoreticky testovány (Hedrick 1995) nintrodukce osmi pum z Texasu („genetic rescue“) – v následující generaci bylo 20 % genetické informace z Texasu nocas – 7 % vs. 88 % nsrst – 24 % vs. 93 % ncryptochordism – 0 % vs. 68 % n nHybrid superiority (heterosis) – rychlé šíření introdukovaných alel Floridapanther Puma concolor coryi Puma concolor couguar Úvod „Bottleneck“ efekt nDruhy s výrazným snížením genetické variability - prošly „hrdlem lahve“ ngepardi - snížení genetické variability o více než 90 % npřesto se počty výrazně zvedly n„purging“ – odstranění škodlivých alel v důsledku zvýšené selekce na homozygoty Mirounga angustirostris Acinonyx jubatus 1. Inbreeding: AA AA aa aa 2. Selekce: AA AA aa aa 3. „Purging“: AA AA Extrémně výjimečné případy Úvod Adaptivní variabilita nrozdílná prostředí → diverzifikující selekce → lokální adaptace (např. obrana proti lokálním patogenům, potravní vztahy, klimatické podmínky atd.), nOutbrední deprese a)Intrinsic – genetická inkompatibilita (Dobzhansky-Muller incompatibility – epistatické interakce mezi alelami více lokusů) b)Extrinsic – narušení lokálních adaptací n capra_ibex_2 NEMÍCHAT HODNĚ VZDÁLENÉ POPULACE !!! Úvod Experimentální ochranářská genetika nrekonstrukce historických procesů v laboratoři ntestování hypotéz nztráta genetické diverzity v malých populacích nsíla selekce a genetického driftu v malých populacích nvýznam environmentálního stresu na expresi funkčních genů nefekt inbreedingu na přežívání napod. n nmodelové organismy – převážně hmyz a rostliny Experimentální ochránářská genetika Př.: Vztah inbreedingu a teploty Vermeulen and Bijlsma, Heredity 2004 Drosophila melanogaster Experimentální ochránářská genetika METODY ZÍSKÁVÁNÍ DAT Non-invasive genetic methods in conservation genetics nby definition „conservation of rare and endangered animals“ – not possible to kill or even disturb them nneed of methods allowing collection of genetic data without direct contact Ønon-invasive genetic methods medvedí trus otter_orezana Msat paternita - barvy Tři metody získávání vzorků pro DNA analýzy 1. Destruktivní – zvíře je zabito pro získání vzorku tkání pro genetickou analýzu • • 2. Nedestruktivní (invazivní) – zvíře je odchyceno, invazivně odebrán vzorek tkáně (prst) nebo krve n n 3. Neinvazivní – zdroj DNA je ponechán za zvířetem a může být sbírán bez nutnosti odchytit nebo ho jinak rušit Metody získávání dat Orig. V. Bartuška Použití neinvazivních metod nskrytě žijící zvířata – jednoduše získatelné vzorky (trus, chlupy, ...) nvzácné, ohrožené a chráněné druhy – trus, moč – žádné restrikce např. CITES nminimální vliv na chování zvířat – použitelné při studiu chování (prostorová aktivita atd.) Metody získávání dat Zdroje DNA - trus Sběr vzorků Třeboňsko 15 medvedí trus trus (buňky střevní sliznice) → „molecular scatology“ papio tursiops ursusarctos Dugong vlk vydra1 vydry kamzíci IMG_6028 Metody získávání dat Zdroje DNA – chlupy svišť medvěd rys srnec nvlasový folikul („kořínek“) nspeciální lepidlové pasti, ostnatý drát nahled-medved-hnedy-20016 srnec-obecny-5220 rys-ostrovid-3168 Metody získávání dat Zdroje DNA – peří tetřev (Tetrao urogallus) - opět folikul – „kořínek“ jednotlivého pera - lepší vytržené pero (= pasti) než vypelichané pero (často velmi staré) tetrivek Aquila orel královský (Aquila heliaca) tetřívek (Tetrao tetrix) tetrev-hlusec-3178 Metody získávání dat Zdroje DNA - ostatní nmoč – vzácně (Hausknecht et al. 2006 and references therein) nvíce materiálu než trus (frekvence močení je 6 x vyšší než defekace) nvlci – 33 vzorků s měřitelnou DNA koncentrací – 14 (42%) shodných výsledků pro všechny analyzované znaky vlk nsvlečená kůže – plazi nptačí skořápky nbuňky bukální sliznice u vývržků potravy n svlecka1 Metody získávání dat ... umělá „bug-eggs“ - krevsající ploštice Triatominae (Heteroptera) - hodnocení úrovně stresu - použitelná jako „méně invazivní“ metoda v ochranářské genetice Becker et al. 2006 Metody získávání dat Postup analýzy DNA, např. ze