Molekulární podstata nádorového bujení klíč k porozumění procesů v základech lidské rakoviny.
Nádor vzniká ze společné buňky, ve které byl - většinou desítky let
vznikem viditelného nádoru - zahájen program neregulovaného dělení.
Maligní transformace buňky probíhá přes akumulaci mutací ve specifických třídách genů.

1IIIIK«
prang
íiBTiK
vě třídy genů, které dohroma
Tfijnauvnmwm
ady tvoří jen malou část c
r •            r
alou část celé rocesu tvorfr
Q
Sftsj
ej^Bl
mální konfiguraci řídí životní cyklus buňky, tj. sled dějů, ~e buňka zvětšuje a dělí
PROTOONKOGENY jsou normální buněčné;
Hraií úlohu především v regulaci životního cvklu buněk:
►   Buněčného cyklu
►   Buněčné proliferace
►   Diferenciace
►   Apoptózy
V průběhu evoluce dobře konzervovány a jejich přítomnost v normálních buňkách všech vyšších organismů předpokládá, že mají základní význam v buněčné fyziologii.
Kódují proteiny, které hrají klíčovou na různých úrovních integrace mitogenních signálů nesených růst. faktory a hormony. Jsou-li modifikovány, ať na strukturální nebo kontrolní úrovni, začnou se chovat jako onkogeny a podporují vývoj nádoru.
ONKOGENY
mutované nebo aktivované protoonkogeny
Proces karcinogeneze zahrnuje změněné exprese nebo funkce protoonkogenů na různých stupních transdukce signálů.
NÁDOROVÉ SUPRESOROVE GENY (ANTIONKOGENY)
zabraňují abnormální buněčné proliferaci
glycoprotein complex I glycoprotein complex III
V posledních 30 letech byla objevena řada genů odpovědných za vývoj nádorů. Na porozumění maliení transformaci má zásluhu zeiména široká škála
BBívéjáích prací s
onKogennimi ví
Copyright 19<M - "97 Marko RescH*
První tzv. ONKOGEN s r c (sarcoma) byl izolován v roce 1970 z viru Rousova sarkomu u kuřat. Virus Rousova sarkomu má dvě rozdílné části: část kódující r odpovědné za replikaci viru a část kódující s r c gen umoňující vznik nádorů in vivo u kuřat. Normální kuřecí genom obsahuje příbuzný gen c-src. Později se ukázalo, že řada retrovirů je onkogenních. Bylo též prokázáno, že src není jednoznačně retrovirový gen, ale spíše téměř přesná kopie genu nalezeného
i je v retrovirů modifikován (aktivován)
Objev s onkogeny příbuzných sekvencí v eukaryotickém genomu stimuloval úsilí

r 1        r   -l           \/
r         \/ r         • r
WMRnjMirtjMffl
Mnoho protoonkogenů kóduje proteiny mající vztah k růstově stimulačním signálům přecházejících z vnějšího prostředí do nitra buňky.
Růst buňky je deregulovaný, jestliže mutace v protoonkogenů způsobící trvalou aktivaci růstově stimulační dráhy.
Toto souvisí se signály, které si navzájem předávají buňky v tkáních. Jedny buňky uvolňují růstové faktory, proteiny (glyko), které se pohybují mezi buňkami a po vazbě na vhodný receptor na povrchu jiných buněk vyvolávají kaskádu dějů, které přenáší tento signál přes cytoplasmu až do jádra.
V jádře pak proteiny nazývané transkripční faktory odpovídají tím, že aktivují řadu genů, které pomáhají buňce procházet buněčným cyklem. Podobně funguje i přenos růstově inhibičního signálu.
V normální buňce je rovnováha stimulačních a inhibičních signálů pečlivě regulována, protože to souvisí s regulací buněčného cyklu, který je rozhodující pro buněčnou proliferaci a diferenciaci.
V nádorové buňce je v důsledku změn v signálních drahách organizace buněčného cyklu narušena.
Buňka je vybavena také zpětnovazebnými mechanismy, které mohou působit proti neobvyklým změnám v procesu bun. dělení.
Apoptóza - schopnost buňky spáchat za určitých podmínek „sebevraždu", tj. jestliže její základní komponenty jsou porušeny nebo jestliže je její kontrolní systém deregulován. Tak působí např. poškození chromozomální DNA.
V tomto procesu se účastní také specifické geny např. p53 nebo bcl-2. Mutace těchto genů pak způsobují poruchy apoptózy. Bylo zjištěno, že neschopnost apoptózy přispívá ke vzniku nádorů a k jejich rezistenci k terapii.
