Důvody pro klonování genů v eukaryotech A. Funkce charakteristické pro eukaryotické buňky, které se u baktérií nevyskytují: - lokalizace systému regeneruj ícího ATP v mitochondriích, - spojení DNA s histony - mitoza a meioza - diferenciace buněk B. Rozdíly v expresi genů - odlišnost regulačních sekvencí pro transkripci, translaci a export - specifické posttranslační modifikace Výhody kvasinek pro Gl • jednoduchá eukaryota s mikrobiálním charakterem, malý genom se známou sekvencí, řada mutant získaných a charakterizovaných klasickou i moderní genetikou • řada genů homologních vyšším eukaryotům, podobná buněčná biochemie a regulace genů • možnost stanovit dominanci a recesivitu alel (na haploidním pozadí) • vysoká frekvence homologní rekombinace - záměny genů • krátká generační doba a vysoký počet jedinců, kultivace na definovaných půdách a též ve velkokapacitních bioreaktorech • tradiční dobře definovaný a bezpečný biotechnologický organismus, možnost přípravy farmak pro humánní medicínu • eukaryotické proteiny vytváří v aktivní podobě, lze dosáhnout sekrece do prostředí Životní cyklus kvasinek Zygotic diplophase (Q a/a cjT^ Meiosis an Conjugation OO an _, Haploid ao oaspore5. Oa ©*CQ Haplophases ©•o tetrádová analýza Dva typy haploidních buněk: a a g Heterotalické kmeny - stabilní Homotalické kmeny - nestabilní, haploidní buňky spontánně revertují na opačný buněčný typ Molekulární struktura kvasinkového 2\x plazmidu "■■íi: -.:■ '''■*;..;&■., v: :::^. :,.::. ._■ vf:n (a) Hpal Eco Izomerní formy plazmidu Eco Ěco Eco FLP m Eca3l (G) EcoRI Tcř 6,3 kb; 50-100 kopií REP - replikace FLP - rekombince STB - rozklad kointegrátu FRT site = FRT recombination target Flp recombinase = flippase Systém Flp/FRT - Cre/loxP Chimérické plazmidy vytvořené spojením plazmidu 2|i a pMB9 štěpených EcoRI, (dále pak vložení genu Ieu2 z kvasinkového chromozomu do místa Pstl na plazmidu) Kyvadlové vektory pro klonování genů v kvasinkách Amp bakteriální počátek replikace transformace E. coli plazmidy se mohou přenášet z kvasinek do E. coli a naopak E. coii kvasinkový Ieu2 kvasinkový počátek replikace \ transformace V kvasinky leu~ kvasinková buňka Přenos do kvasinek: transformace protoplastu elektroporace Základní typy kvasinkových vektorů integrující ~ pBR322 Amp ura3 Replikující se velký počet kopií, stabilní AmpR cirkutární 2^-DNA ura3 Epizomální, malý počet kopií, nestabilní nesoucí centromeru (jediná kopie; stabilní) AmpR Amp ARS ura3 Možnost eliminace bakteriálních sekvencí jejich ohraničením FLP ARS CEN3 ura3 Umělý kvasinkový chromozom (YAC) CEN4 ARS2 TRPÍ AMPF EcoRI ARS2 EcoRI SUPA * Mos f cell don't grow Four-base /'"itklcy end" ■Amp1* \ Bacterial origin of replication Genová knihovna kvasinky Transform teu^^jolĹ Plate onto medium lacking leucine Cells contain plasmid with i£U2 gene LEU2 gene Functions in E coli Klonování kvasinkových genů na základě genetické komplementace Xts recipient: kmen nesoucí ts mutaci v genu X Q Leu Plasmid library Yeost transformation Příprava genové knihovny z kmene s genem X(wt) ve vektoru obsahujícím jako selekční marker LEU2 Plate onto medium lacking leucine Incubate at 30°C (permissive temperature) Only cells that contain a plasmid grow Incubate plate at 37°C (nonpermissive temperature) All cells grow Only cells that contain piasmid with wild-type