vzorků trusu vzorkování čerstvého (≤ 18 hod.) materiálu (96% etanol, SilicaGel aj.) ê izolace DNA (komerční kity pro vzácnou DNA) ê PCR (vysoce kvalitní enzymy) - stačí jedna buňka s DNA analýza variability syntetizovaného úseku ê zber vzoriek2 cycler Msat Lutra 1 sekvence Metody získávání dat Nevýhody a jejich řešení -nízká kvalita/kvantita DNA - nízká úspěšnost zjištění správného genotypu a vysoké riziko kontaminací n Øvyloučení genotypizačních chyb a snížení rizika kontaminace Ø Ø Ø Ø Ø Øidentifikace faktorů pro úspěšnou analýzu Ø Metody získávání dat biohazard spicka Increase of genotyping success rate nmulti-samples, multi-extracts (Goosens et al. 2000) nPCR - multiple-tubes approach (Taberlet et al. 1996) ncost and time-consuming npilot studies are reasonable Disadvantages and their solution Dolphins - tissues vs. fresh faeces 100% probability of obtaining at least two correct genotypes when analysing 8 samples (Parsons 2001) Genotyping errors I. nallelic drop-out nvery low concentration of DNA in samples - only one allele in heterozygotes is amplified n Disadvantages and their solution Heterozygote 100/104 (8 different PCRs) nmultiple tube approach n nstatistical correction n Genotyping errors II. nfalse alleles nPCR artefacts – rarely replicated when using „multiple-tubes“ approach Disadvantages and their solution x gorilla Clostridium nco-amplification of microbial DNA from faeces (Bradley & Vigilant 2002) – confusions with „real“ alleles Homozygote 100/100 (8 different PCRs) Zvýšení koncentrace DNA npre-amplifikace (Bellemain & Taberlet 2004) n nqPCR (Morin et al. 2000, Zemanová et al., submitted) n Log DNA concentration (pg) Positivní PCR Allelic dropout Genotypizace pouze „dobrých“ vzorků Multiplex preamplifikace všech lokusů – zvýšení koncentrace mikrosatelitové DNA CACACA CACACA Semi-nested PCR pro 1-3 lokusy Metody získávání dat Effect of locus Degraded DNA → amplification of short fragments is preferred Median allele size (bp) Disadvantages and their solution (Buchan et al. 2005) papio chimpanzee elephant Influence of diet on faecal DNA amplification npoorly known nMurphy et al. 2003 – brown bears nsalmons in the diet – significant decrease of amplification success nherbivores – better results than carnivores bear eating fish Disadvantages and their solution Vliv typu vzorku a teploty nvydry – masožravci specializovaní na ryby nvliv typu vzorku: výlučky análních žláz (82%) vs. trus (34%) u zmraženého trusu nvýrazný vliv teploty - velmi rychlá degradace DNA v teplém prostředí n výlučky análních žláz trus vydra_vyvalena Metody získávání dat Effect of PCR inhibitors (faeces) nmany inhibitors in faeces (products of digestion, chemicals in plants) – addition of special reagents (BSA), hot-start etc., dilution of template etc. DNA from faeces → no PCR DNA from tissues → PCR is OK Mix both extracts PCR is OK → problem with DNA quality or quantity no PCR → problem with inhibitors High contamination risk navoiding of „laboratory“ contamination (tips with filters, separated pre- and post-PCR laboratories, UV sterilisation, etc.) n„mixed samples“ – problems in social species (communal latrines, marking in fixed sites) or in sampling at broad intervals („hair traps“) – usually identified by 3 or more alleles/sample; problem in species with low genetic variability nprimates – contamination with human DNA Disadvantages and their solution biohazard spicka Tracking of the endangered Pyrenean brown bear population nhair and faeces n24 microsatellite loci none yearling, three adult males, one adult female nspatial activity nsuggestions for conservation management Definition and principles bear2 Taberlet et al. 1997, Molecular Ecology Příklady: IDENTIFIKACE DRUHŮ n cytochrom b (mt DNA – mnoho kopií v jedné buňce) – 189 bp PCR produkt (100% úspěšnost amplifikace ze vzorků trusu n n štěpení restrikčními enzymy: n vydra 80 a 189 bp n norek 101 a 189 bp n tchoř 127 a 189 bp portrét norka P1050829upr