LECEBNE METODY CHIRURGIE OZAŘOVÁNÍ CHEMOTERAPIE BIOLOGICKÁ TERAPIE hemoterapeutické látky ► platinové deriváty ► antimetabolity (metotrexat, fluorouracil) ► inhibitory topoizomeráz (doxorubicin, etoposid) ► alkylační činidla (cyklofosfamid) ► rostlinné alkaloidy (vinbl astin, paclitaxel) Biologická terapie - hledání nových přístupů na základě poznání mechanismů ► Stimulace obranných me chanismů hostitele včetně specifických a nesp ecifických imunologických přístupů (imunoterapie) ► Strategie cílené přímo na změnu nádorového růstu a diferenciace - využití mzen arizaci nádorů A. Organogenesis B. Tissue Homeostasis C. Carcinogenesis Symmetrie self-renewal Stem call expansion Proliferation Transient amplifying population Proliferation and lineage commitment + Terminal differentiation, cell migration, apoptosis cya Normal siam call Q Trmdant ampHVIng, »II [9) Lineage commiltco ixi prog an iter csUe jo "ÖJ 0EflO||0|0| CO Normal tissue Asymmetric self-renewal stem cell maintenance ^l°l°|5^|0l0l0l Proliferation Transient amplifying population Initiation l°l°l0l£P^gffip Symmetrie self-renewal Cancer stem cell expansion Tranalant amplifying cancer call population Proliferation and aberrant differentiation Hyperplasia Terminal differentiation l°H°l°H°S°a 9B3 Proliferation and aberrant differentiation Local Invasion Carcinoma in situ Invasive carcinoma 0 DlforontHlad can ttfuaftKUrnulHitKi slant mil or procariLL:- call mtn salf rerwwai capaHltty Non-lumorigenic conoer «Ig Basement membrarw Reactivation *» Metastasis • V Dormant Metastatic carcinoma mlcrometaataeee M FC rometa sta s e 5 Figure 1. Stem cells in normal development, tissue homeostasis, and carcinogenesis. A during normal development, symmetric stem cell self-renewal results in stem cell expansion. This process is tightly regulated by components of the stem cell niche. Stem cells differentiate into a transient amplifying population that undergoes further proliferation and lineage commitment followed by cell migration, terminal cell differentiation, and apoptosis of fully differentiated cells. Bf during normal tissue homeostasis, asymmetric self-renewal of stem cells results in stem cell maintenance. Proliferation and differentiation of transient amplifying progenitor cells replaces normal ceil loss resulting in tissue homeostasis. Ct carcinogenesis may be initiated by stem cell expansion via symmetric self-renewal. Unlike normal organogenesis, this process is dysregulated resulting in cancer stem cell expansion. Aberrant differentiation of these cells generates tumor heterogeneity. Further mutations or epigenetic changes may accompany tumor invasion and metastasis. Metastases require the dissemination of cancer stem cells that may remain dormant and be reactivated resulting in tumor recurrence. In contrast, dissemination of differentiated tumor cells produces only micrometastasis that do not progress. A. Carcinogenesis Normal tissue thftfci* Hyperal Carcinoma in situ Invasive carcinoma Metastasis Metastatic carcinoma Dormant Micro metastases B. Clinical Interventions Risk reduction Reduction In normal stem cell number J \ Micrometastases J C. Predicted Outcomes > |o|Q|o|op|o|o| Risk reduced tisane Early detection Detection of factory secreted by initialed stem cells Primary prevention Apoptoaia or differentiation of initiated stem cell« Treatment Conventional therapy Secreted cancer stem fe". cell marker* 0 \ Residual non-turnorlgenlc cells iPfel0 -> Recurrence Resldusl metastases > Recurrence > Targetl ng cancer stem eel Is ^ and/or blocking self-renewal * (i nh ibitors of Hedgehog, Notch, ^ Wnt elg ruling) Cure Residual non-turn ovigenic cell» at distant sites Figure 2. Clinical implications of cancer stem cell model. The cancer stem cell model has important implications for cancer risk reduction, early detection, prevention, and treatment. Interventions that reduce normal stem cell number may decrease cancer risk. Detection of factors secreted by initiated stem cells may allow for the earlier detection of cancers. Interventions that induce apoptosis or differentiation of initiated stem cells- may be effective in cancer prevention. Conventional cancer therapies, including cytotoxic agents, selectively destroy differentiated cancer cells, sparing the cancer stem cell compartment resulting in cancer recurrence at