gene X will grow at 37°C Isolate plasmid Determine DNA sequence of gene X izolace klonu X+ J Translate to obtain iDToteiji sequence encoded Začleňování genů homologní rekombinací Left half of URA3 / YFG / pUC / Right half of URA3 \ Cleave at jj^ site B m ^wŕ Cleave at « site A Left half Right half of YFG URA3 PUC of YFG I / / One chromosome contains YFG integrated at URA3 locus One chromosome contains URA3 gene intergrated at YFG Linearizace plazmidu v místě homologie zvyšuje frekvenci začlenění asi 100x Kvasinkový integrující s< ptazmid se nemůže replikovat v kvasinkách Ampn jra3 H/ndlll BamH\ integrace do chromozómu ura3 i Amp" štěpení H/ndlll; cirkularlzace Amp™ ura3 štěpeni SamHI: cirkularlzace ura3 AmpR H/ndlll SamHI plazmid obsahující standardní alelu H/ndlll SamHI plazmid obsahujíc! mutovanou alelu vyprošťovací vektor alela standardního genu ohraničená vhodnými RE-místy začlenění do chromozomu izolace DNA, štěpení RE a cirkularizace analýza mutace Vyprošťovací replikující se AmpR teu2 ARS I I M 1 [ plazmid obsa!iu]ící divokou aielu MAT Xhoí '• Xho\ AmpR leu2 ARS i i m r^r piazraid s mezerou IZI MAT- □ Xho\ I x/m1 mutovaná alela Linearizovaný plazmid se nereplikuje / chromozóm kvasinky Část genu mat je vyštěpena, hraniční sekvence jsou ponechány i vektor Amp" Ieu2 ARS plazmid nesoucí MAT se muže replikovat v kvasince MAT- transformace E. coli a vyhledání plazmldö nesoucích Inzert s MAT' Homologní rekombinace a cirkularizace plazmidů, jejich izolace a přenos do E. coli, studium mutantní alely MAT' Rekonstrukce plazmidu homologní rekombinací v kvasinkové buňce Vložení nového selekčního markeru do plazmidu, překlonování genu zájmu do jiného typu vektoru Plazmid, který se v kvasince nereplikuje společně přeneseny do kvasinky transformací Plazmid, který se v kvasince replikuje I Recombination Eco Selekce klonů na HIS3, případně na U R A3 Vytesnení a záměna plazmidů Plasmid shuffle Studium funkce mutantních a cizích genů Trojnásobný mutant TPK1-, TPK2-, TPK3- ura+, his+, trp+, ade-, leu- Myší cAMP dependentní PK Yea si cell 2|j. on ^ Mouse protein * kinase gene Transform intoyeast Plate to select for ■ Ade+, Leu+ transformants Medium lacking adenine and leucine All cells on plate contain both plasmids Culture a colony in complete medium (YPD) K Cells can lose one of the . .■„_-. _;:\ two plasmids Plate cells onto YPD medium Cells need at least one protein kinase gene to gro^ Replica plate Cells in colony contain only the plosmid with mouse protein kinase gene / Medium lacking Cells in colon; contain only me C plasmidwith TPKl f .adenine Cell contains only the plasmid with TPKi Colony Fails to grow Umožňuje růst na mediu bez adeninu Zajišťuje životaschopnost buňky Selekce buněk obsahujících oba plazmidy Kultivace buněk za neselektivních podmínek Buňka si musí alespoň jeden z plazmidů podržet Gen pro myší proteinkinázu může nahradit gen TPK1- Dvouhybridní systém ke studiu interakce proteinů (a) UAS Hybridní protein Gal4p-X se váže na promotor, ale není schopen aktivovat transkripci reportérového genu G (b) i f i ■ ■ i UAS G r Hybridní protein Gal4p-Y se není schopen vázat na promotor a tudíž není schopen aktivovat transkripci (c) ^—í—-L__[__ UASr. Interakce hybridních proteinů Gal4p-X::Gal4p-Y aktivuje transkripci Plazmidy určené k vytváření fúzních