Úvod do studia biologie kmenových buněk Jiří Pacherník e-mail: jipa@sci.muni.cz tel: 532 146 223 Co jsou kmenové buňky? - buňky schopné vlastní obnovy (sebeobnova) - buňky schopné dávat vznik jiným typům buněk (schopnost diferenciace / rozrůzňování) Kmenové buňky v dospělém organismu SC diferenciace & proliferace Vnější faktory zodpovědné za zachování kmenových buněk auto- a parakrinně působící faktory niche diferenciace & proliferace Niche (Naveiras, 2006) Původ kmenových buněk Pluripotentní embryonální kmenové buňky Embryonální kmenové buňky (Embryonic stem cells ­ ES) Embryonální zárodečné buňky (Embryonic germ cells ­ EG) Embryonální nádorové buňky (Embryonal carcinoma cells ­ EC) Donovan 2001 ES EG EC Gilbert 1997 / Bílek 2004 Diferenciační potenciál ES buněk odvozených z vnitřní buněčné masy Verifikace kmenových buněk sebeobnova x schopnost diferenciace Somatické kmenové buňky - specifické znaky/markery a vlastnosti - sebeobnova ­ opakované transplantace - diferenciace in vitro - diferenciace in vivo Embryonální kmenové buňky - specifické znaky/markery a vlastnosti - diferenciace in vitro - diferenciace in vivo - chiméry - teratomy a) Embryoidní tělíska (Embryoid bodies - EB) +jednoduché, více buněčných typů + tolerující genotyp - špatně definované podmínky b) V monovrstvě + lépe definovné podmínky - malá výtěžnost - silně závislé na genotypu (myš) Diferenciace ES / EC buněk in vitro kultivace selekceindukce Rathjen 1998 / Bílek 2004 kultivace selekceindukce Model pro studium vzniku a zachování somatických kmenových buněk ES buňky somatické kmenové buňky izolace progenitory diferencované buňky kultivace selekceindukce Model pro studium vzniku a zachování somatických kmenových buněk v našich experimentech ES buňky s geneticky modifikovanými faktory podezřelýmy z regulace fenotypu somatických kmenových buněk somatické kmenové buňky izolace progenitory diferencované buňky specifické inhibitory - četnost vzniklých somatických kmenových buněk - jejich vlastnosti (fenotyp a potenciál pro další diferenciaci) Neurogeneze Hematopoéza Laboratoř Příklad signální kaskády cytokinů na dráze transdukce signálu interleukinu-6 (IL-6) Heinrich 2003 JAK ­ Janusova kináza (tyrosin kináza) STAT ­ transduktor signálu a aktivátor transkripce (signal transducer and activator of transcription) Výběr nejvýznamějších oblastí vyžadujících metabolizmus retinolu/vit.A A) fotorecepce B) růst a vývoj organismu Ross, 2000 Kyselina retinová - RA velmi silný induktor pleiotropní působení ES / EC + EB + RA buňky neurální buňky kosterní svaloviny a adipocyty buňky srdeční a hladké svaloviny nM RA ES / EC + monovrstva + RA buňky primitivního entodermu neurální buňky (motoneurony?) McCaffery a Dräger, 2000 A/B DC FE A/B DC E LBD/AF-2DBDAF-1 LBD/AF-2DBDAF-1 EEIVPS74PPS77PPPLPR EELVPS67PPS70PLPPPR EEMVPSS66PS68PPPPPR EEMVPSS77PS79PPPPPR RARa1 RARb2 RARg2 RKRRPS369RP RKRRPS362KP RRRRPS360QP RRRRPS371QPRARg1 RXRa SSSLNS22PTGR....S44P.. S48P.. S54P... SS61P.. SS75P..PTT87P S96P..S101P LNPSS265PNDP Serinové a threoninové zbytky fosforylované ( ) u RAR/RXR receptorů, ukázány jsou i potencionálně fosforylovatelné(čísla) AF-1 (A/B doména) ­ oblast regulující aktivaci transcripce, nezávisle na ligandu DBD (C doména) ­ DNA vázající doména (DNA-binding domain) LBD/AF-2 (D/E doména) ­ oblast regulující aktivaci transkripce, závislé na ligandu PKAMAPKs + cdk7 JNK1 + JNK2 NN- -C -C Systém pro detekci RA v buňkách/tkáních (RARE-LacZ reportér) RARE * LacZ RAR RXR RA RA RA RA Xn* b-galaktozidáza *další faktory/sekvence nezbytné pro funkci promotoru X-Gal X-Gal X-Gal X-Gal X-Gal Exprese a aktivita RALDH-2 v mozku myšího embrya (16 dpc) A) In situ hybridizace mRNA RALDH-2 B + C) RARE aktivita (RARE-LacZ reporter) Detekce buněk exprimujících indukovanou b-galaktosidázu McCaffery, 2000 Relativeluciferaseactivity 1 10 100 1000 i il ir ilr i-uo il-uo ir-uo ilr-uo i-ag il-ag ir-ag ilr-ag RA - - + + - - + + - - + + LIF - + - + - + - + - + - + AG490 (5 mM) - - - - + + + + - - - UO126 (5 mM) - - - - - - - - + + + + Relativeluciferaseactivity 0 400 800 1200 1600 c a5 a40 L La5 La15 La40 R LR LR a5 LR a15 LR a40 AG490 (mM) - 2.5 22.5 - 2.5 7.5 22.5 - - 2.5 7.5 22.5 LIF - - - + + + + - + + + + RA - - - - - - - + + + + + Enz Schematický princip imunodetekce Enz Účinek séra na RA indukovanou neurální diferenciaci 6 days RT-PCR analýza exprese liniově specifických genů neuroektoderm entoderm Nediferencované buňky EC P19 Diferencované buňky EC P19 monovrstva + RA - sérum Diferencovane buňky EC P19 monovrstva + RA + sérum buněčná jádra cytokeratin EndoA pozitivní buňky ­ entoderm N-CAM pozitivní buňky - neurony Leukemie inhibujicí faktor (LIF) posiluje RA indukovanou neurální diferenciaci EC buněk linie P19 Proliferace Diferenciace Apoptóza neuroektoderm entoderm ? SB-202190 UO 126 AG490 transkripční aktivita Stat-3 (reporter pAPRE-luc) transkripční aktivita AP-1 (reporter p3TP-Lux) transkripční aktivita RAR/RXR (reporter pRAREb2-luc) exprese a postranslační modifikace regulačních proteinů Bowman 2000 N-CAM Neuron-specific III b-tubulin RA RA+LIF AG 490 - + - - + UO 126 - - + - - + Total protein 4 ds - + - - + - - + - - + RA RA+LIF 6 ds P-Erk Erk UO126 - + - + - + - + LIF - - + + - - + + RA - - - - + + + + Detekce fosforylace (posttranslační modifikace) Erk kinázy (specifické protilátky) Detekce stupně diferenciace EC buněk indukovaných neurálním směrem (specifické protilátky)