primary or metastatic sites. Therapies that selectively eliminate cancer stem cells leave residual nontum oh genie cells resulting in potential cancer cures. Wicha MS et al., Cancer Res. 2006 Podpůrná (symptomatická ) léčba Nemá za cíl smrt nádorových buněk, ale usiluje o co nejlepší kvalitu života nemocných (zmírnění obtíží vyvolaných nádorem a léčbou) Paliativní léčba - komplexní podpůrná léčba u pacientů s pokročilým nevyléčitelným onemocn ěním Kurativní léčba - cílem je vyléčení nemocného Nekurativní léčba - cílem je zabíjet nádorové buňky, ale nemá ambice vyhubit všechny (pokročilé onemocnění, rezistence na léčbu atd.) Adjuvantní léčebné postupy -chemo- nebo radio-terapie - u těch nádorů, kde je předpokládána přítomnost mikrometastáz, nutná chemosenzitivita nádoru Neoadjuvantní postupy - predoperační léčba s cílem zmenšit primární nádor před chirurgickým výkonem Vznik a vývoj nádorů je složitý děj, který závisí na překonání řady restrikčních mechanismů na úrovni genomu, buňky, tkáně i celého organismu a který pro svou komplexnost vyžaduje při plánování terapie individuální přístup (tailorim therapy) - využití poznaných biologických charakteristik Klinické - staging (jeden z nejsilnějších prognostických faktorů), sledování přežití a léčebné odpovědi Orgánové - sledování odpovědi nádoru na léčbu Tkáňové - histologická charakteristika, grading, tkáňová architektonika, vaskularizace, expresní profily-imunohistochemie, in situ hybridizace Buněčná - funkční testy, obsah DNA, proliferační a apoptická aktivita Molekulární - cytogenetické a genetické charakteristiky nádorových a somatickýc buněk Incidence nádorových onemocnění se stále zvyšuje. Přesto je dlouhodobá mortalita téměř konstantní díky výrazným léčebným a diagnostickým pokrokům. Nové léčebné postupy, nová chemoterapeutika, kombinovaná terapie a aplikace nových poznatků o biologii nádorové buňky. Hledají se nové prognostické/prediktivní faktory umožňující přesnější rozdělení jomatický kých Hledaj love proj umožňující přesnější rozdělení nemocných do rizikových skupin. Cancer incidence and mortality in the United States oral cavity and pharynx digestive organs cancers of epithelia: I carcinomas respiratory system breast reproductive tract urinary organs skin melanoma leukemias and lymphomas central nervous system connective tissue, ■ muscles and vasculature I other new cases per year (total = 1,220,000) deaths per year (total = 552,200} 40 80 120 160 200 240 280 number per year (thousands) iFigure 23-2. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition. DIAGNOSTIKA Laboratorní vyšetření ( sedimentace erytrocytu, hematologické vyšetření, biochemická vyšetření) Nádorové markery - laboratorně prokazatelné známky projevu specifických nádorových onemocnění (antigeny, emzymy, hormony a jejich receptory) Mohou odrážet proliferační aktivitu, mohou být sdružené s diferenciací nebo vznikají při destrukci buněk. Patří sem i pro nádor charakteristické chromozomální abnormality. Biochemické metody detekce: radioimunologická (RIA), enzym vázající imunosorpční (ELISA) (většinou komerční kity a automatické analyzátory) Vyšetření stavu buněčné kinetiky Morfologie, sledování počtu mitóz - mitotický index Metody autoradiografické (inkorporace 3H-tymidinu) Metody cytochemické (speciální barvení, speifické protilátky proti antigenům spojeným s proliferací (Ki-67, PCNA), stanovení AgNOR Průtoková cytometrie Molekulárně biologické metody (Southern, Nothern a Western blotting pro analýzu DNA, RNA a proteinů), polymerázová řetězová reakce - amplifikace malých fragmentů DNA, vytváření cDNA knihoven z malého množsví mRNA (PCR, RT-PCR, real-time PCR) Hybridizace in situ, microarrays Cytologické a bioptické vyšetření (pre- nebo postoperační) iBRAZOVACI METODY trasono grafie - vy Rentgenové vyšetřen: šetření ultrazvukem, neinvazivní kontrastní vyšetření, mamografie - screening a diagnostika rakoviny prsu Počítačová tomografie (CT) - odhalí až 90% ložisek menších než 1 cm Magnetická rezonance (MR) - zejména vyšetření mozku a míchy Radionuklidové vyšetřovací metody - využití izotopů (scintigrafie, emisní Klasifikace nádorových onemocnění Určení rozsahu onemocnění důležité pro volbu léčebné strategie a pro odhad prognózy onemocnění. Jednotný klasifikační systém TNM T (tumor) 1-4 - rozsah primárního nádoru N (noduli) 1-3, 0, X - stav