Image:Ilder.jpg Identifikace druhů – „DNA barcoding“ Forenzní analýzy nnelegální lov a obchod nrostoucí obchod s vydřími kožešinami v Asii (Kambodža, Indie, Čína, Nepál, Rusko; Kruuk 2006, Yoxon 2007, IOSF) otter3 Hairy-Nosed Otter skin and traps suppled by the middleman trader to a hunter in Tonle Sap, Cambodia Five hairy-nosed otter skins, one young smooth-coated otter (top left) and an Asian small-clawed otter (top) Lhasa_otter_skins Jezevčí chlupy v luxusních holicích štětkách n4 štětky z 8 pocházely z jezevce lesního n3 z nich z Holandska, kde je ilegální "držet, prodávat, transportovat nebo používat ke komerčním účelům mrtvé jezevce lesní nebo produkty z nich odvozené" arctonix_collaris badger Jezevec lesní (Meles meles) Jezevec bělohrdlý (Arctonyx collaris) x nDomingo-Roura et al., Biological Conservation (2006) Identifikace druhů tiger0011.jpg 5d traditional Chinese medicine DSC01868 tbw nidentifikace chráněných druhů v různých produktech (např. tygři vs. asijská medicína) nanalýzy mtDNA – velrybí maso legálně prodávané v J Korei a Japonsku – i chráněné druhy velryb, delfíni, sviňuchy, ale i ovčí a koňské maso (Baker et al. 1996, 2006) In this image made from video released by Karl Amman, a wildlife photographer and investigator into the illegal trade in animals, poachers skin a forest elephant for its meat and tusks in the Bungui forest, in the Central African Republic Thursday, May 3, 2007. Most people believe international demand for ivory is the biggest threat to elephants. But while wildlife experts are meeting in the Netherlands through June 16 to discuss the ban on the ivory trade, forest elephants, perhaps the most endangered elephant species in the world, are being hunted to extinction not only for their tusks, but for their meat. From AP Photo by Karl Amman. UK to grant China ivory trade license 0002 tusks-721423 Ivory_trade_seized%40large nmonitoring ilegálního obchodu se slonovinou (Comstock et al. 2003, Wasser et al. 2004), identifikace „bush-meat“ – nelegální lov velkých savců v Afrike (Malisa et al. 2006) Příklady: IDENTIFIKACE POPULACÍ A JEJICH VZÁJEMNÝCH VZTAHŮ Vydra říční ve střední Evropě n nsilný pokles početnosti v minulém století nfragmentace populací nCíle: nodhad populační početnosti ze vzorků trusu npopulačně-genetická analýza – stanovení bariér toku genů, Ne, "bottlenecks" atd. n vydraVasek2_orezana_zelena vydra3 mapaCS_modraKev2004 kopie stable rare Czech Republic Austria Slovakia Hungary Poland 1. BARIÉRA MEZI ČESKOU A SLOVENSKOU POPULACÍ Hájková et al. 2007, J. Zool. Vydra říční ve střední Evropě n nsilný pokles početnosti v minulém století nfragmentace populací nCíle: nodhad populační početnosti ze vzorků trusu npopulačně-genetická analýza – stanovení bariér toku genů, Ne, "bottlenecks" atd. n vydraVasek2_orezana_zelena vydra3 mapaCS_modraKev2004 kopie stable rare Czech Republic Austria Slovakia Hungary Poland 2. VÝRAZNÉ SNÍŽENÍ Ne ZHRUBA PŘED TŘICETI LETY (od té doby nárůst české populace) Hájková et al. 2007, J. Zool. Vydra říční ve střední Evropě nsilný pokles početnosti v minulém století nfragmentace populací nCíle: nodhad populační početnosti ze vzorků trusu npopulačně-genetická analýza – stanovení bariér toku genů, Ne, "bottlenecks" atd. n vydraVasek2_orezana_zelena vydra3 mapaCS_modraKev2004 kopie stable rare Czech Republic Austria Slovakia Hungary Poland 3. INTRODUKOVANÍ JEDINCI NA SEVERNÍ MORAVĚ NEPOCHÁZEJÍ Z ČESKÉ ANI SLOVENSKÉ POPULACE Hájková et al. 2007, J. Zool. Hybridizace – sekundární kontakt dvou populací Zemanová et al., submitted Tatry IMG_6038 © J. Ksiažek convert convert convert R. r. tatrica R. r. rupicapra Tatry Nízké Tatry Vel. Fatra Slovenský ráj Structure, K = 2 Structure, K = 3 BAPS, K = 3 Hybridizace – sekundární kontakt dvou populací Zemanová et al., submitted Příklady: IDENTIFIKACE POHLAVÍ Identification of sex nsexual structure of population ngenetically determined sex nmarkers: mammals – SRY, amelogenin; birds – CHD nspecies-specific