Druhým obranným mechanismem proti neustálé proliferaci je vestavěný buněčný mechanismus, který sčítá a limituje celkový počet dělení buňky, buňka stárne a hyne. Molekulárním nástrojem tohoto sčítaní jsou segmenty DNA na koncích
chromosomů tzv. telomery. Ty se při každém dělení zkracují a když dosáhnou kritické délky dochází k stárnutí a krizi. Jestliže tento sčítací systém funguje v nádorové buňce řádně, její nadměrná proliferace je přerušena předtím, než je nádor příliš velký. Aktivací genu, který kóduje enzym telomerázu, který není v normálních buňkách, ale byl nalezen v nádorových buňkách, však dochází k obnově telomerických segmentů a to umožňuje buňce se nekonečně množit, tj. stát se nesmrtelnou.
-GGGTTAG
-GGGTTAGGGTTAG
I        ■        ■        ■       ■      <        h
AUCCCAAUC
-GGGTTAGGGTTAG
^AUCCCAAUC
Protoonkogeny lze dělit
^ Podle lokalizace jejich produktu na ty, které kódují
1)  sekreční proteiny
2)   proteiny buněčného povrchu
3)  cytoplasmatické proteiny
4)  jaderné proteiny
^  Podle funkce jejich produktů na
1)     růstové faktory (např. sis, hst),
2)     receptory pro růst. faktory (např. fms, kit, erb B),
3)     cytoplasmatické proteiny - protein kinázy (např. raf) a G-proteiny (např. ras),
4)    jaderné proteiny (např. myc, myb, fos, jun)
ijBiiwgMtfiiiiggin
(immediate early genes) a jejich produkty jsou proteiny vážící se na DNA a fungující jako tzv. transkripční faktory, které regulují transkripci pozdních genů. Jsou většinou aktivovány overexpresí, která může být indukována různými způsoby: translokací (Burkitt lymphoma), insercí retroviru (spíše v experimentálních systémech), amplifikace genů - to je obecný mechanismus aktivace jader, protoonkogenů a byla pozorována u řady nádorů.
RŮSTOVÉ FAKTORY
- EGF, TGFa, TGFß, IGF
G - PROTEIN
ras, rev —*
TYROSIN KINAZY /     src, abl
/
► PROTEIN / KINÁZAC/
RECEPTORY PRO
RŮSTOVÉ FAKTOR
- EGF-R -NEU
- PDGF-R
JADERNE PROTOONKOGENY
myb myc
jun   '
GENY PRO ROŠTOVĚ FAKTORY
renos signálů a růstová regulace v eukaryotických buňkách. Jsou znázorněny reprezentativní protoonkogeneny v signálních dráhách.
ONKOGENY a ANTI-ONKOGENY
Externí
signály
1
T
Přenos
externích
signálů
Růstové faktory
mas
Transmembranove receptory
ras
rap
Tyrosinové kinázy
GTP-vazebne proteiny
Jaderné děje
Serme -treoninové kinázy
Rb
myc         ets
sis
fos   P53
myb    Jun
Replikace DNA
METABOLICKÁ ODPOVĚĎ
Onkogeny a anti-onkogeny: hlavní funkční skupiny onkogenních proteinů a jejich pravděpodobná vnitrobuněčná lokalizace. Anti-onkogeny jsou označeny větším písmem.
Mutace protoonkogenu vedoucí k transformaci můžeme funkčně rozdělit do dvou tříd:
získání funkce (gain-of-function), kde aktivita protoonkogenu vzrůstá a má za následek abnormální nebo nadměrmou růstovou stimulaci
ztráta funkce (loss-of-function), která vede k inaktivaci represorové složky, která normálně negativně ovlivňuje buněčnou proliferaci (nádorově supresorové geny - p53, RB, geny pro antiproliferační molekuly -TGF ß, TNFa, interferon y)
V obou případech je výsledkem nadměrná stimulace růstu.
Geny kritické pro vývoj nádorů spadají do dvou jasně rozlišitelných kategorií: dominantní a recesivní
1(A) overactivity mutation (gain of function)
single mutation event
creates oncogene
normal cell
activating mutation
enables oncogene to
stimulate cell
proliferation
cells that proliferate abnormally
|(B) underactivity mutation (loss of function)
second mutation event
Inormal cell
inactivates tumor
suppressor gene
mutation event
inactivates second gene
no effect of        coPV
mutation in one gene copy
two inactivating mutations
functionally eliminate the
tumor suppressor gene,
stimulating cell proliferation
Autokrinní signál
A SINGLE SIGNALING CELL
RECEIVES A WEAK AUTOCRINE
SIGNAL
IN A GROUP OF IDENTICAL SIGNALING
CELLS, EACH CELL RECEIVES A STRONG|
AUTOCRINE SIGNAL
Figure 15-6. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition.
