EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY 2009 - RECETOX Zkouška inhibice pohyblivosti Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) Zkouška akutní toxicity zpracováno podle ČSN ISO 6341 Metoda stanovení akutní toxicity chemických látek, průmyslových odpadních vod a povrchových nebo podzemních vod pro Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) Princip Zkouška je založena na určení koncentrace látky, která za 24 (48) hodin imobilizuje 50% jedinců Daphnia magna vystavených podmínkám testu. Samičky Daphnia magna mladší 24 hodin jsou po dobu 24 (48) hodin vystaveny působení zkoušeného vzorku, který je v koncentračním rozsahu přidán do ředící vody. Médium (= ředící voda) * Zásobní roztoky: 8,88g CaCl2 se rozpustí v 1l destilované vody 4,93 g MgSO4 se rozpustí v 1l destilované vody 2,59g NaHCO3 se rozpustí v 1l destilované vody 0,23g KCl se rozpustí v 1l destilované vody * na 1 l média se dávkuje 25 ml z každého zásobního roztoku, do odměrné baňky 1l se nalije část destilované vody, přidají se zásobní roztoky a doplní se destilovaná voda * aerací se roztok nasytí kyslíkem (koncentrace kyslíku by měla být nad 7 mg/l) a zkontroluje se pH (7,80,2) Podmínky testu * teplota: 20 2 C * délka expozice 24hod (48 hod.) * tma nebo fotoperioda 16h světla/8 h tmy Příprava vzorku Zásobní roztok zkoušené látky se připraví ve skleněné nádobě rozpuštěním známého množství látky v určeném objemu ředící, demineralizované nebo destilované vody. Zásobní roztoky, které jsou těžko rozpustné ve vodě, mohou být přímo v médiu rozpuštěny nebo dispergovány mikrovlnou disperzí nebo mícháním s rozpouštědlem či disperganty s nízkou toxicitou pro D. magnaI (např. DMSO). Jestliže se používá rozpouštědlo, musí být jeho koncentrace v zásobním roztoku taková, aby nejvyšší koncentrace ve zkoušeném roztoku nepřesahovala 0,1 ml/l. Pokud jsou zásobní roztoky připraveny v demineralizované vodě, přidá se do každého litru ředící vody nejvýše 10 ml zásobního roztoku. EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY 2009 - RECETOX Postup testu * příprava média podle návodu, připravené médium se provzdušňuje nejlépe přes noc * gravidní samice se den před plánovaným testem přenesou do zvláštní nádoby a do 24 hodin se odloví nově narození jedinci. Ti se pak nechají cca 1 hodinu v čerstvém médiu * každý test musí obsahovat kontrolu neobsahující žádnou zkoušenou látku (pokud se testovaná látka rozpouští v rozpouštědle, zařazuje se i kontrola na rozpouštědlo) a nejméně pět zkoušených koncentrací, v každé koncentraci i kontrole nejméně 20 jedinců * mladí jedinci Daphnia magna se vnesou do zkušebních nádob tak, aby nebylo více než 5 jedinců na 10 ml, zkušební nádoby se umístí do inkubátoru či klimatizované místnosti * během zkoušky se organismy nekrmí * na konci zkušební doby 24h (48h) se spočítají mobilní jedinci v každé nádobě. Jedinci, kteří nebudou schopni se rozplavat za 15 s po mírném zamíchání roztoku, se považují za imobilizované, i kdyby dosud pohybovali tykadly * určí se koncentrační rozmezí způsobující 0% až 100% imobilizaci a zaznamenají se všechny anomálie v chování D.magna Ověření citlivosti: K ověření citlivosti Daphnia magna se pravidelně stanovuje 24h EC50 dichromanu draselného za použití ředící vody. Pokud je hodnota 24h-EC50 dichromanu draselného mimo rozsah 0,6 - 1,7 mg/l, ověří se přesnost provedení zkoušky, způsob chovu atd. Zkouška se považuje za platnou, pokud jsou splněny následující podmínky: * mortalita v kontrole na konci zkoušky je 10% * 24h- EC50 pro dichroman draselný je v rozsahu 0,6-1,7 mg/l Domácí úkol: Pro účely cvičení budeme používat standardní toxikant dichroman draselný. Koncentrace zásobního roztoku je 160 mg/l nebo 320 mg/l, testované koncentrace budou: 3,2 ­ 1,6 ­ 0,8 ­ 0,4 ­ 0,2 mg/l. Je potřeba připravit roztoky tak, aby se do celkového objemu 9,8 ml média přidávalo 200 l roztoku dichromanu a to u všech koncentrací stejně. Spočítejte, jaké koncentrace roztoků je třeba připravit a kolik, když budeme test provádět na desce s pěti jamkami o objemu 10 ml pro každou koncentraci.