proteinu s aktivačními doménami Gal4p (DBD a AD) Silný konstitutivní promotor AMP Mnohokopiový plazmid -> ADH\ promoter GAU (1-147) ADhľl promoter GALA (768-881) URA3 i Produces Selekce plazmidu Vyhledání genu jejichž produkty interagují Gene segment encoding -ť i GAU pNA-binding domain SNF4-GAL4 hybrid gene LEU2 IBJ2 Transform into Leu" yeast Selecí Leu+ cells Colransform into Leu", His" yeast Select Leu+, His+ cells Replica plate onto medium containing X-ga' Colonies siain blue / UASG ß-Galactosidase SNFlandSNF4 Produced tightly associate GFP \ funkčně aktivní TF se vytvořil spojením proteinů SNF1 a SNF4 SNF1 aSNF4 asociují za vzniku produktu s protein-kinázovou aktivitou Genetický důkaz funkce U2 snRNA ja] Wild-type strain (strain A] U2 snRNA / / Wild-type U2 gene ® \ H/54gene / 'UÄGUÁ'lpSA-ŕ Wild- Wild-type U2 snRNA type intron Cells make their own histidine and grow his4 mRNA spliced Brl'-i (b) Mutant strain [strain B) Wild-type U 2 gene (c) Mutant strain (strain 8) Wild-type 112 gene Mufant . , hřs^í ™„» Plasmid with Mutation ***** 53 \ ŕií'sif gene / l-'ll-ii', ll:r ^UÄCllÄlí<ďA?ŕraŕ Mutant intron 111 I I I Wild-type U2 snRNA 1 / Mismatch destabilizes RNA hybrid Medium lacking Cells fail to grow histidine hiU mRNA not spliced (gene Introduce plasmid into cells by transformation __Jf I I ill I I mutant Ul gene LEU2 r O" @AWr Mutant intron Mutant U2 snRNA Selection for cells containing plasmid Mutant strain cart now make histidine hisd mRNA spliced Náhrada chromozómového pUCllS- uro3 mutant strain 0%^ I 9 ď Tranform lira- diploid A pair of homologous chromosomes Remove fragment URA3 Disrupted gene replaces wild-type gene in one chromosome Plate onto medium lacking uracil YFG F Other chromosome normal 1 Sporulate Dissect tetrads Characterize haploid cells genu (gene knockout) URA3 gene YFG = gen zájmu, jehož funkci sledujeme, inaktivovaný genem URA3 Tetrádová analýza: sporulací dochází k separaci mutantní a standardní alely Diploid cells Speculate Four haploid spore cells encased by ascus wall One chromosome contains integrated URA3 gene at YFG Enzymatic digestion of ascus waif Individual spores are loosely stuck together in tetrads Complete All colonies are Ura No growth Condusion^FC^sanessential gene Pokud je funkce genu YFG nutná pro přežití, spory nebudou schopny růst na plotnách bez uracilu, neboť gen URA3 je součástí pouze přerušených (inaktivovaných) genů. Potvrzení inzerce URA3 do YFG VACCINES Hepatitis B virus surface antigen Malaria circumsporozoite protein HIV-1 envelope protein DIAGNOSTICS Hepatitis C virus protein HIV-1 antigens HUMAN THERAPEUTIC AGENTS Epidermal growth factor Insulin I n sul in-í ike growth factor Platelet-derived growth factor Proinsulin Fibroblast growth factor Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor C&I antitrypsin Blood coagulation factor Xllla Hirudin Human growth factor Human serum albumin Figure 7.4 Recombinant proteins produced by S. cereviae expression systems. HIV-1, human immunodeficiency virus type 1. Kvasinka Pichia pastoris Má schopnost metabolizovat metanol jako jediný zdroj uhlíku a energie Metabolismus metylotrofu umožňuje vytvářet „single-cell" proteiny - krmivo pro dobytek bohaté na proteiny Heterologní exprese proteinů v metylotrofní kvasince - Pichia pastori s Další druhy: Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha 1. Jednoduché techniky pro genetickou manipulaci u Pichia, podobné jako u S. cerevisiae. 