Při buněčné transformaci a karcinogenezi se uplatňují autokrinní mechanismy (vznik autokrinní smyčky) - neplánovaná produkce růstových faktorů buňkami nesoucími odpovídající receptory nebo aberantní exprese receptoru.
Tři způsoby aktivace a změny protoonkogenu v onkogen
proto-oncogene
DELETION OR
POINT MUTATION
IN CODING
SEQUENCE
I
IDNA-RNA
hyperactive protein made in normal amounts
normal protein greatly overproduced
CHROMOSOME REARRANGEMENT
nearby
regulatory
DNA sequence
causes normal
protein to be
overproduced
fusion to actively
transcribed gene
greatly
overproduces
fusion protein;
or fusion
protein is
hyperactive
Šest způsobů ztráty zbývající dobré kopie nádorově supresorového genu
HEALTHY CELL WITH ONLY 1 NORMAL Ftb GENE COPY mutation at
no
Rb locus ~^_
in maternal chromosome
normal Rb gene in paternal chromosome
POSSIBLE WAYS OF ELIMINATING NORMAL Rb GENE
n
MR    MM   MM Mn MM
pH pH                pp pH             pH pH    pH h^    pH pp
nondisjunction   nondisjunction         mitotic               gene       deletion       point
(chromosome             and             recombination   conversion                   mutation
loss)               duplication
Figure 23-29. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition.
Spektrum účinků p53 v modulaci přežívání a frekvence změn genu
p53 u lidských nádorů
Fig, 1 The spectrum of survival -moduJaiion effects of p53
p21: promotes growth arrest bci-x: blocks apoptosis gadd-45: DNA repair (?)
MDM-2
CD95 (?) Cyclin G (?)
p21; promotes growth arrest
bax: promotes apoptosis
IGF-8P3: inhibition of IGF signalling
bd-2; blocks apoptosis
MDR; increases drug resistance
Survival					De	ath
						
						
J               Lung	-----------------------------------------------____                   "~                                                               -------!					
f              CoJon					---------1	
Esophagus				"                                      I		
Ovary				I		
Pancreas				-                                      I		
Skin						
Stomach				-----------------------------1		
Head and neck				---------------------1		
Bladder				I ---------I		
Sarcoma						
Prostate				I		
Liver						
Brain			~~               I			
Breast			:------------1			
Kidney			—i			
Blood		"           I				
Mefanoma		ZZD				
Cervix		1				
Testis						
0		10	20 Frequency	30                    40 of p53 alterations [%]	50	60
Vztahy mezi genetickými a fenotypovými změnami u nádorů
Gentic alterations		Phenotypic alterations	
	_______w	Proliferation Differentiation Apoptosis Response to genetic damage	
Oncogene Tumor suppressor gene			
			
	^••♦..		
		Invasion 1 Metastasis	
Onkogeny a nádorově supresorové geny mají funkce v regulaci proliferace, diferenciace, apoptózy a odpovědi na genetické poškození. Jejich úloha v invazi a vzniku metastáz je však nejasná.
NORMÁLNI , KONTROLOVANÝ RŮST
INICIACE
ABNORMÁLNI RŮST, ale stále ještě nějak kontrolovaný
ad o rove s u geny
Aktivované okogeny
GAP JUNCTION
nebo
Aktivace více onkogenů
Nádorově su ^     geny
Aktivované   \"++/ onkogeny
NEK'
Nefunkční mezibuněčná ■Y RUST          komunikace
NEKONTROLOVANÝ RU
o>
1
Poznatky o molekulárně genetické podstatě nádorového onemocnění lze shrnout takto:
► primární pro vznik nádoru jsou změny vyvolané jak genetickými (mutace v DNA) tak negenetickými příčinami (ovlivnění exprese genů)
►  karcinogeneze je několikastupňový proces založený na poruše genetické
homeostázy a pouze dílčí změna v kterémkoliv článku ke vzniku nádo nevede
►  ke vzniku nádoru může vést jen kombinace poruchy několika různých mechanismů, přičemž cesty, kterými se tak děje mohou být velmi rozdílné
►  byly nalezeny velké individuální a mezidruhové rozdíly i tkáňová a
orgánová specifita ve spojitosti se vznikem nádorů
► na vzniku nádoru se mohou významně podílet látky z vnějšího prostředí
ZMENY METYLACE DNA A ACETYLACE HISTONU NÁDOROVÁ EPIGENETIKA
EPIGENETIKA - dědičné změny v genové expresi beze změn v sekvenci DNA
laajMifliEffi
ntSRBWB
FafiiTfiffgCTiifimrn^SraTlIffinfgSi^^
► METYLACE DNA, tj. kovalentního přidávání metylových skupin do 5 pozice n;
cytosinovém kruhu v CpG dinukleotidu s účastí enzymu metyltranferázy. Přibližně 70% ^pvj
zbytků v savčím genomu je metylováno, ale většina genomu je chudá na CpG (2-5%). Distribuce j
nerovnoměrná - nahromaděny buď v rozsáhlých repetitivních sekvencích (satelity, centromerické
repetice) nebo v krátkých úsecích bohatých na CG, tzv. „CpG islands" (především v
promotorových úsecích genů, blízko místa startu transkripce).
