Heterologní expresní systém v oocytech Xenopus
Systém vhodný pro expresi genů z vyšších eukaryot ­ dochází k
posttranslačním úpravám a transportu, včetně exkrece
cDNA
vakciniový vektor
(T7-polymeráza +
plazmid (P-T7)
Proteiny lokalizované
v membráně
Strategie funkčního klonování v oocytech
Xenopus
Studium vývojových defektů pramenících z nadprodukce normálních
nebo změněných produktů genů
Extraction
Affinity chromatography
Microinjection
Poly(A)+RNA
Poly(A)+RNA
Size fractionation
Microinjection
Synthesis In vitro transcription
and capping
Assay for
functional
expression
Xenopus
oocyte
cDNA library
Tissue
Izolace klonu cDNA obsahujícího receptor
pro tachykinin
Substance K, neurokinin
mRNA připravená
z hovězího žaludku
mRNA
testování funkce
Knihovna cDNA
Paulmichl et al. 1992Cl- channel (Madin Darby canine kidney epithelial cell)
Frech et al. 1989K+ channel (rat brain)
Channels
Tate et al. 1992Na+-independent neutral amino acid transporter (rat
kidney)
Hediger et al. 1987Na+/glucose co-transporter (rabbit intestine)
Carriers
Honda et al. 1991Platelet-activating factor receptor (guinea-pig lung)
Hollmann et al. 1989Glutamate receptor (rat brain)
Masu et al. 1987Substance K receptor (bovine stomach)
Lubbert et al. 1987Serotonin 5-HTIC receptor (mouse choroid plexus)
Straub et al. 1990Thyrotropin-releasing hormone receptor (mouse pituitary)
Receptors
ReferenceProtein
Examples of cDNAs encoding plasma membrane proteins which have been cloned
by functional expression in Xenopus oocytes
Dysgeneze hybridů navozená transpozicí
P-elementů
Kmen P Kmen M
Vysoká frekvence mutací,
chromozomové aberace,
neschopnost tvorby gamet
P element 2,9 kb
31 bp
Časná embryogeneze u drosofily, přenos P elementů do zárodků
Vajíčko kmene M
PD
pBR322
Začlenění procesem
transpozice,
ne celý plazmid Přenos P-elementu
do potomstva
Linie obsahující P-element
v různých genech
Transpozice P-elementů,
dysgeneze
9 synchronous
nuclear divisions
Selekční markery
rosy+
adh ....etanol
neoR ...G418
Vektory odvozené z P-elementů
Více než 40 kb
Structure of helper P-element: p 25.7 wings clipped
Structure of P-element derivative: Carnegie
rosy = xanthine
dehydrogenase
Přenos genů do drosofily zprostředkovaný
P-elementy
Tn+
20-50%
ry+
ry+ plasmid
ry­ ry­ (M)
ry­ ry­ (M)rosy­ eyes
rosy+ eyes
Some
ry­ ry+
progeny
Pomocný plazmid
Embryo
Needle
0.5 mm
Adult
ry+ in some
germ line cells
reportéry (lacZ, GFP),
geny kódující toxiny mikrochirurgické
,,zákroky"
~ inzerční
mutaganeze
Změna
fenotypu
Využití P-elementů jako mutátorů
křížení
Potomstvo obsahující
mutátor integrovaný
v některém genu
Segregace chromozomů,
eliminace pomocného P-elementu
Kmen obsahující mutátor
(defektní P-element se
selekčním markerem)
Kmen s pomocným
P-elementem a aktivní
Tnázou (,,jumpstarter")
Linie se stabilně
integrovaným mutátorem
Studium exprese genů v tkáních
Vyhledávání zesilovačů
Plasmid rescue
Two hybrid system
Příprava transgenních savců
Možnosti přípravy geneticky modifikovaných myší
Gamety
ZygotaPrimordiální
zárodečné buňky
Transfekce
Náhrada jader
Transfekce
Retrovirový
přenosSomatické buňky
ES buňky
Přenos buněk
Blastocysta
(intracytoplasmic
sperm injection) GFP
Mikroinjekce DNA
Životní cyklus
myši; stadia
během nichž lze
vnášet geny
Vytváření transgenních myší mikroinjekcí
cizího genu do oplozeného vajíčka
DNA SV40, tkHSV,
lidský inzulin,
-globin,
interferon
Důkaz transgenu, např. PCR,
in situ hybridizací
Úspěšnost uchycení 10-30%
exprese
umlčení
Až 40% potomstva obsahuje
transgen začleněný
náhodně, obvykle
tandemově ve více kopiích
v jednom chromozomu
Manipulace s embryonálními kmenovými
buňkami
Vnesení genů
Transfekce, elektroporace,
retrovirová infekce
Terapeutické
klonování,
náhrada tkání
a orgánů
Vrstva
ibroblastů,
LIF
Příprava ES buněk s geny knokautovanými homologní rekombinací
AAMm
Dárkyně ES buněk
PNS vektor
(m)
AAMM
Vytvoření myši nesoucí knokautovaný gen
AAMm
aaMM
aaMM + AAMm
Dárkyně ES buněk
Dárkyně blastocyst
