Návod k praktické úloze ,,Testování specifických účinků environmentálních vzorků"
1. Cíl cvičení
Cílem cvičení je, aby byl po jeho absolvování student schopný provést in vitro test
s kvasinkovými kulturami, aby chápal principy jeho fungování a aby byl schopen vyhodnotit
změřené výsledky.
2. Teoretický úvod
Řada látek přítomných v životním prostředí působí nejen akutní toxicitou, ale také toxicitou
chronickou projevující se často subletálními účinky. Mezi tyto látky patří především
persistentní organické polutanty a jejich deriváty, polyaromatické uhlovodíky, pesticidy, těžké
kovy nebo farmaka.
Mezi subletální a chronické účinky těchto látek patří například karcinogenita a genotoxicita,
imunotoxicita, teratogenita nebo endokrinní disrupce. Řada z těchto účinků je spojována
především s modulací receptorových mechanismů, kdy dochází k narušení přirozených
převodů signálů mezi receptory, což může vést k nežádoucím efektům na úrovni celého
organismu. Protože testování chronických a subletálních účinků chemických látek
na zvířecích modelech in vivo je velice nákladné, dlouhotrvající a je nutné použít velkého
množství zvířat, používají se často testy in vitro.
Mezi in vitro modely lze zařadit především buněčné, tkáňové a orgánové kultury. Využívají
se zejména pro studium specifických mechanismů toxicity nebo pro rychlý ,,screening". Jejich
výhodou oproti in vivo testům je nižší cena, možnost automatizace, nebo kratší doba trvání
testu. Nevýhodou je především izolace systému od organismu.
Endokrinní disrupce
Látky narušující hormonální rovnováhu organismů (endokrinní disruptory) ovlivňují syntézu,
sekreci, transport, nebo vazby či vylučování endogenních hormonů, které se podílejí
na homeostatických, reprodukčních, vývojových a behaviorálních funkcích organismu.
Tyto účinky mají na příklad některé pesticidy, polyaromatické uhlovodíky, polychlorované
bifenyly nebo některá farmaka. Přestože tyto látky mohou ovlivňovat hormonální rovnováhu
na různých úrovních, nejčastěji je studován jejich vliv na přenosy signálů buněčných
receptorů. Intenzivně studováno je především ovlivnění signálních drah estrogenních nebo
androgenních receptorů a to jak jednotlivými xenobiotiky tak komplexními vzorky
z životního prostředí.
In vitro modely endokrinní disrupce
In vitro modely jsou často používány pro stanovení specifických mechanismů účinku a jedná
se o testy využívající hlavně buněčné a tkáňové kultury. Většina těchto testů je prováděna
na různě modifikovaných buněčných liniích odvozených z nádorů, používají se především
linie odvozené z nádorů savců. Kromě těchto testů se využívají také testy s kvasinkovými
kulturami. Kvasinkové testy jsou jednodušší, rychlejší a méně náročné na vybavení a
zkušenosti. Oproti tomu, výhodou testů se savčími buněčnými liniemi je především zahrnutí
intracelulárního metabolismu, zvláště možné ovlivnění hladin cytochromů a dalších
důležitých enzymů a také zohlednění vlivu dalších aktivovaných receptorů na signální dráhy
studovaných receptorů (např. vliv aktivace AhR při antiandrogenitě nebo antiestrogenitě).
Nejčastěji jsou používány modely založené na expresi vloženého reporterového genu, která je
spuštěna po aktivaci sledovaného receptoru. Jedná se například o reporterový gen pro tvorbu
enzymu luciferasy, ale také např. -galaktozidasy.
3. Provedení testu
Obsah:
1. Metoda
2. Chemikálie a materiál
3. Pracovní postup
4. Výsledky
5. Použitá literatura
1. METODA
Jedná se o rychlý a levný test na kvasinkovém organismu, který slouží ke sledování
specifických mechanismů účinku nejen čistých látek, ale i komplexních směsí. Směsi bývají
extrahovány z různých environmentálních matric jako jsou sedimenty, voda, půda či vzduchy.
Test umožňuje ohodnotit celkový účinek směsi látek, což znamená, že zahrnuje potenciální
interakce mezi látkami, jako antagonismus či synergismus.
Testovacím organismem je transgenní kvasinková linie Saccharomyces cerevisiae, u níž je do
genomu vložen ,,reporterový" gen, který citlivě odpovídá na aktivaci receptorového
mechanismu.