regionálních mízních uzlin M (metastases) 0, 1 - informace o metastázach Histopatologický grading G1 - 4, X - stupeň diferenciace Další nezávazné deskriptory Stadium choroby (staging) I. - IV. Hodnocení tělesné zdatnosti (funkční staging) U některých nádorů formulován soubor prognostických znaků, tzv. mezinárodní prognostický index (IPI) PREDIKTIVNÍ ONKOLOGIE klinicky orientovaný onkologický výzkum využívající metod buněčné a molekulární biologie. Hledání nových léčebných postupů a léčiv směrovaných na klíčové genetické změny umožňující transformaci normální somatické buňky v nádorovou. Jsou to především ► poruchy buněčného cyklu, ► poruchy v aktivitě/množství receptoru pro růstové faktory, ► exprese protiapoptických faktorů a ► nesmrtelnost nádorových buněk vázaná či nevázaná na expresi telomerázy. Chromozomální a genetická analýza nádorových buněk je důležitým faktorem pro prognózu a individualizaci léčby. Problémem jsou zvláště solidní nádory, kde jsou cytogenetické znalosti minimální např. ve srovnání s hematologickými malignitami. V praxi se jedná o stanovení ploidity DNA, chemosensmvity in vitro, cytogenetické a genetické vyšetření atd. MOLEKULÁRNÍ PATOLOGIE studium procesů související se vznikem a rozvojem chorob, nukleových kyselin a proteinů, respektive jiných molekul, kte regulovány. Využívá technik molekulární biologie a výsledky jsou dávány do kontextu s nálezy dalších biomedicínských oborů. Umožňuje odhalovat počátky nemoci a nahlédnout a to na úrovni *é isou Nové směry vývoje protinádorové léčby Cílem je přímo a cíleně zasáhnout do klíčových mechanismů karcinogeneze na therapy). s konvenčními léčebnými postupy Často v kombinac ► Diferenciační terapie (kysel ina all-trans retinová, vit D3) ► Inhibitory přenosu signálů Inhibitory tyrozinkináz Inhibitory cyklin-dependentních kináz - ovlivnění bun. cyklu Inhibitory jiných kináz - např. MAP kinázy, JNK Inhibitory farnesyltransferázy - inhibují onkoprotein ras - spojen s vnitřní str plazmatické membrány izoprenoidní lipidovou skupinou - farnesylem Mutace protoonkogenu ras - častá u nádorů - vede k nekontrolované proliferaci nou apoptc eze Imunoterapie intervence do imunitních mechanizmů s cílem obnovit nebo modifikovat funkce imunitního systému (substituční, supresivní nebo stimulační, aktivní vs. pasivní, specifická a nespecifická) Buněčná imunoterapie - podání buněk imunitního systému s proti aktivitou - cílené zasažení nádorové tkáně a překonání tolerance a imunosu vyvolané nádorem . Nádorové antigeny - vznik nových antigenů, kterými se nádorové buňky normálních - terč pro imunitní reakci Nespecifická buněčná imunoterapie - posílení protinádorové imunity nezávisle na ifických nádorových antigenec Princip: kultivace efektorových buněk ex vivo s látkami, které aktivují nebo posilují jejich protinádorový účinek (LAK buňky, NK-buňky, aktivované monocyty-makrofágy Zkoušeno přes 30 let - malé uplatnění v praxi Specifická buněčná imunoterapie - adoptivní imunoterapie využívající specifický převod buněk (TIL) Protinádorové vakcíny - navozují specifickou imunitní odpověď proti nádorovým buňkám v prim. nádoru i metastázách Dendritické buňky nespecifické postupy A K T j i! Vi N t P A S I V N í humorální rekombinantní interiérom rekombinantní interleukiny rekombinantní růstové faktory A K T I V| N í buněčné adoptivní imunoterapie LAK TIL cheraoimunoterapie specifické postupy BCG imunoterapie monoklonáiní protilátky proti nádorovým Ag proti liniovým Ag A K T I V N i vakcinace dendritické buňky cytokiny nádorové antigény DNA vakcinace Obr. 26.19: Terapeutická modulace imunitního systému nemocných s nádorovým bujením J.Krejsek, O. Kopecký: Klinická imunologie, 2004 Genová terapie Postup mající za cíl napravit genetickou odchylku způsobující vývoj nádorové buňky (p53, geny rezistence, sebevražedné geny, cytokiny) oli gonukle ngiogeneze a antiangiogenn inhibitory proteáz inhibitory migrace a proliferace endotelu inhibitory angiogenních růstových faktorů chelátory mědi HODNOCENI DAT - VÍCEROZMĚRNÉ ANALÝZY Průnik metod molekulární biologie do onkologické diagnostiky vyžaduje zpracování multiparametrických (vícerozměrných) souborů dat. Biomarkery, „surrogate biomarkers" - „náhradní" biomarkery Patří mezi ně ► důležité genetické a cytogenetické markery, ► exprese významných regulačních genů, ► aktivity enzymů, ► cytokinetické