Genové inženýrství (sylabus přednášky 2007) 1. Osnova přednášky, definice genového inženýrství a jeho stručná historie, studijní literatura 2. Mutageneze in vitro (metody založené na restrikčních místech, metody založené na mutagenních oligonukleotidech, kazetová mutageneze, využití modifikovaných tRNA) 3. Optimalizace exprese klonovaných genů (faktory ovlivňující expresi genů v cizích hostitelích; úroveň transkripce, translace, export proteinů) 4. Klonování genů v grampozitivních bakteriích 5. Klonování genů v kvasinkách 6. Klonování genů v rostlinách 7. Klonování genů v živočišných buňkách, vektory pro přenos genů do savčích buněk, selekční markery pro vyhledání klonů obsahujících cizorodou DNA 8. Vnášení genů do zárodečných buněk myší, příprava transgenních savců 9. Cílená exprese cizorodých genů v buňkách a tkáních vyšších organismů 10. Opravy dědičných defektů u zvířat metodami genového inženýrství 11. Genová terapie u člověka - základní principy 12. Příprava farmakologicky významných látek v prokaryotických organismech. Využití metod rekombinantní DNA k přípravě vakcín a protilátek. Identifikace produktů rekombinatních genů. 13. Transgenní rostliny a živočichové - využití v praxi 14. Pravidla pro práci s transgenními organismy, zákon 153/2000 a 28/2004 Sb., rizika Gl Doporučená literatura • Old R.W., Primrose S.B., Principles of gene manipulation. An introduction to genetic engineering. Blackwell Science, 1995. 5. vydání. • Watson J.D. et al., Recombinant DNA, 2nd ed., W.H.Freeman, New York 1992. • Watson J.D. a kol. Rekombinantni DNA, krátký kurz. Academia Praha 1988. • Strachan T., Read A.P Human Molecular Genetics, 3. Vydání. Garland Science, London 2004. • Glick B.R., Pasternak J.J. Molecular Biotechnology, 3. vydání, ASM Press, Washington 2003. • Primrose S.B.,Twyman R.M. Principles of gene manipulation and genomics. Blackwell Publ., 2006, 7. vydání. Definice genového inženýrství Genové inženýrství se zabývá vytvářením pozměněných či nových genů nebo přípravou nových (nepřirozených) kombinací genů a jejich zaváděním do genomu organizmů s cílem rekonstruovat jejich genetickou výbavu a vytvářet tak geneticky modifikované (transgenní) organismy. Metodickým základem genového inženýrství jsou manipulace s DNA in vitro (klonování genů a jejich úpravy). Genové manipulace, moderní (molekulární) biotechnologie Využití genového inženýrství Ve výzkumu: studium struktury, funkce a exprese genů (genomů) Praktické (Moderní biotechnologie): 1. Příprava látek významných v lékařství, zemědělství a průmyslu • vnášení cizorodých genů do nepříbuzných organizmů a získávání produktů ve velkém množství - překonání reprodukčních barier 2. Příprava látek s novými vlastnostmi pozměňováním stávajících genů nebo vytvářením nových genů - enzymy protilátky vakcíny aj. 3. Pozměňování a zlepšování vlastností organizmů - vytváření geneticky modifikovaných n. transgenních organismů (GMO) • příprava mikroorganizmů pro biotechnologie, • zvyšování výnosů kulturních rostlin a užitkovosti hosp. zvířat (odolnost vůči chorobám, škůdcům nebo zevním vlivům, produkce cizích látek v tělech rostlin a zvířat) • genové terapie Předpoklady pro cílené genetické manipulace • Identifikovat geny a stanovit jejich funkce • Izolovat geny a cíleně je in vitro pozměňovat • Přenést vhodným způsobem upravené geny do původních nebo nepribuzných organismů a zajistit jejich expresi Etapy vzniku a vývoje