markers must be used (otherwise cross-amplification with species in the diet) Advantages and application gorila4 bear3 odocoileus x Murphy et al. 2003 Příklady: IDENTIFIKACE JEDINCŮ Identification of individuals nmultilocus microsatellite fingerprinting – power estimated as „probability of identity“ (P(ID)) (Waits et al. 2001) n Advantages and application Number of loci (H=0.6) Random Sibs npilot studies with tissue samples are required to identify P(ID) in a studied population Identifikace jedinců nprostorová aktivita n vydra_snezna Identifikace jedinců Identifikovaní jedinci - Hornád, NP Slovenský Raj mapa_komplet_orezana SR 1 SR 2 SR 3 SR 4 SR 5 SR 6 SR 7 SR 8 SR 9 SR 10 1 km vydra1 vysek02 kopie_orezana Ind. SR 3 otter_otocena_hneda 5. 4. 2003 4. 11. 2003 10. 11. 2003 11. 11. 2003 30. 12. 2003 500 m Hornad Prostorová aktivita v horském prostředí Non-invasive CMR studies nVelikost populace n„Capture-Mark-Recapture“ (review in Lukacs & Burnham 2005) nOpakované vzorkování stejného zvířete nPřežívání, populační dynamika atd. nClosed population models, open population models, Robust design models nKorekce na genotypizační chyby nTrus – analýza individuální variability v potravě (př. kojoti - Fedriani & Kohn 2001) n kojot Populační dynamika kojotů (Prugh et al. 2005) Identifikace jedinců Brown bears (Ursus arctos) in Scandinavia (Hakon Solberg et al. 2006, Biological Conservation) grizzly nobservations – underestimate numbers nnon-invasive CMR is cheaper and more precise than helicoptere census CMR CMR Diet of the extinct Ground Sloth (Nothrotheriops shastensis) nPoinar et al. (1998) – Science n20 000 years ago nchemical modification of DNA in ancient faeces before PCR nidentification of species and phylogeny to modern mammals ncpDNA – diet of the Ground Sloth Examples BUDOUCNOST OCHRANÁŘSKÉ GENETIKY Praktické problémy ochranářské genetiky nmladé odvětví = mnoho problémů n nvýznam genetické variability pro životaschopnost populací => experimentální ochranářská genetika n nextrémní neznalost adaptivní variability u volně žijících druhů vydra face taurotragus_1 Budoucnost ochranářské genetiky Adaptivní variabilita imunitních genů nMHC („major histocompatibility complex“) ngeny významné pro zahájení imunitní odpovědi ntrus – parazitologické vyšetření – asociace mezi výskytem určité MHC alely a napadením parazity n Homozygote 01/01 Homozygote 02/02 Heterozygote 01/02 AATGACCGA-blue TTACTGGCT-red AATGCCCGA-blue TTACGGGCT-red AATGACCGA-blue TTACTGGCT-red AATGCCCGA-blue TTACGGGCT-red Budoucnost ochranářské genetiky Př. Použití metody SSCP na identifikaci MHC alel ch7_MHC-proteins Genome Transcriptome Proteome DNA mRNA Proteins Transcription Translation Genomics Transcriptomics Proteomics GP_FA7TYN03040706_inv 3 billion bases 20-30,000 genes ~100,000 proteins Functional Genomics nExprese jednotlivých genů – quantitative real-time PCR n - známý kandidátní gen (modelové druhy) n nExprese mnoha genů najednou (genomic scale) - microarray n - identifikace kandidátních genů – detekce jejich exprese může podat důležitou informaci o jeho funkci (různá v odlišném prostředí, vývojovém stadiu, stresu atd.) Transkriptomika Budoucnost ochranářské genetiky , and it basically consists of a small glass slide containing samples of many genes arranged in a regular pattern Praktické problémy ochranářské genetiky nmladé odvětví = mnoho problémů n nvýznam genetické variability pro životaschopnost populací => experimentální ochranářská genetika n nextrémní neznalost adaptivní variability u volně žijících druhů n nidentifikace ochranářských jednotek na základě genetických dat → praktická ochrana n vydra face taurotragus_1 Budoucnost ochranářské genetiky Budoucnost ochranářské genetiky CONGRESS (2010-2013) Conservation Genetic Resources for Effective Species Survival Conservation Genetic Resources for Effective Species Survival Conservation Genetic Resources for Effective Species Survival FP7-ENV-2009-1, Coordination and support action