parametry, ► parametry angiogeneze, atd. Vyšetření na chemorezistenci v testech in vitro (MTT test) a související znaky (exprese MRP, PGP). Doplňují standardní klinická vyšetření a nespecifické ukazatele imunologického a fyziologického stavu pacienta. Je nutné vytvořit systém hodnocení takovýchto dat s cílem určit jejich prognostický význam a zajistit zpětnou vazbu lékaře k těmto hodnoceným datům - individualizace léčby - prospěch pro pacienta nologické Transplantace Embryonic neural Current Opinion in Cell Biology Summary of therapeutic tissue-specific stem cell transplants. Purification of HSCs from bone marrow (BM) and subsequent transplantation can reconstitute the blood system, including red blood cells (RBCs), white blood cells (WBCs) and platelets, for the treatment of cancer, immunological deficiencies, metabolic disorders and hemoglobinopathies. Epithelial cells can be cultured and transplanted, creating an autologous source of epithelial stem cells to treat burns, ulcers and genetic skin disorders. Dopaminergic neurons derived from embryonic neural tissue can be transplanted to treat Parkinson's disease. Pancreatic stem cells have not been isolated. Enucleated oocyte Somatic cell nucleus Transplant Current Opinion in Cell Biology Nuclear transfer embryonic stem (NT ES) cells can be created by the transfer of a somatic cell nucleus into an enucleated oocyte. ES cells cultured from the ICM of a blastocyst created by NT can either be manipulated for transplantation or can undergo gene therapy before transplantation for the treatment of genetic disorders. Kontrola hemopoézy ► pozitivní regulace - využití hemopoetických tzv. kolonie stimulujících růstových faktorů (CSF) erytropoetin, G- CSF - granulocytární růst. faktor, M-CSF - monocytární růst. faktor, GM-CSF - granulocytární-makrofágový růst. faktor, interleukin 3 (I L-3) ► negativní regulace hemopoézy - prevence poškození kmenových buněkpři chemoterapii - TGF P ► autokrinní růst - bl okáda přenosu růstových signálů antagonisty růstových faktorů, receptorů a inhibitory dalších stupňů přenosu signálů (inhibitory PKC, lipidového metabolismu, "antisense" látky, atd.) ► imunomodulační látky - ovlivnění imunitního systému hostitele (IL-2, interferon alfa a gama Erytropoetin - stimulace erytropoézy po chemoterapii a transplantaci KD - u některých lymfoproliferačních poruch jako jsou mnohočetné myelomy a chronická lymfocytární leukémie - u anémií spojených s chronickým onemocněním (nádory, AIDS) v programech autologního odběru krve G nuioc or (G-CSF a GM-CSF) urychlení zotavení krvetvorby po chemoterapii - zlepšení sběru progenitorů z periferní kr - zvýšenní účinnosti cytotoxických l éčiv vybuzením klidových leukemických buněk Nejběžnější využití CSF (colony stimulating factors) - prevence a ovlivnění myelosuprese - intenzifikace chemoterapeutických programů s nebo bez autologní podpory progenitorů z kostní dřeně (KD) nebo periferní krve - rekonstituce krvetvorby po chemo- a radioterapii a autogenní nebo allogenní transplantace KD - podpora a expanze progenitorů periferní krve - stimulace hemopoézy u syndromů poruch v KD jako je cyklická neutropenie, aplastická anémie - aktivace efektorových buněčných funkcí (AIDS, poruchy funkce leukocytů) - pomocí růst. faktorů lze také buňky v G0 fázi, kdy jsou rezistentní k působení cytostatik posu nout do buněčného cyklu >1. KD. CML je klonální myeloproliferativní porucha primitivních hemopoetických kmenových buněk. Zahrnuje myeloidní, erytroidní, megakaryocyt., B- někdy T-lymfoidní elementy, ale ne fibroblasty kostní dřeně (KD). Nemoc je silně heterogenní, má 2 až 3 fázový průběh, je přítomen chromoz. marker - Ph chromozom. V minulosti byla prognóza pacientů s CML velmi špatná (stř. doba přežití 3 roky) Nyní se prognóza zlepšila díky včasné diagnóze, zlepšující se terapii a podpůrné léčbě. Léčba hydroxyureou a busulfanem podporovaná IFN a autologní trans Nyní je stř. doba přežití asi 60-65 m ěsíců. S IFNalfa 20-25% pacientů přežívá. Vedlejší účinky - horečka, nechutenství, svalové bolesti, dlouhodobější - ztráta váhy, deprese, nespavost atd. MDS je získaná klonální porucha kostní dřeně charakterizovaná kvantitativními i kvalitativními poruchami v hemopoéze (hodně u starších lidí - není možná drastická terapie) Rada léčebných protokolů je zaměřena na využití