genového inženýrství Poznání základních procesů přenosu genetické informace 1970 - izolace prvního restrikčního enzymu 1972 - příprava prvních rekombinantních molekul DNA in vitro 1973 - začátek klonování genů 1975 - Asilomarská konference 1977 - první rekombinované molekuly DNA nesoucí savčí geny 1977 - sekvencování DNA 1978 - příprava lidského inzulínu v bakteriích (od r. 1982 vyráběn komerčně) Genentech * mutageneze in vitro - proteinové inženýrství * příprava transgenních organismů (rostliny, živočichové) 1980 - genová terapie 1977 - klonování živočichů Mutageneze in vitro site-directed mutagenesis místně cílená (řízená) mutageneze lokalizovaná mutageneza reverzní genetika, genetika „naruby" klasická genetika DNA (genotyp) ' fenotyp reverzní genetika Mutageneze in vitro Mutace se vnášejí do vyizolovane DNA (= in vitro) Typy mutací: substituce, delece, inzerce Cíle: • Analýza vztahu mezi strukturou a funkcí NK • Objasnění funkce genů a regulačních oblastí • Cílené změny aminokyselin v proteinech • Příprava proteinů s novýma vlastnostmi (proteinové inženýrství) • Příprava transgenních organismů Nevýhody klasické mutageneze (chemické, fyzikálni, biologické mutageneze) 1. V organizmu může být zmutován kterýkoliv gen 2. Frekvence mutací v žádaném genu může být nízká 3. Žádaný fenotyp může být výsledkem mutací v různých genech 4. Rekombinační analýzou nelze zjistit, zda mutace v genu vznikla substitucí jedné báze, nebo delecí či inzercí DNA Mutageneza in vitro náhodná manipulace s restrikčními místy inzerce linkem chemická mutageneza inkorporace chybných baží vyhledávaní genu nebo funkčních oblastí na DNA cílená oligonukleotidová mutageneza (umístění mutace do konkrétního místa) syntéza genů (kazetová mutageneza) i záměny baží nebo kodonů cílené změny struktury proteinů Obecná strategie při mutagenezi in vitro Amp* ĎrJA«Firll*řrj.f -PlosmídDNA In vít« mutagenesis oooo oooo Miíloiíefí Trans forjn f. tolf Síleí! Amp" col&niei Cvta'e cil wlgrii« logeltier Gr-ew tfllony Isolo* plosmidCNA A mutant pfoimíd lidr.lc pfosmíd DNA 7« 3! fot foncťnm libroiy p!ustn1 štěpení rekombinantní DNA na různých místech Prepare plosmid DNA from each colony Introduce into E. coli Test for transposition Připojení EcoRI-linkerů (= vložení inzerce inaktivující zasažený gen) Selekce klonů se ztrátou transpoziční aktivity, např. vyhledání genu pro transponázu (oblasti, která je pro její funkci nezbytná) Inactive Chemická mutageneze bisulfitem HSráí fcoSl Plazmidová dsDNA CyiosirK NH, Urocil Příprava ssDNA f |f BiiuIJilB T I Uracil Připojení primem Proti U je začleněn A Odstranění poškozenéh o vektoru Cytoiíne Sifigle-sífandeíf DNA Vložení inzertů do nového vektoru Působení bisulfitem Mixture o-í modified plä-s-mids DNA polymeráza, dNTP, replikace Vyštěpení mutovaných inzertů (Hindlll-EcoRI) r Knihovna klonů obsahujících mutované inzerty Mutageneze pomocí mutagenních oligonukleotidů 1. Klonování sekvence (genu) do vhodného vektoru (M13, fágemid, fasmid), izolace jed n o řetězcové formy rekombinantní DNA 2. Příprava syntetického oligonukleotidů (mutagenního oligonukleotidů) nesoucího žádanou mutaci (jeho sekvence je komplementární ke klonované sekvenci vyjma místa, do něhož má být mutace vnesena) 3. Připojení (přihybridizování) mutagenního oligonukleotidů in vitro 4. Dosyntetizování druhého (komplementárního) řetězce DNA-polymerázou, spojení DNA-ligázou 5. Transformace buněk E. coli