Jsou normálně nemetylované a tak je umožněna transkripce genů za přítomnosti příslušného
transkripčního faktoru.
Metylace cytosinových zbytků je spojena s: navázáním specifických proteinů (methyl-bindL
)main proteins), aktivací histon deacetyláz (HDAC) a histon met)' kondenzací chromatinu a transkripční inaktivací příslušného genu. Souhra metylace CpG islands pomocí metylačních a demetylačních enzymů je je. epigenetické kontroly zárodečné a tkáňově specifické genové exprese.
Repetiti vní genomické sekvence roztroušené mezi zbytkem genomu jsou naopak silně metylovány a hrají asi roli ve vývoji nekódujících oblastí DNA a v utlumení endoparazitických a retrovirových transposonů.
Metylace DNA tedy hraje zásadní úlohu v normálním vývoji, v inaktivaci chromozómu X a supresi tzv. parazitických sekvencí DNA.
"mip    7řinínřit a wnínat" crprw na cnrávripm mí<itp a vp ^TYfávné době.
Aberantní metylace DNA v promotorové oblasti je však také klíčovým mechanismem inaktivace nádorově supresorových genů. Může způsobit zvýšení mutací a dědičně tlumí geny, jejichž promotory jsou asociovány s CpG „islands" a které kontrolují buněčnou proliferaci. Zatím neznámé mechanizmy zabraňují de novo metylaci těchto promotorů u normálních buněk.
vova]
Hypo- nebo hypermetylace DNA (obsah 5-metylcytosinu) patří mezi epigenetické (negenotoxické) mechanismy karcinogeneze. Metylační struktura v nádorových buňkách se liší od normálních buněk. Globální hypometylace genomu je doprovázena místně specifickou hypermetylací. Hypermetylace promotorů pro nádorově supresorové geny v CpG „islands" je doprovázena jejich utlumením a růstovou výhodou pro tyto buňky. Hypometylace DNA je naopak spojena se zvýšenou genovou expresí.
Metylace DNA může též usnadňovat mutagene hypermutabilita^
[eC může spontánně deaminovat na tymin -
►  ACETYLACE HISTONU
Genová exprese je regulována i strukturou chromatinu. Histony jsou považovány za důleži „překladatele" mezi genotypem a fenotypem - mají dynamickou funkci v regulaci struktur} chromatinu a genové aktivity. Mohou být modifikovány acetylací, metylací, fosforylací, ubiquitinací. Specifická modifikace konců histonů je přímo spojena s aktivní nebo utlumenou transkripcí - enzymy histontransferázy.
Chromatin obsahující hypoacetylované lysiny v histonech má kompaktní strukturu transkripci. Inhibitory histonových deacetyláz (HDAC) mohou vytvářet otevřené struktury chromatinu a aktivovat určité geny inhibující nádorový růst využití v terapii (butyrát, trichostatin). Histony se podílejí na tvorbě a udržování „epigenetické paměti"
mn&xwmsjmmnjw
ra^jura^
při aktřr'
mn^^Q^^^^H^Q^^^^^^^
resorovvch
J. Lopez et al. Br J Cancer 2009
^   Unmethylated CpG
Methylated CpG r  Active historie modifications Repressive histone modifications
Active transcription
im
Normal cell
Repressed transcription
ŤTTT
Normally expressed genes
MtkAJsL
JNF) Euchromatin     hatJ[hat] hatJ
Repressed transcription
* Viral transposons
• Imprinted genes
MECP2H
Heterochromatin Active transcription
mi
■xe
Cancer cell
ini
»Silencing of tumour suppressor genes
• Expression of transposons and imprinted genes
* Expression of oncogenes
jswi/snf}Euchromatin (hatj[hat)
.HAT]
Figure I Current understanding of some of the changes to DNA and chromatin that occur in cancer cells. In the nomnal cell, promoters of actively transcnbed genes are un methylated and found within regions of euchromatin. Expression of other genes is repressed by promoter methyl ati on and heterochromatin formation. In cancer, this is deregulated, resulting in the aberrant expression of normally silent genes and repression of tumour suppressor genes. Abbreviations: HAT, histone acetytransferase; SWI/SNF, switch/sucrose nonfermentablc nucleosome remodelling complex; MeCP2, methyl CpG-binding protein 2; HDAC, histone deacctylasc.