V rámci cvičení budeme používat AR - responsivní linii kvasinek, transfekované genem
pro androgenní receptor (AR) a reporterovým genem pro luciferázu. Ligand (komplexní
vzorek) se v jádře naváže na receptor. Vazbou na specifické responsivní elementy (ARE)
v oblasti promotoru cílového genu se aktivuje transkripce příslušného enzymu ­ luciferázy.
Po přidání substrátu (D-luciferinu) se měří luminiscence.
Paralelně obvykle probíhá kontrolní kvasinkový test (kmen ,,luc") kvůli případné cytotoxicitě,
který v rámci cvičení používat nebudeme. Kvasinkové buňky tohoto kmene jsou
ransfekovány genem pro enzym luciferázu, který není vázán na specifickou odpověď
(po přidání D-luciferinu živé buňky vždy indukují luminiscenci).
2. CHEMIKÁLIE A MATERIÁL
- agar, kvasinkové kultury, sterilní roztoky komplexního a minimálního média , 40% roztok
glukosy a sterilní roztoky aminokyselin, 1mM roztok luciferinu
- plastové Petriho misky o průměru 5cm
- špičky
- sterilní lahvičky 20ml a lahve 100 a 250ml
- opakovací a automatické pipety 1-10l, 100-1000l
- 30o
C inkubátor s třepačkou na mikrodestičky pro inkubaci
- bílé 96-ti jamkové mikrodestičky
- luminometr, autokláv, flow-box, spektrofotometr
Důležité: s kvasinkovými kulturami musíme pracovat za sterilních podmínek v laminárním
boxu ­ nástroje a laboratorní nádobí musíme udržovat sterilní nebo ho sterilizovat v plameni
či autoklávu.
Média pro buňky budou pro potřeby cvičení připravena dopředu, ale jsou uchovávána
bez uhlíkového zdroje a aminokyselin. Roztoky glukózy a aminokyselin proto budeme do
médií v čas potřeby přidávat.
3. PRACOVNÍ POSTUP: 1.den - zajistí vedoucí cvičení, studenti neprovádějí
Příprava agarových ploten
1. 30ml komplexního média bez glukosy a aminokyselin sterilně odlijte do nejméně
100-mililitrové láhve.
2. Láhev zakryjte, ale ne úplně! Autoklávujte jako kapaliny.
3. Po autoklávování sterilně přidejte roztoky glukosy (50ml/l) a aminokyselin (histidin
10ml/l, adenin 10ml/l, leucin 10ml/l ).
4. Nalijte agar na sterilní plotny (cca 15ml na 1 misku).
7. Plotny nepřikrývejte dokud nejsou úplně ztuhlé.
8. Pokud ihned nezahájíme kultivaci kvasinek, uchováváme garové plotny při pokojové
teplotě dnem vzhůru tzn. agarovou stranou nahoru zakryté parafilmem.
Zahájení kultivace z glycerolové zmrzlé kultury
1. Agarové plotny pro kmeny kvasinek, které chceme kultivovat označte jménem kvasinek,
datem a osobními monogramy.
2. Za sterilních podmínek ve flow-boxu seškrábněte trochu z povrchu zamrzlé kultury sterilní
špičkou a naneste kulturu křížovým roztěrem na agarovou plotnu.
3. Zbývající zmrzlou kulturu vraťte ihned zpět do mrazáku (-80 o
C).
4. Agarové plotny se uchovávají dnem vzhůru ve 30 o
C dva až tři dny ve tmě do velikosti
jedné kolonie kvasinek 1mm.
PRACOVNÍ POSTUP: 3.den ­ 1. den cvičení pro studenty (cvičení potrvá max. 1h)
Ke sterilnímu minimálnímu médiu přidejte sterilně příslušné množství glukosy (50ml/l) a
aminokyselin (histidin 10ml/l, adenin 10ml/l, leucin 10ml/l).
Nárůst kultur v roztoku příslušného média - zahájení pre-kultivace z agarové plotny
1. Ve flow-boxu nalijte 3ml minimálního média s glukosou a aminokyselinami do sterilní
,,penicilínky". Kvůli provzdušňování kultury neplňte lahvičku víc než do dvou třetin.
2. Vyberte samostatnou kvasinkovou kolonii o velikosti cca 1mm a přeneste ji z agaru
do tekutého média v ,,penicilínce". Nezavírejte úplně.
3. Inkubujte ve 30 o
C za mírného třepání ve tmě přes noc.
PRACOVNÍ POSTUP: 4.den - 2. den cvičení pro studenty (cvičení potrvá max. 6h)
1. Naočkovaná kvasinková pre-kultura v minimálním médiu s glukosou a aminokyselinami
přes noc v tmavém prostředí za třepání ve 30 o
C naroste.