heteroduplexní molekulou DNA, selekce mutantních molekul (příp. selekce in vitro a transformace mutantními molekulami DNA) 6. Pomnožení mutantní molekuly DNA v E. coli, ověření mutace stanovením sekvence DNA Mutageneze pomocí mutagenních oligonukleotidu syntéza druhého řetězce DNA-polymerázou selekce klonů s mutací ^_ rekombinantní dsDNA (fragment DNA klonovaný ve vektoru) O příprava jednořetězcové formy rekombinantní molekuly DNA (rekombinantní ssDNA) cr •A mutagenní oligonukleotid obsahující mutaci hybridizační připojení mutagenního oligonukleotidu m přenos do buněk E.coli a jejich replikace i rodičovský fenotyp stanovení fenotypového projevu mutace Substituce delece inzerce Zvýšení výnosu mutant začlenením uracilu do tem plátové DNA Přenos do kmene E. coli ung-, příprava ssDNA In vitro Přenos do E. coli ung+, selekce AmpR Většina kolonií obsahuje mutantní plazmid Řetězec s mutací (bez U) se replikuje a-l DNA klonovaná do M13 vektoru ung- (uraciI-N-glyk©zidáza~) (rep-) duí- (dUTPáza-) - zvýšení koncentrace U Do templátové DNA je začleněn U Připojení mutagenního oligonukleotidu Replikace, ligace Řetězec standardního typu je degradován Ověření mutace stanovením sekvence DNA žádaná mutace Vyhledání mutantních klonů pomocí sondy NittotelMwe Mc ke o Mixture of sobni« containing irutanl gnd wiľd-type Dt-iiutuioü-NA X ŕcy film J PF Roďowfoe mutagenic Lobefed pust« ild-lyp*DNA AulOrodi-ogtophy Wash at higher leniperolvifl Píob« icíímins - feůvn J to (iníortf ONA Mufanti Wild-type ■niííing \ PSSMÍQIej I relate mu (sni DNA trom colony Master plate Mutageneze pomocí mutantních oligonukleotidů ampr pBR322 Afl III O Bgl II DNA- Polymeráza DNA-Ligáza ampr Afl III tetr Netransformuje 2. selekce pomocí RE; cílová sekvence = GEN TETR 1 Afl NNACPuPyGTNN Bgl II NNAGATCTNN Připojení dvou primerů 1. Mutantní deleční oligonukleotid 2. Selekční oligonukleotid Bgl II ampr Bgl II ampr Deletovaný plazmid Bgl II Transformace E. coli tets i Izolace DNA i Štěpení selekční RE Afl III tets Transformace výsev na AM P vyhledání klonů TETS ittr &£A/A ri>£*C£- - e^-Aj rrr* o K A/MAM T C TlJM yi 0 FČ/Pe>s£A/i' 2>iSO<* ŕ*//f££U w • /. MUTANT*// Í>CL£CÄ/f 0C/toAJVjt:L£or/J> 0W" POLYrtf&iZfii D HA - U*A*2A I TŘAMFúfyfA&e E.co/t í*ejt T%.4Mŕfo/}/l4c£ výfCi/ A/A AhP WHLSPAM/ '{LOMU rsTs Kazetová mutageneze M'fldlll PíoRI Cleave with Híndlll and fcoRI Remove srnou Fragment ľwo synthetic oligonucleotides. Wtlqí-lype DNA Híndlll Wild-type EtoRl DNA Transform f, co/ŕ All colonies conloin mutant ploimid Syntéza genů postupným spojováním kratších oligonukleotidů DNA sequence or amino oeid sequence Complementary - Synthetic oligonucleotides Heat ol 90" C Slowly cool to room temperature ^ \ Intermediates DNA ligase liolůl* doubfe-ifrandocJ DNA mplflculfl .-,--,.„-,. Transcriptional terminaler fi»RI SomHI Unique restriction sites tar cassette mutagenesis Express recombinant protein in f. coli Mutageneze pomocí kazet tvořených mutantními „doped" oligonukleotidy PNA íynftuíiíer A berfí C boule C bo»le r bohle /\ /\ /\/s JAA ATA CG reo 5fo5 C C „kontaminované" zásobní roztoky nukleotidů Wlid-lyfWMqww« GGT t A C A A A C T Mutant oliswiilfrsiidsi CGIfACAAACT íoU t tacaaac r '-í'GB" AlAAACT GGT TACAAAC T. JGO I T ACA( GGT ľ ACAA GGT I ACAAAC T ACT AC T\Wild-! A ■ T /öligen I. f T ' icleťřlide míuu» r Skríning napr. fágovým displayem -< Wilíľ-lyfK! pl«nrid5 fnullíple suWiluFJcpn; SoůuCrtC^QCJ^Wňjd Pin &m!dt cortai;:if,g