1 Elektroforetické metody Princip Rozdělení proteinů (nejčastěji krevních bílkovin) na základě jejich pohyblivosti v elektrickém poli. Po tomto kroku většinou navazují další metody založené na reakci antigen – protilátka. Důležité je, že bílkoviny se dělí podle povrchového náboje. K realizaci elektroforetických metod je nutný zdroj stejnosměrného elektrického proudu, speciální elektroforetické vany, vhodný pufr a vhodný nosič. Jako nosič se v minulosti používal papír, acetatcelulózová membrána nebo agar, dnes se prakticky výlučně používá agaróza nebo polyakrylamidový gel. Rozdíl mezi agarózou a agerem spočívá v tom, že agar je nehomogenní směs polysacharidů získaných z mořských řas, zatímco agaróza je homogenní, po chemické stránce se jedná o polymer složený z disacharidových jednotek – agarobiózy. Agaróza se pro elektroforézu používá v koncentraci 0,5 – 2 %. Při této koncentraci tvoří gel, který vyhovuje požadavkům, pouze je křehký, což mírně komplikuje manipulaci. Polyalrylamid je homogenní, hydrofilní, má výborné mechanické vlastnosti, nízkou elektroosmózu a nízkou absorpci. Lze ho připravit v různé hustotě, zkoumané látky se potom dělí nejen podle náboje, ale i podle velikosti molekul. Nevýhodou je pouze toxicita základního monomeru. Imunoelektroforéza: jedná se o elektroforetickou separaci následovanou imunoprecipitací rozdělených proteinů specifickými protilátkami, většinou v prostředí agarózy. V této metodě je tedy obsažena i imunologická reakce antigen – protilátka. Metoda imunoelektoforéza (imunoelfo) byla poprvé publikována v roce 1952 a od té doby našla rozsáhlé uplatnění v imunologickém výzkumu i diagnostice. V současnosti se nejvíce používá při stanovení paraproteinu (čili neúplných řetězců imunoglobulinů) při monoklonálních gamapatiích. Výhody a nevýhody: metoda imunoelektorforézy je nenáročná na čas i vybavení, není drahá. Pouze proces odečítání a interpretace výsledků je do značné míry závislý na zkušenostech pracovníka, o složitosti této problematiky svědčí fakt, že o imunoprecipitaci proteinů existují celé samostatné monografie. Imunofixace: je modifikací imunoelektroforézy; spočívá v tom, že po elektroforéze se na agarózový gel položí maska s výřezy. Otvory se naplní příslušnými protilátkami anti IgG, anti IgA, anti IgM, anti kappa, anti lambda. Vzniklé precipitační linie se pak porovnávají se standardním sérem a lze tak posuzovat odchylky ve smyslu poklesu nebo nárustu jednotlivých tříd protilátek, resp. lehkých řetězců. Využití elektroforetických metod: - orientační vyšetření bílkovin krevní plasmy: zde se nejčastěji posuzují linie odpovídající albuminu, α1 α2 β a γ globulinu. Při imunologických vyšetřeních lze touto metodou zachytit zvýšení, resp. snížení γ globulinové frakce. - rozdělení antigenů pro imunoblotting - obecně dělení bílkovin v experimentálních studiích ÚLOHA 10: Raketová elektroimunodifuze podle Laurella Princip Zkoumaný antigen je stejnosměrným elektrickým proudem unášen po gelu s protilátkou. Vazbou antigenu a protilátky vznikají imunokomplexy, které se projeví jako precipitát v podobě tzv. raket. Podstatou techniky je putování antigenu a tvorba imunokomplexů až do vzdálenosti, ve které je veškerý antigen ze vzorku vyvázán protilátkou v gelu. Jde o jednu z nejpřesnějších kvantitativních elektroimunodifuzních metod. Výhody a nevýhody Metoda je poměrně přesná a jednoduchá na provedení. Vyžaduje však nákladné přístrojové vybavení. Je také nutné počítat s nejméně hodinovou rezervou při elektroforetické fázi a vyhodnocení výsledku je možné až po určité době. Chemikálie a roztoky 1. Komerční lidské sérum obsahující IgM pro kalibraci (Orion Diagnostica) Obsah IgM je 2 g/l. 2. Protilátka - sérum s anti-IgM protilátkami 3. Fyziologický roztok 4. Agaróza v práškové formě 5. Borát-fosfátový pufr (pH 6,8) 6. Roztok Coomassie blue - malé množství rozpuštěné v dH[2]O 7. Barvící roztok 225 ml CH[3]OH + 25 ml CH[3]COOH + 0,25 g amidočerni 10B 8. Odbarvovací diferenciační roztok CH[3]OH : CH[3]COOH - 10:1 Vzorek: Komerční lidské sérum obsahující neznámé množství IgM (Orion Diagnostica) Vystupuje jako antigen. Přístroje a pomůcky Skleněné plotny 5x5 cm, skleněná pipeta, korkovrt na vysekávání jamek, vývěva, zdroj napětí, elektroforetické komory, Petriho misky na vlhkou komůrku, filtrační papír. Skleněné plotny s agarózovým gelem: 1. Vyvážíme podložku na nalévání do vodorovné polohy. 