A = aguti, a = black, M = standardní gen, m = mutantní alela
Pokračování ­ vytvoření myši s knokautovaným genem
Stanovení genotypu analýzou DNA
Struktura rozpoznávací sekvence lox P fága P1
Podle orientace loxP sekvencí je úsek DNA mezi
nimi místně specifickou rekombinací prostřednictvím
Cre-rekombinázy buď deletován nebo invertován
:::::::::::::::::::::::::::::
Využití Cre-loxP rekombinačního systému
k selektivní inaktivaci genů
Gen A je ohraničen
sekvencemi loxP
Ve vybraných
buňkách nebo
tkáních je gen
A deletován
Cre-rekombináza
se tvoří specificky jen
v buňkách určitých
tkání
Cre-rekombináza pod kontrolou Tet-sytému = indukovatelnost
jiný vektor transientní
exprese
Inženýrství chromozomů s využitím
rekombinačního systému Cre-LoxP
translokace
Delece (MIKRODELECE)
Genová exprese regulovaná tetracyklinem
Systém tet-off tTA = tetracycline transactivator ­ hybridní protein
složený z tetracyklinového represoru (gen = červená)
a transkripčního aktivátoru (gen = modrá)
Dox = doxycyklin
Buněčně-specifický
promotor
Násobné sekvence tetracyklinového
operátoru + silný eukaryotický promotorSystém tet-on
Navázání tTA na promotor je nezbytné pro
aktivaci transkripce transgenu
rtTA = reverse tetracycline-controlled
transactivator systém ­ nukleotidová sekvence
tetracyklinového represoru obsahuje mutaci
zabraňující jeho vazbě na tetO; k vazbě dojde
po interakci s Dox.
Přidání Dox vypíná expresi transgenu
Přidání Dox zapíná expresi transgenu
Tetracyklinový systém regulace
Obě transkripční jednotky (tTA/rtTA + transgen) mohou být umístěny
na jeden vektor, což usnadňuje přípravu transgenních myší.
Využití:
* Sledování dopadu tvorby defektních proteinů
* Dopad nadprodukce určitého normálního proteinu (simulace
buněčně specifických poruch)
* Testování exprese genů u chorob, ovlivňujících jen určitý
buněčný typ
* Tvorba cre-rekombinázy
* Mutantní forma genu, jehož produkt vytváří spolu s produktem endogenu
nefunkční dimer (inaktivní komplex, např. receptor)
** Intrabody: protilátka vytvářená uvnitř buňky z transgenu ­ inaktivuje produkt
cílového genu
Aptamer: DNA/RNA oligonukleotid vázající se na cílový protein a inhibující jeho
aktivitu
Intramer: totéž jako aptamer, ale exprimovaný uvnitř buňky
siRNA (RNA interference)
miRNA
dsRNA (RNA interference)
Sense RNA (cosuppression)
Deoxyribozymes
Aptamers, intramers **Ribozymes or maxizymes
Antibodies, intrabodiesAntisense oligonucleotides
Dominant negatives *Antisense RNA
Interference at the protein levelInterference at the RNA level
Summary of methods for interfering with endogenous gene expression without
mutating the target gene
Mutantní forma genu, jehož
produkt vytváří spolu s
produktem endogenu
nefunkční dimer (inaktivní
komplex, např. receptor)
Intrabody: protilátka vytvářená uvnitř buňky
z transgenu ­ inaktivuje produkt cílového
genu
Aptamer: DNA n. RNA oligonukleotid
vázající se na cílový protein a inhibující jeho
aktivitu
Intramer: totéž jako aptamer, ale
exprimovaný uvnitř buňky
miRNA
Použití ribozymu typu ,,hammerhead"
ke štěpení mutantní mRNA
Úseky ribozymu komplementární
k sekvenci mRNA cílového genu
Mutantní
mRNA
ribozym
Využití transgenů k usmrcování specifických
buněčných typů (mikrochirurgické zásahy)
Gen kódující toxin (transgen) je začleněn za regulační oblast aktivní
v určité tkáně ­ exprese transgenu je tak cílena do buněk této tkáně
Toxiny: difterický toxin, T-antigen SV40, ricin (lektin)
Problém: exprese genu pro toxin v okamžiku aktivace endogenu
(např. v časné fázi vývoje) může být letální pro organismus
Alternativa: použití genu TK z HSV, který je zapojen za specifickou
E-P sekvenci. Buňky s tímto genem nejsou usmrceny, dokud nejsou
do organismu injikovány syntetické toxické nukleotidy ­ ty nejsou
toxické pro buňky, v nichž k expresi genu nedochází, protože v nich
není aktivována specifická E-P sekvence. V buňkách, v nichž je E-P
aktivní, dochází k expresi TK, která syntetické nukleotidy metabolizuje
na produkty, které zabíjejí dělící se buňky exprimující daný gen.