a single' nyclwIiöE ífignge 346 klonu 224 wt 218-lXSUbit 104 -vice subs t. ^ T«t hr fundíon Mutageneze pomocí „doped" oligonukleotidů Oligonukleotid obsahující inosin pro zajištění párování s náhodnými kodony kodony pro různé aminokyseliny Oligonukleotid obsahující dva náhodné kodony Arg Glu lie T CGA GAA ATC ■-----------► CTT TAG Glu Met *** GAG ATG NNg CTC TAC III Glu Ala Val Ser Met GAA GCG GTT AGC ATG + CTT CGC CAA TC AGCT GTAC Xhol Sphl N = kterýkoliv ze 4 nukleotidů NTG/C = hydrofóbní aminokyseliny (fenylalanin, izoleucin, leucin, methionin a valin) Alternativní způsob nasyntetizování druhého nukleotidu = PCR Záměna helixu v represorovém proteinu mutagenezou in vitro (kazetová mutageneze) d24R expression Vettoí Wl repressor wííj-iyp* írogMent P2 2- spéci fit tiybriJ a htlix 3 GJ.U ÄGly Thr Kjpfll sile Připravená kazeta Záměna aminokyselin v doméně represoru zodpovědné za rozpoznání operátoru P22 ífcfel sile F^T AAT GT L-Tj&^-JilS. JSSL.ÍÁŠLSJS ÖÄA CGC GGG AAA AC > CATGG AGA TTJJTCAA'^GC Ť'aG AGC GTC C AG C TT GCO C t C TT f TGAJJT --' ŕj-Yŕ 1'- n- ■ ii m ExpíCM lij^)ri(3 43J/P22 p»of*iri VT? Hybrid <*pf«sor binds P22DNA P22 cpvigbŕ DNA Výhody PCR • jednoduché provedení • možnost vytváření různého typu mutací • není nutná následná selekce pro zvýšení proporce mutant • nezávislost na RE místech • není vždy nutné následné klonování mutovaného genu do vektoru (po PCR je možný přenos amplikonu do buněk transformací) Vytváření náhodných = „error-prone" PCR 5'------------------------------------y y------------------------------------5' I 3—5' 3'--------------------------------------5' 5'--------3' i Error prone PCR 5'-----k----------------------3' 3'-----*----------------------5' 5'--------------*-------------3' 3'--------------*-------------5' 5'----------------------------3' 3'----------------------------5' 5'---------í*------------------3' 3'---------*-------------------5' 5'------------------------*— 3' 3'------------------------*— 5' 5'-------------------*--------3' 3'-------------------*---------5' 5'----------K--------*--------3' 3'----------*--------*--------5' mutací • využívají se DNA-polymerázy bez korektorské funkce (např. Taq-polymeráza) • reakční podmínky PCR lze změnit tak, aby se počet chyb zvýšil a aby každý amplifikační produkt obsahoval jednu mutaci (např. zvýšení Mg++ nebo přidání Mn++, koncentrace reakčních složek atp) • nevýhoda: převaha určitého typu mutace (např. transice, zatímco transverze nevznikají) Využití PCR k vytváření mutací in vitro 5' 3' 5' Reakce Primer 2 5' 3' 3'^- u/\ Reakce 2 5' 3' -*- 3' 5' 5' 3' Primer 5' 3' 'I Vznik dvou PCR-produktů nesoucích mutaci jV 3' ^5< Nemůže dojít k prodloužení od 5'konců 3' s± 5' 5'-y-----3' Primer 3 1 Místo, do něhož má být vnesena mutace Primer 4 3'-----5'. 3' 5' Primery 2a3 = mutagenní primery 3' 5' Smíchání, denaturace a rehybridizace 3' Tzv. neproduktívni spojení 5'- klonování 5' 3' ----4-3' I 5' Prodloužení DNA-polymerázou a PCR-amplifikace pomocí primem 1 a 4 3' 5' Vnášení mutací pomocí PCR I mutagenesis i—7^ 'jtaíiofí Vložená sekvence (extenze primem na jeho 5'konci) changes insertions Deletovaná sekvence deletions M iiner segment deleted Náhrada části genu sekvencí z příbuzného genu Gen A analogie mutagenního oligonukleotidu Sekvence genu A Sekvence genu B /Stickyféeť Denature and hybridize Sticky feeť Polymerase plus ligase + original vector Část genu B je nahrazena částí