Výhody a nevýhody klonování v E. coli • detailně prostudovaný druh • snadný přenos DNA • vysoká účinnost transformace • k dispozici jsou R" mutanty • existuje řada expresních vektorů, s regulovatelnými promotory = řadu cizorodých proteinů nevytváří ve funkční podobě = postrádá vedlejší metabolické dráhy = neexkretuje proteiny = nepatří k tradičním průmyslovým mikroorganismům Poznatky z klonování v G- (jiných než E.coli) a G+ bakteriích • nedostatek vhodných vektorů • nízká účinnost přenosu DNA do buněk • negativní vliv RM-systémů • nízká exprese klonovaných genů i selekčních markerů • nízký počet kopií vektorů, jejich nestabilita Vhodnejšou vektory se širokým spektrem hostitelů: transpozony • stabilní začlenění do chromozomu • nezatěžují hostitele extrachromozomovou DNA (průmyslové kmeny) Využití transpozonu jako vektoru s širokým rozmezím hostitele ©plazmid se širokým rozmezím hostitele ! TcR Bez selekce na TcR j e plazmid nestabilní Derivát Tn7 (TpR, SmR) - Tn Deriváty Tn7 • gen lacZ spojen s různými vektory (deriváty pUC - vysoký počet kopií) • vnesení do buněk na sebevražedných vektorech (využití inkompatibility) Pomocný plazmid = Zdroj transponazy Stabilní začlenění do chromozomu, následné vnášení nových genů do genu trpE T Produkční kmeny Micrococcus, Pseudomonas Výhody klonování genův Bacillus sp. • produkují velká kvanta extracelulárních enzymů, které lze snadno izolovat z media • lze je snadno kultivovat a adaptovat na řadu podmínek kultivace • lze připravit celou řadu mutant, hyperprodukujících enzymy a jiné látky • jsou nepatogenní pro vyšší organismy • jsou modelem diferenciace prokaryotických buněk Příklady látek připravovaných v druzích r. Bacillus B. amyloliquefaciens - 90% průmyslově vyráběných enzymů • alfa-amyláza, celuláza • dextranáza, maltáza, pektátlyáza • esteráza, alkalická fosfatáza • proteázy (subtilizin) • lysozym ô-toxin • pektináza Cizorodé látky • interferon (myší, lidský) • proinzulin Možnosti přenosu DNA do B. subtilis 1. Transformace kompetentních buněk 2. Transformace plazmidovým vektorem nesoucím homologní sekvence („plasmid rescue") 3. Transformace protoplastů Transformace kompetentních buněk B. subtilis plazmidovou DNA (CCC forma) A. Monomerní heterologní plazmidová DNA B. Oligomerní plazmidová DNA C. Monomerní plazmidová DNA s částečnou homologií k chromozómové DNA B. subtilis. Oblasti homologie jsou znázorněny tučně. Table 12.2 Comparison of the different methods of transforming B. subtilis System Elticioncy (transformants/fig DNA) Advantages Disadvantages Competent Unfractionated plasmid 2 x 10"1 Competent cells readily prepared. cells Linear 0 Transformants can be selected CCC monomer A x 10" readily on any medium. Recipient CCC dimer Sx 103 can be Roc CCC mu,tihier 2.6 x IG*5 Plasmid Unfractionated plasmid 2 x 106 Oligomers not required. rescue Can transform with linear DNA. Transformants can be selected on any medium Requires plasmid oligomers or internally duplicated plasmids which makes shotgun experiments difficult unless high DNA concentrations and hiqh vertc/donor DNA ratios are user*. Not possible to use phosphataso-treatcd vector Transformants contain resident plasmid and incoming plasmid and these have to be separated by segregation or retransformation. Recipient must be Rec' Protoplasts Unfractionated plasmid 3.8 x 106 Most efficient system. Efficiency lower with molecule? which have been Linear 2 x 104 Gives up to 80% transformants. cut and re-ligated. Efficiency also very size- CCC monomer 3 x 10fi Does not require competent cells. dependent, and declines steeply as size increases