Unmethylated CpG Island
Activators, Histone Acetyltransferases,
Basal Transcriptional Machinery Protect the Island
A
UM
mm
1
s.
i
1
•
M
RNA Transcription
Hypermcthylated CpG Island
Transcriptional Repressors, Histone Deacetylases, DNA MethyEtransferases and Methyl-binding Proteins Shut-Down the Island
/---±^
n
Spreading from Methylatiot! Centers, Seeding of Methylation, Selective Advantage*,,
V
mm
mrni
a_j
0
c
i
Transcription is Abolished
LjVlU
Figure 1   The typical CpG island ol" a tumor suppressor gene is represented in a normal and a tumor cell. The presence ol a dense hvpermethvlation changes completely its molecular environment. White dots, unmethvlated CpGs; Black dots, methylated CpGs
Utlumení genové exprese aberantní metylací DNA a modifikací histonů
ch3
DNA   methylation
histone   deacetylatíon H-3   Lys-9   methylation
CH3
CH3
DNA   demethyiation histone   acetylation
H-3   Lys-4   methylation
CH3AC
CH3   Ac
Nukleosomy v promotorové oblasti. Proteiny vážící se k 5MeC (MeCP2) se váží k metylovaným CpG místům a způsobují tlumení genové exprese histon deacetylázou (HDAC). Přítomnost tohoto komplexu, deacetylace lysinu v histonech a metylace histon-3 lysin-9 histon metyltransferázou přeměňuje nukleosom v kompaktní konfiguraci, která zabraňuje vazbě transkripčních faktorů. Demetylace a deacetylace způsobuje pak zase uvolnění inhibičního proteinového komplexu a tvorbu otevřené struktury nukleosomu, která umožňuje transkripci.
Metody využívané pro analýzu metylace - např. metylačně specifická PCR. Primery rozlišují metylovanou a nemetylovanou DNA v nádorových biopsiích nebo tekutině. Další metodou je v současnosti imunoprecipitace purifikované metylované DNA, umožňující detekovat mety lační profil DNA celého genomu - DNA methylom).
miRNAs
.ulezitou součásti epigeneticke regulace jsou tzv. male regulační RNA - mikroPi
(miRNA).                              _________________________________________
V tzv. RISC komplexu se miRNA vážou na částečně komplementární cílová mísu
genů a mohou řídit buď translační inhibici nebo degradaci mRNA.
Tato represe prostřednictvím miRNA je další ces
genová exprese.
miRNAs jsou deregulovány u řady nádorových typů a mohou fungovat jako
nádorové supresory.
Hypermetylace CpG islands spojených se specifickými miRNAs může být jedni
mechanismů, kterým může být miRNA selektivně downregulována. V případě,:
miRNA situována v kódující oblasti genu, metylace může zároveň tlumit expresi jak
genu kódujícího protein tak příslušné miRNA.