2. Skleněnou plotnu (5x5 cm) očistíme alkoholem a necháme oschnout. 3. Připravenou skleněnou pipetu několikrát propláchneme horkou vodou. 4. Na plotnu naneseme skleněnou pipetou 2,4 ml 1% roztoku agarózy v borát-fosfátovém pufru s anti-IgM sérem (5 ml séra do 45 ml roztoku agarózy) 5. Gel necháme několik minut zatuhnout na kalibrované vodorovné ploše. 6. Z Petriho misky a vlhkého filtračního papíru připravíme vlhkou komůrku. Do ní umístíme skleněnou plotnu s agarózou, aby tato nevyschla. Postup (vlastní práce) - pracujeme ve dvojicích 1. Ze zásobního komerčního séra o známé koncentraci IgM si připravíme další ředění. a) do zkumavek 2. a 3. napipetujeme 10 μl fyziologického roztoku b) do zkumavky 1. napipetujeme 20 μl séra se známou koncentrací IgM c) ze zkumavky 1. přenášíme 10 μl do zkumavky 2., důkladně promícháme a přeneseme 10 μl do zkumavky 3. d) do další zkumavky si připravíme směs 10 μl ze zkumavky 3. a 5 μl roztoku coomassie blue Označení zkumavky 1. 2. 3. 4. Coomasie Blue - - - 5 µl Fyziologický roztok - 10 µl 10 µl - Antigen (sérum) 20 µl - - - Ředění: - 2x 4x - Koncentrace [g/l]: Celkový objem: 10 µl 10 µl 10 µl 15 µl 2. Podle šablony vysekáme do gelu s protilátkou řadu pěti jamek. Do jamek naneseme: a) do prvních tří jamek 5 μl ze zkumavek 1.-3. b) do čtvrté jamky 5 μl séra o neznámé koncentraci c) do páté jamky 5 μl naředěného kontrolního séra smíchaného s roztokem coomassie blue. 3. Do elektroforetických komor nalijeme borát-fosfátový pufr, na hranici mezi katodou a anodou položíme připravená sklíčka a ze dvou protilehlých stran (od katody a anody) přiložíme na kraj gelu filtrační papír nasátý borát-fosfátovým pufrem za účelem vedení elektrického proudu. 4. Každou komoru obsahující tři sklíčka zakryjeme a zapojíme elektrický obvod tak, aby do každé elektroforetické komory vedl proud o velikosti 60 mA (20 mA na sklíčko). Elektroforéza bude probíhat cca 1 hodinu, přičemž její průběh budeme sledovat na séru označeném roztokem coomassie blue. 5. Po skončení elektroforézy pereme skla nejvýše 2 minuty ve fyziologickém roztoku, zabalíme je do chromatografického papíru navlhčeného fyziologickým roztokem a přes noc sušíme při pokojové teplotě. 6. V dalším cvičení sejmeme ze sklíček papír, skla opereme pod tekoucí vodou a barvíme barvícím roztokem do dostatečného obarvení linií. Pozadí odbarvíme diferenciačním roztokem. Nakonec opereme v destilované vodě a usušíme bez papíru. 1 : 8 1 : 4 1 : 2 konc. Ukázka raketové elektroimunodifuze Hodnocení Plocha raketky po odečtení startovací jamky je úměrná koncentraci antigenu. Pro zjednodušení je možné změřit pouze výšku raketky od horního okraje startovací jamky. Změřte výšku a šířku vzniklých precipitačních útvarů a vypočítejte jejich plochu. Hodnoty plochy precipitačních útvarů (cm^2) u prvních tří jamek vyneste do bodového grafu proti hodnotám koncentrace séra v příslušné jamce a vyneste kalibrační křivku s rovnicí regrese a hodnotou spolehlivosti Hodnotu plochy precipitačního útvaru u čtvrté jamky (lidské sérum o neznáme koncentraci IgM) dosaďte do rovnice regrese a vypočítejte koncentraci IgM. Výstup 1) Tabulku s hodnotami plochy precipitačních útvarů různých koncentrací kontrolního séra a vzorku. 2) Kalibrační graf závislosti plochy precipitačních útvarů na koncentraci kontrolního séra s rovnicí regrese a hodnotou spolehlivosti. 3) Výpočet koncentrace IgM ve vzorku lidského séra. 4) Oskenovaný obrázek sklíčka s precipitačními útvary (dodá vyučující).