CCC dimer 2 x 106 Can transform with linear ONA and - - CCCmultimer 2 x 10fi can use phosphatase-treated vector Hlavní výhoda: účinný přenos monomerních plazmidových molekul, nezávislý na rekombinaci - DNA je přijímána jako dsDNA Plazmidy r. Bacillus: • kryptické • značně veliké, nevhodné pro konstrukci vektorů • chybí vhodné selekční markery Plazmidy S.aureus vhdoné pro transformaci B. subtilis Plasmid Fenotyp hostitelské buňky Velikost pC194 Chloramphenicol-Resistenz 1,8.106 Počet kopií 20-50 pE194 Erythromycin-Resistenz 2,3.106 pSA0501 Streptomycin-Resistenz 2,7.106 pUB110 Kanamycin-Resistenz 3,0.106 pT127 Tetracyclin-Resistenz 2,9.106 Izolace plazmidových mutant se zvýšeným počtem kopií (800-1000) Konstrukce pendlujících vektorů pHV14 a pHV15 fcoRI ■ Hind m Hind m E. coli Hind HI -Verdau transformace E. coli, selekce CmR (ApR, TetS) S. aureus ori pC194 v E. coli ApR, CmR v B. subtilis CmR, ApS Rozdíly v expresi markerů -transkripční a translační úroveň Hind m Chimérické pendlující vektory pro klonování v B. subtil is Hpal Hind III PsU CAT - B. pumilus f Hii 3BR322 Hpall EcoRI HindIII Hind III Hpal Hind III Hind lil Table 12.4 B. subtilis- E. coli shuttle plasmids Replicon Markers Size Plasmid (kbp) E. coli B. subtilis E. coli B. subtilis Comments pHV14 pHV15 pHV33 pEB10 pLB5' pHP3 4.6 pBR322 pC194 Ap.Cm 4.6 pBR322 pC194 4.6 pBR322 pC194 8.9 pBR322 pUB110 5.8 pBR322 pUB110 Ap.Cm Ap.Tc.Cm 4.8 pBR322 pTA1060 Em.Cm Cm Cm Cm Ap.Km Km Ap,Cm,Km Cm,Km Em.Cm pHP3Ff 5.3 pBR322 pTA1060 Em.Cm Em.Cm pGPA14 5.8 pBR322 pTA1060 Em Em pGPBU 5.7 pBR322 pTA1060 Em Em pHP13 4.9 pBR322 pTA1060 Em.Cm Em.Crn PHV1431 10.9 pBR322 pAMßl ApJc.Cm Cm pHV1432 8.8 pBR322 pAMßl Ap.Tc.Cm Cm pHV1436 8.2 pBR322 pTB19 Ap.Tc.Cm Cm pBR322/pC194 fusion. Sites: Psl\, BamH\, Sail, Nco\ (Ehrlich 1978) pHV14, reversed orientation of pC194 relative to pBR322 Revertant of pHV14 (Primrose & Ehrlich 1981) pBR322/pUB110 fusion (Bron et al. 1988) Deletion of pBR322/pUB110 fusion, Cm* gene of pCl94 Segregationally unstable (Bron & Luxen 1985). Sites: ßamHI, EcoRI, Bql\\\ (in KmR gene), Ncol (in Cirř gene) Segregationally stable pTA1060 replicon (Peeters etat. 1988). Copy number, ca. 5. Sites: Afcol (Cm* gene), Bcl\ and Hpa\ (both Em* gene) Like pHP3; phage f1 replication origin and packaging signal Stable pTA1060 replicon. Copy number, ca. 5. a-Amylase-based selection vector for protein export functions (Smith ef a/. 1987), MCSof M13mp11 in lacZa As pGPA14, probe gene TEM-ß-lactamase Stable pTA1060 replicon. Copy number, ca. 5. Efficient (shotgun) cloning vector (Haima et al. 1987). MCS of M13mp9 in lacZa LacZu not expressed in B. subtilis. Additional sites: Bcl\ and Hpa\ (both EmH gene) Efficient cloning vector based on segregationally stable pAMßl (Janniěre eí al. 1990). Copy number, ca. 200. Sites: BamHI, Sa/I, Psrl, Wcol. Structurally unstable in E. coli pHV143l lacking stability fragment orfH. Structurally stable in £ coli Low-copy-number cloning vector (Janniěre et al. 1990) Structurally stable Problémy: 1. Nestabilita plazmidů (segregační a strukturní) 2. Restrikce exogénni DNA Struktura vektoru pro přímou selekci v B. subtilis Promoter (Gram +ve) on 322 MCS Translační fúze CAT z B. pumilis a lacZ z E. coli Rep pTA1060 Selekce = CmR, EryR Recipient: B. subtilis 6GM15 - obsahuje lacZD15 napojený na G+, promotor + iniciační signály pro iniciaci translace Faktory ovlivňující expresi klonovaných genů v B. subtilis • transkripce: značný počet sigma-faktorů rozpoznávajících různé promotory • translace: • vyšší stupeň konzervovanosti oblastí mRNA vázající se na