% 30
25
20
15
10
Percentage of CpG Island Hypermethylation in Human Cancer According to the Tumor Type
Dfloo
a
2     3      4     5     6    7     8     9     10   11   12   13   14   15
l.Lymphuina
2»E&oph;igu*
3.Stomach
4,Co Ron
5-Pitficrcas
6,Leukemia
7, Utero s
8*Liver
9.Head & Neck
10-Glioma
HJCidncy
U.Breast
13Xung
14-Ovary
15-Bladder
Percentage of CpG Island Hypermethylation in Human Cancers According to the Tumor Suppressor Gene
30-i	
25+ rri	
20	—i  ^-^
15     |    |    i 10      1    | 5-0; U L	1J Q QiJaan a
I. pi«*1*«»
2.pI5INK* 3. DAPK 4.hMLHl
5. MGMT
6. APC
7. GSTP1 8.p73
9. pl4ARF
10. BRCA1
10
Figure 3 (» and b) are alternative ways to present our CpG island hypermethylation profile of human cancer (Esteller et aL. 2001a). (a) an average value ol" the frequency of hypermethylation of II tumor suppressor genes (pl6I>IK4<i, pl4A , pl5I%K*\ MGMT, hMLHI, BRCAI, GSTPI, DAPK, CDH I, p73 and APC) is shown according to the most common types of human tumors, (b) the other side of the coin: the Irequencv of CpG island hypermethylation of ten particular tumor suppressor genes in the tumor types described in a. In the cases ol" pl5J K4b and hMLHI an overestimation exists due to the high number ol" leukemias and micro-satellite unstable tumors included, respectively
Table 1   Hallmarks oľcancer and different types of genes silenced by aberrant DNA methylation
Hallmark" (acquired capability}	Gene silenced by DNA methylation	Gene function	References
Insensitivity to antigrowth signals	pl6CDKN2A	Cyclin-kinase inhibitor induce differentiation cell cycle arrest	Herman et d (1995)
	RAR/f		Cotéf/ťrf.(l998)
	Sipa 14-3-3		Umbricht et a/, (2001)
Self-sufficiency in growth signals	RASSFIA	Regulation Ras pathway	Damtnannť/ííM2000)
Evading apoptosis	Capase-8	Initiate apoptosis	lék et d [Mi)
	TMS1	Proapoptosis	Stimson and Vertino (2G02)
	DAP-kinase	Proapoptosis	Kissilr/ü/.(l997)
	pl4ARF	Proapoptosis	Robertson and Jones (1998)
Limitless replicative potential	Rb	Tumor suppressor gene	Ohtani-Fujitartü/, (1993)
Sustained angiogenesis	Thrombospondin-I	Angiogenesis inhibitor stimulate angiogenesis	Li et d (1999)
	VHL		Herman ctd{ 1994)
Increased invasion And metastasis	E-cadherin	Suppress metastasis	Graff et d (1995)
	TIMP3	Inhibit metastasis	Bachmanť/íí/,(1999)
Genome instability	hMLHI	DNA missmatch repair	Esteller(2000)
(enabling characteristic)			
	MGMT	Repair alkylated guanine	Qian and Brent (1997)
	BRCAI	Repair DNA damage	Bianco ťŕífM2000)
DAP-kinase death-associated protein kinase; MGMI Ormethylguanine DNA methyltranslerase; RAR/f, retinoic acid receptor-/l2; Rb. retinoblastoma; TIMP3, tissue inhibitor of metalioproteinase-3; VHL von Hippel Lindau tumor suppressor gene. The table is illustrative, but not comprehensive. For a list of many cancer-related genes silenced by aberrant methylation, see Tsou et aĹ 2002, :ianahan and Weinberg (2000),
7516
Aberantní epigenetické a genetické děje mohou vést prostřednictvím nesprávné genové exprese k tvorbě nádorů
EPIGENETIC EVENTS
Aberrant methylation and histone tail modification
-► GENETIC EVENTS
Pathway disruption
-©-©—©-
S—@-
——&-------------
R  ŘR8-
Chronic DNA damage
Silenced Chromatin
^
*' 6
IMORTALIZACE BUNĚK
iHffiHi^OTf^fflltl       Imnc-ir-h r-hrnmrr/nm
Imortalizace zahrnuje inaktivaci specifických nádorově supresorových genů jako jsou RB a p53, které se účastní regulace přechodu Gl-S fáze buněčného cyklu a indukce apoptózy i dalších genů spojených s buněčným cyklem a apoptózou.
Kromě toho existuje v buňkách mechanismus - buněčné hodiny - odpočítávající počet dělení a regulující stárnutí buňky. T »rmální somatická buňka má omezený počet dělení, tj. li:
;verzibilní zástava růstu tzv. replikativní stárnutí (senej. _
a obsahují tandemové opakující se sekvence DNA bohaté na guanin (TTAGGG) obalené specifickými na DNA se vázajícími proteiny. Telomery tvoří protektivní čepičku kolem genomové DNA a zabraňují chromozomálním ztrátám a aberantním fúzím během mitotického cyklu. Telomery se zkracují s dalšími buněčnými děleními, což může způsobit genovou nestabilitu a změněnou genovou expresi. Buňky procházejí krizovým stadiem (Hayflickův limit) nebo umírají. Zkracování telomer vybudí proliferativní stárnutí přes aktivaci pRB a p53 kontrolních bodů, což vede u p53-wild typů k zástavě proliferace. Dochází k bariéře v proliferaci charakterizované dysfunkcí telomer, extrémní genomovou nestabilitou a rozsáhlou smrtí buněk mechanismy závislými i nezávislými na p53. Délka telomer koreluje s buněčným stárnutím, ale neexistují žádné důkazy pro jasnou korelaci na organismální úrovni a korelace s délkou života člověka či jiných druhů. Heterogenita průměrné délky telomer odráží gr ^u k desradaci a těmi.1-
Bglj
Např. buňky se sebeobnovnou kapacitou mají delší telomery než diferencované, nebo telomery lab. myší jsou delší než u člověka. Telomery jsou kratší u lidských somatických tkání ze starších lidí než u mladších jedinců nebo u zárodečných buněk. Děti s genetickými nemocemi projevujícími se rychlým stárnutím tzv. progerickým syndromem (Down, Werner, At. telangiectasia) umírají v raném věku s tělem 90ti letých a jejich telomery jsou drasticky zkráceny.