diferenciačních látek k podpoře zrání blokovaných buněk. Existují in vitro modely, kde je možno pomocí retinové kyseliny, DMSO nebo vit D3 příp. G-CSF, GM-CSF. Avša nepřinášejí žádoucí výsledky. Kyselina all-trans retinová (ATRA) je nyní efektivním lékem při léčbě akutní promyelocytární leukémie. Na MDS má však malý účinek (genetický důvod - absen translokace 15,17 důležité pravděp. pro klinický účinek ATRA Rekombinantní růst. faktory jako GM-CSF a IL-3 jsou u MD využívány ke zvýšení počtu cirkulujících bílých krvinek a destiče v praxi u pacientu S pacientu uspí Chemoprevence a chemoterapie CHEMOPREVENCE Přírodní nebo syntetické látky, zasahující v ranných fázích karcinogeneze. Aktivují detoxifikační enzymy, antioxidační účinky - laboratorní a epidemiologické studie q-tokoferol, ß-karoten , vitamin A a retinoidy - zelenina, ovoce Dithiolthiony, sulforaphan - brokolice, květák, kapusta Genistein - sója Epigallocatechine gallate - zelený čaj Curcumin -curry Tamoxifen - antiestrogen - prevence u žen se zvýšeným rizikem vzniku nádoru prsu Nesteroidní antiflogistika (NSAID) - aspirin, piroxicam, sulindac - prevence kolorektálních nádorů Finasteride (blokuje přeměnu testosteronu na androgen) - prevence nádorů prostaty DFMO - difluorometylornitin (blokuje aktivitu ornitin dekarboxyl ázy) - prevence různých typů nád orů Representative members of four classes of new chemopreventive agents, whose mechanism of action is kn own Six patterns for the cyclization of squalene are shown here; numerous other variations exist in nature Oleanolic and ursolic acids Families of Chemotherapeutic Drugs ANTIMETABOLITES Some anticancer compounds act as false substances in the biochemical reactions of a living cell. A prime example of such a drug is methotrexate, which is a chemical analogue for the nutrient folic acid. Methotrexate functions, in part, by binding to an enzyme {orange} normally involved in the conversion of folic acid into two of the building blocks of DNA, adenine and guanine. This drug thus prevents cells from dividing by incapacitating their ability to construct new DNA. METHOTREXATE DNA Examples: methotrexate, fluorouracil, gemcitabine TOPOISOMERASE INHIBITORS Replication of a cells genetic material requires a means to pull the DNA double helix apart into two strands. This separation is typically accomplished with the aid of a special "topoisomerase" enzyme (orange) that temporarily cleaves one strand, passes the other strand through the break and then reattaches the cut ends together. Drugs that inhibit the ability of topoisomerase enzymes to reattach the broken ends cause pervasive DNA strand breaks in cells that are dividing, a process that causes these celts to die. Examples: doxorubicin, CRT-11 ALKYLATING AGENTS Certain compounds (orange) form chemical bonds with particular DNA building blocks and so produce defects in the normal double helical structure of the DNA molecule. This disruption may take the form of breaks and inappropriate links between (or within) strands. If not mended by the various DNA repair mechanisms available to the ceil, the damage caused by these chemicals will trigger cellular suicide. Examples: cyclophosphamide, chlorambucil PLANT ALKALOIDS Certain substances derived from plants can prevent cell division by binding to the protein tubulin. Tubulin, as its name implies, forms microtubular fibers (pink) that help to orchestrate cell division. These fibers pull duplicated DNA chromosomes to either side of the parental cell, ensuring that each daughter cell receives a full set of genetic blueprints. Drugs that interfere with the assembly or disassembly of these tubulin fibers can prevent cells from dividing successfully. Examples; vinblastine, vinorelbine, paclitaxel, doc et axel Expozice buněk velmi nízkými dávkami chemoterapeutik má minimální efekt na viabilitu nebo bun. cyklus díky dostatečným schopnostem reparačního systému opravit poškození. Ve vyšších konc. v závislosti na přítomnosti nebo nepřítomnosti kontr. bodu v G1 (souvisejícího s expresí p53 ) se vyskytují 2 typy odpovědi: ► vpřípadě funkčního kontr. bodu je bun. cyklus zastaven v G1 dokud nedojde k opravě poškození nebo dochází ke spuštění apoptózy při velkém rozsahu poškození (po vysokých konc.) nebo neúspěšné reparaci. ► jestliže je kontr. bod nefunkční (např. při mutaci p53) buňky