ribozomy, • odlišnost iniciačního kodonu (UUG n. GUG namísto AUG, aj), • odlišné ribozomové proteiny zajišťující vazbu mRNA (nastavení SD- AUG na 30S) • odlišné využívání kodonu • transport: signální sekvence (stejná funkce jako u E. coli) Degradace proteinů vlivem silné proteolytické aktivity • nutnost používat indukovatelné promotory: CAT • snížení rozkladu přípravou proteáza-deficientních mutant (odstranění 6 exoproteáz: prodloužení poločasu rozpadu z 1,5 na 85 hodin) Lokalizace proteinu u G+ a G- bakterií a) Gram-positive cell envelope Exported proteins G+ —i------r~ i------ —r I i r —r _L _iT_Lr ^^ £- -f .-Y—1 1, 1 _L 1 ! 1 , [ 1 1 r-1- A 1 t i 1 1 T r 1 1 1 1 1 i li i I ii i - i i Membrane proteins Cytoplasmic proteins synthesis T——T -peptidoglycan-amí accessory polymers Cytoplasmic menjbrane Cytoplasm b) Gram-negative cell envelope Exported proteins G- Outer membrane proteins Lipoprotein/ Periplasmic proteins =S2jz^^ t r z Inner membrane proteins Cytoplasmic proteins T~ 7 Outer membrane Periplasmic space __ peptidoglycan Cytoplasmic (inner) ___ membrane Protein synthesis Cytoplasm Exprese cizorodých genů v B. subtilis s využitím sekrečního vektoru SS = signální sekvence alfa-amyláza z S. amyloliquefaciens p RBS SS Foreign gene sequence Vector sequence I Transcription Translation N- Signal peptidase Secretion cleavage I Exported foreign polypeptide Signální sekvence u Bacillus jsou delší než u G- bakterií a eukaryot Konstrukce plazmidového vektoru pro sekreci interferonu Signální sekvence alfa-amylázy včetně promotoru Zkrácení kódující oblasti alfa-amylázy Bgl II Místo štěpení Pre-a Kódující oblast 31 aa Odštěpení signální sekvence alfa-amylázy probíhá přesně za 31 aa Plazmid nesoucí gen pro zralý I FN a2 Nekódující sekvence Kódující sekvence [a)pKTH53 (b)pKTH51 g!y fhr ---GGCACGCA-AGCTTGC -CCGTGCGTTCGÄIaCG . HinďlII ser sla ---tcagccgca;ag_cttgc ---agtcggcgttčgäacg cys asp acaíagcttgtgat-tgttcgäIacacta- HinďlII ---ACATCAGCC ---TGT'AGTCGG GCAAGCT TGT CGTTCGA ACA cys.asp leu pro GAT CTG CCT-CTA GAC GGA- pKTH93a a-Amyíase« Hind III r1 -ACATCAGCCGTA AATGGC AC -TGT AGT CGG CAT TTA CCG TG fhr ser ala val asn gly thr/gln ate/cys asp leu pro GCAAGCTTGTlGAT CTG CCT -C GTT CGA ACA CTA GAC GGA - Hind III S1nuclease ONA tigase a-Amylas e v Interferon -3 -1 .1 rhr ser ala/a/s/cys asp leu pro ---ACATCAGCC ---TGT AGT CGG Optimalizace spojení kódujících sekvencí pKTH68 GCATGT CGTACA pKTH93 GAT CTG CCT--CTA GAC GGA -- Vnášení heterologních plazmidů do B. subtilis s využitím „lešení" („scaffolding") 1. Plasmid První recipient Oblasti Homologie Plazmid obsahuje úsek homologní s chromozomem recipientní buňky Chromosom i Rekombination Začlenění plazmidů do chromozomu za vzniku „lešení" Plazmid typu pBR322 s nakloňovaným genem I Druhý recipient 2. Plasmid Oblasti Homologie * Rekombination KmR Amplifikace KmR I 1. Vytvoření oblasti homologie pro začlenění klonovacího vektoru 2. Klonování genu zájmu a jeho přenos do recipienta 3. Možná amplifikace začleněného genu 30 kopií KmR Vytváření delecí v chromozomu B. subtilis Vektor, který se v B. subtilis nereplikuje \är Vzájemně nesousedící oblasti *7 chromozómové DNA B. subtilis m^ms ^liDI delece Náhodná linearizace DNA během transformace Vyhledání homologních oblastí na chromozomu B. subtilis Plasmid Chromosom Začlenění reciprokou rekombinací -Tč^n-----------iBiBWMBaChromosom Selekce klonů Klonování sekvencí chromozomu sousedících s místy začlenění plazmidového vektoru Oblast homologie = část chromozómové DNA B. subtilis klonovaná v plazmidu Plazmid neobsahuje reštrikční místa Bglll Přenos chromozómových genů z