Imortalizované buňky vznikající z krizového stadia (inaktivací p53 a pRB, overexpresí cMyc Ras a v důsledku vážné genové nestability) obnovují funkci telomer aktivací telomerá? alternativním telomery udržujícím mechanismem (ALT) nebo jiným adaptivním mechanismem. Ve skutečnosti mají nádorové buňky kratší telomery než jejich odpovídající normální buněčné typv 'o telomery se dále zkracují během progrese nádoru a u myších exp. modelů, jsou zkrácen íery spojeny se zvýšenou genetickou nestabilitou a zvýšenou nebo redukovanou spontánní malignitou v závislosti na genetickém kontextu. Mnoho faktorů (genetických, nutričních, hormonálních, environmentálních, farmakologických) může modulovat udržování telomer a otenciál buněčného
'ELOMERÁZA. Telomery nejsou udržovány normálním replikačním procesem. U kmenový nádorových a imortalizováných buněk, je zkracování telomer zastaveno aktivací telomerázy -reverzní transkrintázv. která rozšiřuie telomerické TTAGGG onako váné sekvence.
3 hlavní složkv: s telomerázou spojený protein, TLPl, telomerázovou RNA -hTR a telomerázovou katalytickou jednotku TP2 - lidská telomerázová reverzní transkriptáza.
Telomeráza používá svou RNA k navázání na telomery, zatímco katalytická proteinová jednotka syntetizuje DNA přímo na koncích chromozómů reverzní transkripcí templátu RNA.
Rozšiřování na guanin (G) bohatých telomerovych vláken
telomerázou
■GGGTTAG
-GGGTTAGGGTTAG
►GGGTTAGGGTTAG
51
Holoenzym telomeraza obsahuje proteinové subjednotky včetně katalytické subjednotky s aktivitou reverzní transkriptazy a molekulu RNA, která slouží jako templát pro přidání o1
NmiMMMiljl^^
Stadium terminálni proliferační zástavy (TPA)
U:
C Q
O
Ú. O
immortalization
y
crisis
p53-minus TPA
senescence
Time in Culture
Normální buňky absolvují určitý počet dělení než navždy opustí buněčný cyklus a zůstanou ve viabilním neproliferujícím stavu - senescence. Při inaktivaci p53 se tyto buňky ještě nějakou dobu dělí a pak zastavují buněčný cyklus (p53-minus TPA). Při narušení jak p53 tak pRb/p16 (např. přítomností virových onkoproteinů), buňka obejde stav senescence a následně je zastavena ve stavu krize. Výjimečně (1 buňka z 107) může překonat krizi a stát se nesmrtelnou. Transdukce několika normálních buněk s expresním konstruktem hTERT může vyústit v expresi telomerázy a obejít stav senescence.
metaplastických buňkách a velmi nízká nebo žádá v normálních dif. tkáních a postupně se snižuje s věkem. Jeií exprese ie spojena s wsokvm nroliferačním indexem a obnovnvm tkáňovvm potenciálem.
agresivitou nádorů, wsokvm histODatoloaickvm gradem a s nroliferací cévního endotelu.
Telomerázová
[tiraiaJ!
irese je  cr nemické kar
nrnvě  «iiinrpsnrnvv  crpn    alf rpp
LŮležitým predisponujícím dějem u karcinogeneze nebo cílené né-
lomei
dolů m ^rapie.
Homeostáza  systému  telomery - telomeráza je  komplexní  a je  svázána  s  genetickými  r
environmentalnimi íaktorv.
Rada faktoru snižme
iferenciační činidla, epigallocatechin gallate (z čaje), antineoplastické látk
MAPK, tamoxifen, androgeny, volné radikály, inhibitory
reverz, tarnskriptázy) a řada zvyšuj
-emické karcinogény, mutace telomerických sekvencí, gamma
záření, PKC, EGF, estrogeny) telomerázovou aktivitu.
Vztahy mezi telomerázovou aktivitou a nádorovým onemocněním jsou složité a jen částečně objasněné. Telomeráza může paradoxně buď podporovat nebo inhibovat tvorbu nádorů v závislosti na genetickém kontextu.