Cílená exprese genu ve specifické tkáni
Detekce
protilátkou
Konstitutivní
tvorba T-ag
Řídí tkáňově
specifickou expresi
klonovaného genu
do beta-buněk
pankreatu
Transgen se exprimuje jen
v pankreatu, kde navozuje
vznik nádorů. V ostatních
tkáních se neexprimuje.
Tkáňově specifická exprese transgenu
Akceptorové
místo sestřihu Začlenění reportérového
genu do intronu genu X
sestřiženo
v ES
Transgeny jako reportérové geny pro sledování exprese genů hostitele
1. Selekce ES buněk
obsahujících vnesený
konstrukt (G418),
2. Injekce ES buněk
do blastocyst,
3. Identifikace buněk
(tkání), kde dochází
k expresi lacZ,
4. Vyhledání genu X,
který řídí expresi lacZ
-galaktozidáza
Use electroporation to
introduce construct into ES
cells
Add G418 to select
neo-containing cells
Colonies of
surviving cells must
contain neo gene
Isolate colonies
Make a replica and
stain with X-gal
Inactive lacZ Active lacZ
Grow cell
lines
No activation Activation
during
development
Inactivation
during
development
Regulated
expression
Expression
throughout
embryo
Examine embryos
stained with X-gal
Inject cells
Clone gene containing integrated transgene
Využití reportérových genů k vyhledání genů
aktivních v určitých fázích vývoje
lacZ je aktivní v závislosti na místě začlenění
Sledování exprese genu
během vývoje embrya
Buněčná linie obsahující transgen (lacZ)
začleněný v konkrétním místě (genu)
Inzerční inaktivace genů vede
k pozměněným fenotypům,
izolace těchto genů
Analogicky lze využít retrovirových
vektorů s reportérovými geny ­ infekce
tkání vyvíjejícího se organismu
Příprava transgenních ptáků
germinální disk
Ozářené recipientní
embryo (čerstvě
nakladené vejce)
Transgen se stal
součástí zárodečných
buněk
Cíle transgenoze u drůbeže
Odolnost proti virovým a
bakteriálním chorobám, proti
kokcidióze
Nižší obsah tuku a cholesterolu ve
vejcích, vyšší kvalita masa
Příprava rekombinantních proteinů:
monoklonální protilátky, růstový
hormon, inzulin, HSA, interferon,
lysozym
Pluripotentní buňky (blastodermální
a primordiální) pěstované in vitro
ˇ Zvířata (myši, drůbež, hospodářská zvířata, ryby) obsahující gen pro
růstový hormon ­ rychlejší růst, změna vlastností produktů
* Přežvýkavci obsahující ve střevě GMO-mikroorganismy, které redukují
toxicitu některých rostlin (rozšíření potenciálu krmiv)
* Drůbež s pozměněnými trávicími schopnostmi (celulóza, lignin, tuky)
* Drůbež se zvýšeným obsahem lysozymu ve vejcích (využití v průmyslu
a farmakologii)
* Ovce s vylepšenou srstí
* Myši s pozměněnými nebo inaktivovanými geny
* studium lidských genetických poruch: neurodegerativní, imunitní,
hormonální choroby,
* vliv faktorů na organismus (např. léků, mutagenů)
* studium poruch paměti
* Zvířata jako dárci orgánů pro transplantace (xenotransplantáty) ­ orgány
s pozměněnými antigeními vlastnostmi vhodné pro člověka
* Zvířata produkující cizorodé látky v mléce, moči, krvi nebo tkáních
(animal farming: zvířata jako bioreaktory)
Příklady transgenních živočichů
Transgenní zvířata
* Transgenní prasata
* Prasata exprimující lidský hemoglobin ­ 15 % lidského hemoglobinu
* Náhražka krve pro transfůze, uchovávání orgánů pro transplantace
* Transgenní myši používané jako modely při studiu lidských chorob
* Např.: myši se změnou barvy srsti, abnormality v ledvinách, kostech,
s cukrovkou, osteopetrozou, změnou vývoje T-lymfocytů, změněnou
aktivitou interferonu, uspořádání genů pro imunoglobuliny,
osteoartritis, s receptory pro viry /HIV/ a řada jiných.
* Modifikace trávicích enzymů savců
* Příprava myší, které depolymerizují celulózu v tenkém střevě nepřežvykující
savci schopni trávit celulózu.
* Transgenní kmen myší, který roste bez stárnutí
* Gen pochází z kapra a kóduje protein tithonin.