genu A Konstrukce genu pro chimérickou protilátku Light chai íy2b igGv I\\ 7/fj Y2b heavy chain CH2 domain Y1CH2 domain Expression vector for Y-i heavy chain Make uraci containing single stranded DNA Does not activate •+■ complement Gene for heavy chain (Y2bis°tyPe) Sticky foot----- Polymerase chain reaction i "^\- PCR 4 400 bp ^ primers Antibody with chimeric heavy chain Activates complement Heat to denature strands lO Coexpress in mammalian cells with light chain Těžký řetězec typu g 2b zodpovídá za lyzu buněk závislou na komplementu Protilátka s těžkým řetězcem g 1 tuto lyzu nenavozuje. Která oblast g 2b za tuto vlastnost zodpovídá? Doména CH2 g 2b 1 Transform ung+ E. coli Isolate mutant DNA Doména CH2 odpovídá za aktivaci komplementu pro lyzu buněk Chimérický těžký řetězec Konstrukce genu pro chimérickou protilátku j Cf<2 dojato ■fp, hcflwy cJioirt y-, C i <2 dame i n E*pfsíiíon vector for Vi Iwövy chfliri Mokí uracfl-coniäŕniF^ y.nple-sirandrd DNŮ cornpľemeii AnlíboíV wJíK chimink téový ekůjn GO^pfrmenl' Sfiífy ťb* -*%•* '^1^%^'^^^r^T^f íJiů i.-, reaction *x hfemy eham [Ya iwlypg- PCR f/rirnprj -iOObp Hpgf lůdcrtOitife sfrfl[\nlj Těžký řetězec typu g 2b zodpovídá za lyzu buněk závislou na komplementu Protilátka s těžkým řetězcem g 1 tuto lyzu nenavozuje. Která oblast g 2b za tuto vlastnost zodpovídá? Doména CH2 g 2b Tronjíůrm uns* f- fof IhiÍq[& mutcinf DNA [flcrnmaiůn «lis wiiři Jighf eh&in Doména CH2 odpovídá za aktivaci komplementu pro lyzu buněk Chimérický těžký řetězec Vytváření mutací in vitro přímo E. coli dam+ Smíchání plazmidu s primery nesoucími mutaci, syntéza komplementárních řetězců Štěpení i Dpnl ▼ \\ i (( Přenos do E. coli na plazmidech (QuickChange) • jako templát je využita dsDNA plazmidu • po proběhnutí PCR se vytvoří dva komplementární řetězce nesoucí mutaci ve stejném místě, které jsou schopny se párovat za vzniku kružnice s posunutými zlomy • po proběhnutí PCR jsou produkty štěpeny Dpnl, která je schopná štěpit jen metylovanou DNA • rodičovské molekuly DNA jsou metylovany, neboť plazmidy byly izolovány z dam+ kmenů E. coli - proto jsou Dpnl rozštěpeny (odstranění rodičovského templátu bez mutace). • nově syntetizované molekuly nejsou metylovany a tudíž nejsou štěpeny • po transformaci do E. coli dojde k reparaci zlomů a nově nasyntetizované plazmidy obsahující mutaci se replikují Inzerce abnormálních aminokyselin do proteinu supresí amber mutace in vitro s využitím chemicky modifikovaných tRNA Mutagenesis ---------------------------> Vytvoření amber kodonu Transkripce in vitro Translace in vitro Supresorová tRNA s navázanou chemicky modifikovanou aminokyselinou Mutantní forma proteinu (lysozym aktivovaný světlem) Table 4.4 Nonsense Suppressors Employed to Generate Altered Proteins Suppressor Codons recognized Amino acid inserted Efficiency (%) References A. Natural Sul {supDi UAG Serine 6-54 a, b SU2 {supE\ UAG Glutamine 0.3-20 ar b Su2-39 isupP\ UAG Leucine 30-100 a, e Sua UGA Tryptophan 0,1-30 'M B. Synthetic tRN'A^A UAG Phenylalanine 48-100 é mm$$ UAG SS^, Glutamic acid 15% Glutamine S-100 h, i «ÍÍÄÍ& UAG Cysteine 17-51 s tRNA^fŕ UAG HiStldine ie-joo hr i «?*ař UAG ProHne 9-60 h, i lRNAc\i UAG Lysine 9-29 h, L IRNA^ UAG Alanine S-S3 h, i iRNAcu^ UAG Glycine 30-67 h,i FTÖKIZG UAG Arginine 4-2S 4-47" i h Příklad: 160 variant genu pro lysozym s amber mutacemi na různých místech poskytlo v supresorových kmenech 2 000 variant lysozymu