B. subtilis do E. coli Izolace DNA, štěpení Bglll, Cirkularízace DNA-ligázou „vyprošťování genu i Přenos do E. coli, Selekce na ApR, Analýza chromozómových oblastí Klonování klastrů genů v CGCCNNNNjNGCCC CCGG^NNNNCCCG The Sft'I recognition sequence %. \ 1 Amplification % GGCCAACTCGGCC CCGGTTGAGCCGG GGCCACTTCGGCC CCGGTCAAGCCGG I SSí cleavage CGGCC TGAGCCCG GGCCACTT CCGGT . -\TCI1 oři Amp" požadovaném pořadí Rozpoznávací sekvence Sfil -vnitřní část (NNNN) je variabilní Amplifikace genu pomocí PCR s primery nesoucími v extenzích místa Sfil PCR produkt s extenzemi Sfil PCR produkt po štěpení Sfil Klonovací vektor Klonování klastrů genů v požadovaném pořadí - pokrač. Vzájemné spojení genů vybavených Sfil místy a jejich začlenění do vektoru Formation of multimers on ligation D E Circularizäflon of monomer after transformation f l * r Á" J \ v_ B. suótilis j Analýza genů s neznámou funkcí v B. subtilis pomoci vektoru pMUTIN Vektor pMUTIN vektor není schopen se replikovat v B. subtilis, což umožňuje provádět inzerční mutagenezu reportérovy gen lacZ usnadňuje sledovat expresi cílového genu promotor Pspac umožňuje navodit expresi genů nacházejících se v témže operonu jako cílový gen APR/ Pspac = PBS-pen + Olac Část genu s neznámou funkcí klonovaná ve vektoru Operon (geny orf 1-3) v chromozomu B.s. orf3 Reportérovy gen je orf2 je inzerčně exprimován inaktivován (vytvoří se transkripční fúze) exprese genu po směru transkripce odorf2 Klonování ve streptomycetách producenti antibiotik (60%) a extracelulárních proteinů (enzymy a inhibitory enzymů) přenos transformací do protoplastu (PEG) vektory odvozeny z plazmidů (SCP2) - charakter kyvadlových vektorů selekční markery - antibiotika (thiostrepton, viomycin, neomycin nebo metylenomyci) fágové vektory podobné lambda fágu (např. OC31) - přenos transformací do lyzogenu nebo má vektor sekvenci homologickou s chromozomem recipienta Přenos kompletní biosyntetické dráhy pro tvorbu antibiotik Klonování velkých úseků (40-100 kb) genomove DNA streptomycet ve vektorech BAC, pak přenos vektorů elektroporací do buněk streptomycet (nebo do protoplastu) a selekce klonů, v nichž se klonovaný úsek začlenil do chromozomu Princip mutačního klonování u streptomycet Promotor Kódující oblast Terminátor Gen X na chromozomu Vektory obsahující různé úseky genu X a > Inřact mRNA y Výsledek začlenění vektoru homologní rekombinací (1 x CO) -» intacr mRNA J Izolace genů pro tvorbu antibiotik Postup mutačního klonování pro izolaci genu 1. Klonování chromozómového genu X (antR) do fágového vektoru (konstrukce genové knihovny) 2. Infekce buněk původního kmene exprimujícího gen X (AntR), selekce transduktantu na rezistenci k viomycinu (gen vph nesený na fágovém vektoru).Výsledkem začlenení vektoru homologní rekombinací je duplikace homologní sekvence, která vede k jedné ze 3 možností: • Vektor nese promotor (I) nebo terminátor (III), funkce genu zůstává zachována • Vektor nese kódující oblast genu (II), inzercí vektoru dojde k jeho inzerční inaktivaci (mutaci) —► vyhledání klonů nesoucích mutací hledaného genu Klonování genů v archeích • extremofilní organismy (T, pH, konc. solí) • jedinečné fyziologické vlastnosti (např. striktně anaerobní a metanogenní) Přenos genů: • elektroporace, nízká účinnost • transformace zprostředkovaná PEG • transformace zprostředkovaná lipozomy Vektory: používány jako kyvadlové, některé se integrují do chromozomu (inz. inaktivace) • plazmidy • viry Selekční markery: rezistence k antibiotikům (puromycin, novobiocin, thiostreptin, mevinolin) Reportérové geny: ß-glukoronidaza, ß-galaktozidaza, trehaláza