2. Kultivace za definovaných podmínek včetně velkokapacitní kultivace 3. Schopnost P. tvořit proteiny ve velkém množství, buď intra- nebo extracelularne (samy tvoří jen málo vlastních exkretovaných proteinů) 4. Schopnost provádět eukaryotické posttranslační modifikace (glykozylace, tvorba disulfidických můstků a proteolytický procesing). 5. Dostupnost tohoto systému pro komerční účely. Vektory pro expresi v Pichia a) jsou kyvadlové (+ E. coli) b) mají markery pro E. coli a pro kvasinky (ura, his, ade atd) c) mají expresní kazetu odvozenou z genu AOX 5'-promotorové sekvence terminátor transkripce mezi promotorem a terminátorem je MCS d) u sekrečních vektorů jsou signály z kyselé fosfatázy (PHO) nebo alfa-MAT Hostitelské kmeny: nesou auxotrofní mutace pro selekci vektorů jsou proteáza deficientní Expresní vektory často inzertovány do chromozomu Vektory s vícenásobnou kopií cizorodého genu a) kopie genu uspořádány „hlava k patě" b) vektor obsahující gen kanR - amplifikace pomocí G418 Metabolizmus metanolu Metanol induktor Alkoholoxidáza AOX1 aAOX2 Formaldehyd + peroxid H dehydrogenázy Formát + CO. energie Buněčné komponenty Po indukci metanolem je 5 % transkriptu tvořeno genem pro alkoholoxidázu, která dosahuje až 30 % všech proteinů v buňce V přítomnosti jiných substrátů (glukóza, glycerol, etanol) je hladina AOX nízká Expresní vektor R pas E. coli marker Expression vector Promoter rtoris P. pastoris marker 3'AOX1 alkoholoxidaza klonovaný gen Konstrukce vektorů s kopiemi expresní kazety Začlenění genu klonovaného v integračním vektoru do specifického místa chromozomu P. pastoris 1 xCO Integrační vektor 5' AOXl GOl TT mutace his4 HIS4 his4 GOl = gene of interest Chromosome 5' AOXl COI TT HIS4 2 x CO 5'AOXÍ AOXl 3' AOXl Reštrikční fragment vyčleněný z vektoru Chromosome 5' AOXl COI TT HIS4 3' AOXl ■ Chromosome Table 3: Heterologous protei Protein Bacteria Bacillus^ licheniformis a-amylass Bacillus siearothermophilus o-aäanine carboxypeptidase Bordetella pertussis pertussis pertactin (P69) Clostridium botulinum neurotoxin (BoNT) serotype A and B Clostridium botulinum neurotoxin heavy chain fragment, serotype B Clostridium botulinum neurotoxin serotype A binding domain Clostridium tetani tetanus toxin fragment C Escherichia coli acid phosphatase/phytase (appAi) Escherichia coli ß-galactosidase Escherichia coli ß-toetamase Leishmania major cathepsin B-!ifce protease Staphylococcus aureus slaphylokinase Streptococcus equishnilis Streptokinase Streptomyces subtiÜsin inhibitor Streptomyces firidosporus T7A peroxidase, endoglucanase Toxoplasma gondii SAG1 antigen Vibrio cholerae accessory cholera enterotoxin (Acc) Fungi Aheritaria Aft 1 allergen Aspergillus awamori glucoamylase Aspergillus awamori glucoamylase catalytic domain Aspergillus fumigatus catalase L Aspergillus fumigatus dipeptidyl peptidase IV (DPP IV) Aspergillus fumigatus dipeptidyl peptidase V (DPP V) Aspergillus giganteus a-sarcin ribotoxin Aspergillus iiiger phytase (phyA) Candida guillUrmondii xylose reductase gene (xyll) Candida rugosa lipase ľ {CR.L) Fusarium soltmi peetate lyase (pelC) Fusarium solemi peetate lyase (pelD) Geoirichum candidum lipase isoenzymes < ■ Phytophihora