vstupují do S fáze, ale postup (DNA replikace) je suprimována podle konc. látky. - vpřípadě buněk „primed" kapoptóze, dojde k apoptóze rychle (3-6 h, „immediate apoptosis ") u prahových hodnot konc. , slabě nad těmi, které kompletně inhibují progresi S fáze. - vpřípadě non-pri med buněk prodloužená suprese průchodu bun. cyklem (defective progression) vede k růstové nerovnováze, sekundárním změnám, následnému nastartování a pozdní apoptóze. Tato apoptóza vykazuje často atypické vlastnosti, komlikované růstovou nerovnováhou a sekundárními změnami metabolismu. - při ještě vyšších konc. překračujících farmakologickou dávku dochází k nekróze. Nádorové tkáně mají, analogicky jako normální tkáně, proliferující část populace a část populace neproliferující, která se skládá z klidových buněk v G0 fázi nazývané někdy také populace kmenových neoplastických buněk. Tyto buňky je obtížné zničit, protože jsou rezistentní k cytostatickému působení záření nebo chemoterape dobu po ozáření nebo chemickém působení vstupují znovu do cy k. Určito klu a jsou zdrojem obnovy nádorového růstu. Opakovaná cytostatická terapie a kombinovaná terapie (s využitím humorálních faktorů, imunologickou indukcí, atd.) představují hlavní přístupy jak dostat do cyklu klidové buňky, a pak účinně inhibovat jejich růst. Klíčovou otázkou však zůstává volba nejvhodnějšího časového intervalu mezi jednotlivými aplikacemi (matematické modely). Klidové buňky přežívají mnohem lépe, protože během dlouhého časového intervalu mezi cytostatickým působením a DNA replikací a dělením chromosomů je poškozený genetický materiál reparován. Rychle rostoucí nádory jsou citlivé na cytostatickou terapii, frakce neproliferujících buněk je malá, buňky mají krátkou generační dobu. Opakovaným působením lze převést G0 buňky do cyklu a účinně inhibovat růst (lymfomy, seminomy, některé leukémie). Pomalu rostoucí nádory mají přechod buněk z G0 zásobní populace řízen negativní zpětnou vazbou. Tento mechanismus udržuje vždy minimální hladinu G0 buněk, ze kterých se populace vždy obnovuje. Tyto nádory jsou rezistentní na cytostatickou terapii a je velká pravděpodobnost vzniku rezistentních klonů. Buňky mají dlouhou generační Cell Cycle Progression Normal Defective (delayed apoptosis) No effect (Repair) Cytostasis Necrosis Immediate Apoptosis („Primed" cells) 0 Drug Concentration Generalized scheme illustrating the effects of increasin g concentrations of DNA damaging antitumor drugs, on cell cycle progression and apoposis. Exposure of cells to very low drug concentrations has generally no, or minimal, effect on their viabil ity or cell cycle, most likely due to the fact that the rate of DNA repair exceeds the rate of accumulation of the lesions. At higher drug concentration s, depending on the presence or absence of the G1 checkpoint (which is associated with expression of tumor sepp ressor gene p53) two types of respo nses occur: a) In the presence of a functio ning checkpoint, cell progression through Gl is halted unti l the lesion is repaired. Alternatively, apoptosis is triggered when the d amage is extensive (high drug concentration) or repair unsuccessful. b) If the G1 checkpoimt is malfunctioning (e.g., as in the case of of mutation of p53) the cells do enter S, but the rate of progression (rate of DNA replication) is sup pressed proportionally to the drug concentration. In the case of cells „primed" to apoptosis, apoptosis general ly occurs very rapidly (3-6 h, ^immediate apoptosis ") at th e threshold drug concentration, slightly above that which completely halts their progression through S [De l B i no et al., 1991]. Cell priming to apoptosis may be associated with, am ong other factors, constitutive exp ression of c-myc. In the case of „nonprim ed cells," p rolong ed suppression of cell cycle progression by the drug (^defective progression") leads to growth im balance, secondary changes, their subsequent „priming" (developmet of effecto rs), a nd delayed apo ptosis. Delayed apoptosis may often have atypical features, complicated by growth imbalance and secondary changes in cell metabolism [Kung et al., 1 990]. Necrosi s is seen at still higher dru g concentration , general ly above its pharmacological level. Table 2. Drug Inducers of Oxidative Stress Anthracyclines Epipodophyllotoxins Camptothecins Platinum coordination complexes