2. Ráno na spektrofotometru změříme OD600nm (optická hustota) z dvacetkrát naředěné
kultury (50l kvas. kultury + 950l dest.vody). Před měřením zamíchejte střídavým
obracením kyvety dnem vzhůru, aby se kvasinky neusadily.
3. Použijeme program Simple Reads na spektrofotometru CARY 50 Bio. Z naměřených
hodnot OD vypočítejte rozředění v příslušném médiu pro celou desku. Rozředění musí být
takové, aby konečná hodnota OD600nm kultury byla okolo 0,4.
Příklad výpočtu:
Ráno jsem naměřil OD600nm 0,213 ­ pokud mám směs v kyvetě naředěnou 20x, pak
0,153x20 = 3,06. To znamená, že mám v 1ml (v kyvetě je 1ml) OD600nm = 3,06. Potřebuji ale
0,4, takže směs naředím 7,7x.
Na jednu desku potřebuji 10ml roztoku, takže vezmu 1,3 ml kvasinkové suspenze + 8,7ml
minimálního média s glukosou a aminokyselinami.
4. Vhodně zředěnou kulturu dejte zpátky na třepačku do inkubátoru při teplotě 30o
C do tmy
na 2 hodiny k dosažení OD600nm 0,6-0,7.
5. Poté pipetujte 100l kvas. kultury pomocí opakovací pipety do každé jamky bílé destičky.
6. Přidejte 1l vzorku nebo estradiolu ­ kalibrace (15 pM -100 000 pM) v MeOH (finální
koncentrace rozpouštědla nesmí přesáhnout v jamce 2%).
7. Přikryjte destičku víčkem a třepejte 20s na třepačce. Inkubujeme při 30o
C ve tmě po dobu
2,5 hodiny.
8. Po inkubaci pomocí dispenzorů v luminometru Luminoskan Ascent (Thermo) přidáme 96l
1mM roztoku luciferinu.
9. Změříme ihned luminiscenci ­ vzorek je stálý pouze okolo 5 až 10-ti minut.
4. VÝSLEDKY:
Naměřené hodnoty jsou v relativních luminiscenčních jednotkách (RLU). Každý vzorek je
změřen v triplikátech (tři opakování). Ze získaných dat vytvoříme průměrné hodnoty
pro jednotlivé triplikáty, ze kterých vytvoříme nejdříve spojnicový graf, vypočteme
směrodatné odchylky a odstraníme případné výrazně odlišné hodnoty.
Potom od všech hodnot odečteme průměrnou hodnotu luminiscence, kterou dosahuje samotné
rozpouštědlo. Hodnoty RLU přepočítáme na procenta. Jako 0 % odpovědi bereme
rozpouštědlovou kontrolu, jako 100% koncentraci testosteronu, která dosáhla nejvyšší
indukce luminiscence.
Pro výpočet EC 50 zlogaritmujeme hodnoty koncentrace a vytvoříme bodový graf
(osa x ­ koncentrace, osa y - % odpovědi). Body v lineární oblasti proložíme regresní
přímkou a pomocí rovnice regrese vypočteme hodnotu logaritmu koncentrace a následným
odlogaritmováním získáme hodnotu EC 50.
V případě pozitivní odpovědi vzorku vypočítáme kolik ng testosteronu způsobilo ekvivalentní
odpověď vzorku - vypočítáme v jaké koncentraci vzorek způsobuje stejnou odpověď jako
50% (případně 25%) odpověď testosteronu. Po té vyhodnotíme množství androgenního
ekvivalentu na 1 l vzorku, takže výsledný androgenní potenciál vzorku vyjádříme
v jednotkách AEQ ng /l.
5. POUŽITÁ LITERATURA:
Leskinen P., Virta M., Karp M. (2003): One-step measurement of firefly luciferase activity in
yeast, Yeast 2003, 20:1109-1113
Návod ke cvičení z ekotoxikologických biotestů od Martina Benížka
Protokol
Protokol by měl obsahovat:
1) Stručný popis principu metody
2) Použitý materiál a chemikálie
3) Postup: Vypsat co přesně jste dělali, jaké aminokyseliny se přidávaly do média, do agaru,
jaké vzorky v jakých koncentracích byly testovány, jaká látka byla použita pro kalibraci atd.
4) Vyhodnocení výsledků ­ vytvoření spojnicového grafu, který obsahuje také směrodatné
odchylky. Výpočet hodnoty EC 50, výpočet androgenního potenciálu vzorku.
5) Závěr