cryptogea |3-ctyptogein Rhizopus oryzae lipase Saccharomyces cere\isiae mvertase Saccharomyces cerevisiae Kit I p Soccharomycts ctrevisiae (a-1.2-mannosyltransferase) Schizophyllum convnune vitamin B2-aldehyde-forming enzyme Trametes versicolor (white rot fungus) laccase (led) Trichoderma harzianum 0-(l-6)-g!ucanase expressed in P. pastoris Comments: mode, amount, signal sequence s. s, I, I, I. I, 1. s, I, I s, s, I, s s, s, s, s, s, s, s, s, s, s, s, [, s, s, s, s, s, s, s. s, s, s, s, s, 2.5 g T1, SUC2 Í00 mg l~l, native 3gr' 78 mg ľ1 390 (ig g-1 2.4 mg total 12 g r1 28.9 U mg"1 2.0X10, U mg-1 a-MF 50 mg ľ"1, a-MF 77. mg r1. ■ . 2.47 g I-1 total protein, 12 mg I-1', a-MF 7 mg r1, a-MF a-MF Reference [51,60] [61] [62] [63] [6*1 [65] [66] [67] [71 [20] [68] [69] (70] [71] [73] [73) [74] I = intracelulární, S = sekretovaný native PHOl a-MF. 400 mg I".1, 400 mg r1, 2.3 g I"1, PHOl PHOl 0.15 mg ľ1, PHOl 1 mg-1-1, synthetic native, PHOl 65 Umľ1, a-MF 0.65 U mg-1; S, 0.1 S U mg"', a-MF 150 U ml-1. a-MF 1 mg I-1, PHOl native 60 mg r1, 45 mg r1 60 mg ľ 2.5 g r1 a-MF PHOl ', a-MF native 400 mg I-1; PHOl 40 mg l"1, PHOl 120 mg T', a-MF native and a-MF 9.3 mg r1 [751 [76] [47] ; [77] [78] [79] (43] [801 [SI] [42] [82] [83] [84] [85] [S6] [30] [S7] [87] [88] [89] [90] Table 3: Heterologous proteins expressed in P. pastoris Protein Protists Choiuirus crispus red aiga h.exose oxidase Cracilariopsls kmaneiformis red alga rjc-l,4-glucan lyase (GLql) Plasmodium falciparum merozoitc surface protein I (MSP-1) Plasmodium tfvůx apical membrane antigen I (AMA-1) Reticuhmyxa filosa (giant freshwater ameba) a.2, p2 tubulin isoforms Trypanosoma cruzi acid a-mannosidase Plants Allium sativum (garlic) alliin lyase Arabidopsis ihuliima NADHmitrale reductase Barley [Hordeum vulgäre) sucrose fructan 6-fructosyl transferase Barley cc-amylase 1 Barley a-nmyhse 2 Barky aleuroiie tissue a-glucosidase Coffee bean a-galactosidase Cynara conlunculus (cardoon) cyprosin Cyisodan duciyhn (Bermuda grass) Cyn d 1 Gahnthus nivalis agglutinin Hevea brasiliensis hydroxynitrile lyase Hevea brasiliensis Hcv b 7 pataíin-íike allergen Maize cytokinin oxidase Oat photochrome A, pfiA Oat phytochroinc A. phyA65 apoprotein Comments: mode, amount, signa] sequence -', a-MF -1, PHOl I I S, 24 mg S, 50 mg I, 400'ug'g-' S, 11.5 Jig I-1, native 1,2.167 U g"1 í, 13 ugg-< S, a-MF S, Í0 mg T1, native S, 1 mg I-1, native S, a-MF S, 400 mg r!, ct-MF S, 1 mg T', native S, 1.5 g r1, PHOl S, PHÄ-E 1.12 g r1 S, !0 mg r1, a-MF S, native I, 30 jig g"1 !, 20 ug g"1 Reference [91] [92) [931 [94J [95] [96] [97] [9S.99] 1100) [48] [43] [101] [102] [103] [104,105] [45] [106] [107.108] [109] [110,111] [112] I = intracelulární, S = sekretovaný • Účinnost translace je patrně primárně kontrolována rychlostí iniciace translace, která je ovlivňována 5'-netranslatovanou vedoucí sekvencí. Sekvence mRNA může ovlivňovat její strukturu, což následně ovlivňuje rychlost translace a stabilitu (poločas rozkladu) mRNA. • Množství proteinu antigénu viru hepatitity B za přítomnosti sekvencí na 5'a 3'konci představovalo 0,05% celkových rozpustných proteinů. Po deleci virových sekvencí na 5' konci se zvýšil výtěžek proteinu na 26%, zatímco delece sekvencí na 5'a 3'koncích zvýšilo výtěžek na 41%. Hladina mRNA přitom byla v obou případech stejná.