U nádorových buněk i sou telomerv kratší a telomerázová aktivita obvvkle následuie do zkracování
telomer. Ztráta funkce telomer při raném dělení zahajuje genetickou nestabilitu, zatímco v pozdějším
bodě progrese nádoru absence telomerazy inhibuje růst. Tak zatímco inhibice telomerazy u ustanovených
nádorů může být cenným terapeutickým přístupem, na věku závislé zkracování telomer může být
rizikovým faktorem pro nádory tím, že umožňuje obejít kontrolní bod mortality.
Systém telomery-telomeráza představuje komplexní skupinu molekul interagujícíh
navzájem a modulují'
Vnější zásahy mohou mou
jsou spojeny také odpovídající proDiemy.
j^^^nu^^^^^mm^^^^ßn^^mm^^
wR^M^^^mHmmßvfämmm
Udržování telomer by mohlo byt důležité pro prodloužení života, ale vzhledem ke složitosti fyziologických mechanismů na buněčné a zejména organismální úrovni, nelze tento problém ziednodušovat. Z onkologického hlediska, může overexprese telomerazy zvyšovat riziko vzniku nádo Ačkoliv normální buňky s delší dobou života a udržovanými telomerami se nejeví jako neoplastické, zpoždění fyziologické smrti může zvyšovat pravděpodobnost kontaktu s karcinogény. Telomeraza sama
Zatím se pozornost soustřeďuje na zvýšení doby života několika cílových buněk nebo snížení proliferujícíh nádorových buněk. Málo pozornosti je věnováno organismální úrovni, mikro- a makropro středí, ve kterém tyto buňky rostou jako normální nebo imortalizované nádorové buňky: tj
' nrům, cytokinům, hormonům, imunitnímu systému a
istovy
enviro
99999
•vvá odnovědět na otázky:
Je bezpečné prodlužovat lidský život použitím terapeutických látek? Je lepší prodlužovat lidský život nebo zlepšovat kvalitu života?
Zkracování telomer může vést k chromosomální nestabilitě a vzniku nádoru
SELF-RENEWAL OF EPITHELIAL CELL POPULATION BY REPEATED CELL
DIVISION ----------------telomeres shorten and uncap
4----------------------
normal p53 and
cell cycle
checkpoint control
t
normal senescent cells stop dividing
I
loss of p53 and cell cycle checkpoint control
4
mutant cell survives and proliferates! ^^               4                       ^^
chromosome fusion
CHROMOSOME BREAKAGE-FUSION-BRIDGE CYCLE
cell dies dueto | catastrophic genomic *" instability and DNA damage
r
chromosome translocation
chromosome , bridge
chromosome breakage massive chromosomal damage
\
telomerase reactivated
\
chromosomes are partially
stabilized and cell survives
with many mutations
4
CANCER
Imortalizace je nutná,ale ne dostačující pro maligní transformaci
A Normal cells SV40-transduoed mortal cells 5V40-immortalized cells B Normal calls immortalized cella	rati "v.				No transform alio n No transform alio n Malynant transform alia n Pnemaiure senescence Malignant. Lrarsiriímaiion
	ras	^-	^^^^^^^^^^^^^~	------     *-	
	ras	-----^------------------	---------^------------	-----------N-■-	
	ras ras		V_^pl6----/	^^^ H *-	
		*■ mti\	^	r	
A) In a number of in vitro models it has been shown that oncogenes, such as activated ras, can cause malignant transformation of immortalized cells but not their normal mortal counterparts. In the example illustrated, activated ras caused malignant transformation of SV40-immortalized fibroblasts, but not normal fibroblasts nor SV40-transduced fibroblasts that had not become immortalized (67). (B) Mouse fibroblasts transduced with activated ras obtain a constitutively active MEK signaling pathway. In immortalized cells this may result in malignant transformation, but in normal cells this results in upregulation of p53 and p16INK4a and premature senescence (74).
Adenovirová terapie využívající promotoru pro telomerazu
normal cell
viral agent
hTERT
adenovirus
\
telomerase-
cancer cell
telomerase4
viral replication blocked
viral replication
x
i i
*
Al
cell destruction viral release     § virus spread
Inhibitory telomerazy a konvenční terapie
telomerase inhibitor alone
»
tumor size
telomere        lUSBHUB    gMMMIEl length (kbp)                 7                                6
conventional therapies alone
tumor size
telomere        OHMUJ   OSMUS length (kbp)                 7                                7
conventional therapies + telomerase inhibitor
tumor size
telomere
length (kbp)                 7                                5

«
#
•
apoptoois
time of treatment