* Perspektiva ­ zavedení genu do dobytka ­ příprava křehkého masa
Ovce, myš ­ knokaut prionového genu
Myši ­ knokaut genu pro myostatin (chybění myostatinu vede k růstu svalů) ­ belgický
modrý skot, jiná hospodářská zvířata
Transgenní zvířata
* Transgenní živočichové hypersenzitivní k mutagenům nebo karcinogenům
* testování toxicity látek vnějšího prostředí, farmak aj.
* Transgenní prasata s genem pro somatotropin
* stejná rychlost růstu, o 15 % účinnější konverze potravy
* zvířata mají méně tuku a netrpí poruchami
* Transgenní ovce exprimující gen kódující obalový protein visna viru
* vlastní retrovirová vakcína /retrovirus způsobující pneumonie, proti nimž
není možná vakcinace/. Zavedení cizího genu do ovcí vede k produkci
protilátek proti proteinu a tím ochraně vůči infekci.
* Transgenní ryby
* rezistentní k prostředí (salinita, kyselé deště)
* rezistentní vůči chorobám
* zvýšení přírustku ryb zavedením genu pro chimerický všeobecný
růstový hormon (losos ­ 13-ti násobné přírustky ve srovnání
s netransgenními rybami)
Přenos genů do ryb: do oplozeného vajíčka nebo do časného zárodku je mikroinjekcí do
cytoplazmy přenesena DNA (účinnost 10-30%), pak křížení transgenních ryb ­ ustavení
transgenních linií)
- Růstový hormon (all-fish n. all- salmon) pod kontrolou ,,antifreeze proteinu"
Zvířata jako živé továrny (,,animal farming")
koza ­ protein pavoučího vlákna v mléce, atp.
kráva ­ lysozym v mléce
Příklady látek vytvářených v transgenních zvířatech
Antikoagulans krveLidský protein Cprase
Léčba cystické fibrózyRegulátor CFTRovce, myš
Léčba nanismuLidský růstový hormonkoza
Náhražka krve při transfúzihemoglobinprase
Navození srážení krveFaktor pro srážení krve VIII, IXovce
Rozpouštění krevních
sraženin
Tkáňový aktivátor plazminogenukoza
Léčba rozedmy plicAlfa-1-antitrypsinovce
VyužitíLátkaZvíře
New genes introduced into farm animals to alter growth chatacteristics
Structural geneRegulatory elementSpecies
Polly
Klonování savců
Transgenní bakterie (Rhodococcus) produkující toxin
(cekropin) usmrcující trypanozomy ve střevě ploštic
Complementary
DNA encoding
cecropin A
Plasmid vector
Rhodococcus rhodinii Transformed R. rhodinii
Transformed R. rhodinii in
into hindgut od reduvii
T. cruzi
T. cruzi reduced
or eliminated
Hindgut od reduviid bug
Rhodnius prolixus
(reduviid bug)
Insects colonized
with transformed
R. rhodnii
Trypanosomes
destroyed
Cecropin A
produced
endogenous in
hindgut
Cekropiny ­ polypeptidy
s antibakteriálním
účinkem z hmyzu
Různé osudy DNA viru leukémie po přenosu do myši závislost
na čase a metodě přenosu
20-40 kopií
v jednom
chromozomu
Tkáňově
specifická
exprese
Virus působí
jako infekční
agens
Mozaikovitost,
1 kopie integrovaná
v různých místech
Analýza sexuální determinace ­ funkce genu sry
1. Lokalizace genu Tdy (Sry) na chromozomu
2. 2. Klonování genů z oblasti Tdy 14 kb fragment nesoucí
gen Sry (tj. jediná DNA
z chromozomu Y, která
je nyní ve vajíčku)
samičí
samčí
DNA zodpovědná za
aktivitu genu Sry (není
na chromozomu Y)
Gen Sry podmiňuje tvorbu samčích pohlavních orgánů
Injekce
analogů
nukleosidů
PGH = promotor genu pro GH
PP = promotor genu pro prolaktin
Zvířata s genem tk pod kontrolou PGH (1) PP (2)
V buňkách, v nichž je P aktivní,
dochází k expresi TK, která
analogy nukleotidů metabolizuje
na produkty, které zabíjejí dělící
se buňky exprimující daný gen.
Objasnění vývojových vztahů mezi buňkami
hypofýzy
Prekurzorová buňka
Buňky syntetizující
růstový hormon (GH)
Buňky syntetizující prolaktin
diferenciace
GH GH
tktk
PGH PP
Trpaslíci Normální růst
Závěry:
* Buňky syntetizující prolaktin
se nedělí (nejsou usmrcovány)
* Buňky syntetizující GH jsou
prekurzory buněk
syntetizujících prolaktin
1) 2)
exprese
exprese