Bleomycins Alkylating agents Table 3. Potential Mechanisms for A ideh vde Interference of Cancer Therap y Effectiveness Prolong Inhibit Go to Gi transition Checkpoint arrest S G2 M Restriction point block Inhibit drug-induced apoptosis Caspase inhibition Death receptor binding Vhodná strategie pro úspěšnou nádorovou terapii More apoptosis of Cancer cells Less apoptosis of Norma) cells Increased efficacy + reduced toxicity = therapeutic benefit Figure 1 Desirable strategy to achieve therapeutic benefit in cancer therapy. Agents which effectively kill cancer cells are useful to the extent that toxicity to normal cells is tolerated. It is clear that therapeutic benefit can be achieved by increasing apoptosis of cancer cells as well as by lowering toxicity to normal cells upon exposure to anticancer therapy Figure 2. Duel Apt)pt otic Pathways of Chemotherapy Death Receptor Activation Chemotherapy Cellular Damage Cytochrome c Release Caspase 8 Activation Caspase 9 Activation Activated Caspase Cascade APOPTOSIS Cellular damage by antineoplastic agents initiates the process of apoptosis by causing release of cytochrome c from mitochondria or by activation of death receptors. These proapoptotic events result in activation of unique proteases, caspase 8 and caspase 9, which are termed initiator caspases because they activate other caspases (effector caspases) that carry out disassembly of the cell Activation of Apoptosis Pathways by Anticancer Therapy Drugs / Irradiation FADD casp-8 SM AC/ DIABLO y lAP [ casp-3 7 CAD/ICAD DNA Fragmentation 9 "stress pathway - r^ri Noxa Bax Figure 1 Apoptosis pathways in anticancer therapy. Apoptosis pathways can ho triggered through different entry sites, for example, ai the plasma membrane upon crosslinking of death receptors (receptor pathway) or at the mitochondria (mitochondrial pathway). Stimulation of death receptors of the TNF receptor superfamily (DIL-R) such as CD95 (APO-l/Fas) or TRATL receptors by DÍL results in receptor aggregation and recruitment of the adaptor molecule FADD and caspase-8 into a DISC. Caspase-8 becomes activated upon recruitment and initiates apoptosis by direct cleavage of downstream effector caspases. The mitochondrial pathway is initiated by the release of apoptogenic factors such as cytochrome c, or Smac from mitochondria into the cytosol. The release of cytochrome c into the cytosol triggers caspase-3 activation through the formation of the cytochrome tvApaf-l/caspase-9-containing apoptosome complex. Smac promotes caspase activation through neutralizing the inhibitory effects to IAPs. while AIF causes DNA condensation. The receptor and the mitochondrial pathway can be interconnected at different levels, for example, through Bid, a BH3 domain-containing protein of the Bel-2 family, which assumes cytochrome t'-releasing activity upon cleavage by caspase-8. Activation of caspases is negatively regulated at the receptor level by FLIP, which block caspase-8 activation, at the mitochondria by Bel-2 family proteins and by IAPs. AIF, released from mitochondria mediates caspase-independent large-scale DNA fragmentation after translocation to the nucleus Typy buněčné smrti po působení protinádorových terapeutik Kigure 3 Forms of ceil death caused by anticancer drugs (cytotoxic stimuli). At low (subcytotoxic) doses, a drug (or other cytotoxic agents) can arrest cell proliferation without significant cytotoxicity. At higher drug concentrations, apoptosis-prone cells undergo rapid cell death caused by caspase activation. Apoptosis-reluctant cells may either recover or undergo slow cell death. At maximal cytotoxicity, rapid necrosis may occur in any cell types Mechanismy rezistence ke xenobiotikům rezistence může být důsledkem ► snížené vnitrobuněčné koncentrace látky díky změněnému příjmu do nitra buňky, zvýšenému vylučování z buňky nebo rozložení v buňce ► zvýšené buněčné detoxifikace (inakti ► kvalitativních nebo kvantitativních změn buněčného cíle (enzym ► neschopnosti přeměňovat látku na aktivní formu ► zvýšené inaktivace látky ► zvýšené reparace DNA ► poruch v drahách apoptózy Mnoho těchto mechanismů může působit současně a jsou buď přirozeně přítom buňce nebo vznikají de novo během choroby a léčení Vylučování látky z buňky je spojeno s aktivitou specifických proteinů nebo proteinových komplexů uvnitř cytoplasmatické membrány. MDR - "multidrug resistance" k nádorové chemoterapii spojené se zvýšenou expresí Pgp (P170) glykoproteinu - membránová adenosin trifosfatáza (ATPáza) se širokou specifito u. Transportuje endog enní substance (toxiny, metabolity, odpad, hormony atd. ). Farmakologická funkce spočívá v protekci proti cytotoxickým látkám. Mechanismus MDR je posledních 10 let intenzívně studován. B gen MDR1 na chromosomu 7. Tento gen k óduje Pgp a jeho exprese je spojena s MDR fenotypem. O Decreased drug \ .••**• influx ♦ ♦ o ♦ £vV\ Jö^^^on activation V—■^V^^V"'''^^ of the drug ߣr\ ov-.....r0°0° V w ^ o yj/ o o-• • ^ ooo\ • • Drug activation \ Drug inactivation Increased drug efflux Target modification Sequestration^ ^* Reparation Drug Activated drug Inactivated drug Detoxified drug ■ ■ r Detoxification Target inhibition Target amplification Target alteration Buneciie mechanismy |ekove rezisstenc* Regular way of target inhibition ■> Different ways of resista nce Buněčná detoxiflkace Základní roli v rezistenci nádorových buněk k různým cytotoxickým látkám hraje glutation (GSH) - vnitrobuněčný tripeptid obsahující cystein a přítomný v savčích buňkách ve vysokých koncentracích. Zvý šená konjugace s GSH je hl avním mechanismem vývoje rezisten ce. Glutation-S -tranferázy (GST) - čtyři známé izoenzym xifikačních enzymů. Protože katalyzují konjugaci ou hlavní skupinou avním faktorem určují cím senzitivitu buněk. GSH i GST mohou způsobovat rezistenci i jinými mechanismy než konjugací, na GSH může modulovat repar ační funkce DNA a tak kontrolovat rezistenci např. k cisplatině. Využití inhibitorů GSH - indometacin, piriprost Rezistence k chemoterapii zprostředkovaná změnami buněčného cíle Změny topoizomerázy - topoiz. II je zásadní pro replikaci DNA - cíl interkalačních lát jako je adriamycin, actinomycin D nebo neinterkalačních látek jako jsou etoposide nebo teniposide. Rezistence může být způsobena změnou hladiny to enzymu. Změny DHFR (dihydrofolátreduktázy) - cíl antifolátových látek - metotrexát. Zvýšená hladina DHFR je příčinou rezistence. Změny tymidilát syntázy - cíl 5-fluorouracilu. Dva mechanismy rezistence - změny afinity TS k lékům díky substituci j edné aminokyse liny neb o zvýšená ts aktivita. oiz. II nebo i í mutovaného Zvýšené reparační funkce DNA DNA je cílem různých cytotoxických látek. Přímou nebo nepřímou vazbou k DNA způsobují tyto látky změny v DNA a genomové poruchy vedoucí k buněčné smrti. Jednoduchá alkylační činidla se kovalentně váží k DNA - vnitro- i meziřetězcové vazby. Deriváty kovů jako je cisplatina tvoří také podobné vazby. Cisplatina obecně por DNA indukcí vnitrořetězcových vazeb mezi N7 atomy dvou sousedních gu menší míře indukcí meziřetězcových vaz en a m onoaduktů. Další cytotoxické látky jsou schopny nekovalentně se vmezeřovat do DNA. Ačkoliv všechny tyto i nterakce s D NA jsou p otenciálně letální, rozsah buněčné smrti je ovlivňován rozdí ly v rozsahu reparace. Existuje inverzní vztah mezi buněčnou reparací a cytotoxickou senzitivitou. Reparační procesy DNA jsou velmi komplexní a závisí na typu poškození. Jejich regulace se účastní na 200 různých genů. Mají velký význam pro nádorovou chemoterapii, protože jsou zah rnuty v rezistenci k velkému počtu cytotoxických látek, ména těch, které nejsou ovlivněny MDR fenotypem. Tři hlavní typy reparace DNA: Reverze poškození - nejjednodušší biochemický pochod obnovující integritu DNA. O6 alkylguanin DNA alkyltransferáza přispívá hlavním dílem k rezistenci k alkylačním činidlům - inhibice e nzymu významně zesiluje cytotoxické ú činky látek. Bohužel, t zásah může na druhé straně indukov at nádory, protože tento enzym zabraňuje karcinogenním účinkům řady molekul. Excise pošlození specifickými glykosylázami po specifickém poškození bazí s následným vyříznutím DNA a doplněním pomocí pol enzymů je u rezistentních buně k pozitivně regulován Postreplikační reparace umožňuje nápravu vážných poškození DNA. Jestliže nejsou před replikací opraveny, způsobují tato poškození r eplikační blok. Buň ky obnovují syntézu DNA v jiném replikačním bodě. Využití inhibitorů reparace DNA může zlepšit terapii. Inhibice specifických enzymů jako je DNA polymeráza nebo topoizomeráz těchto K úspěšnosti chemoterapie přispívá řada faktorů. Jsou to farmakologické faktory, kte zabraňují adekvátní expozici látkou v místě působení způsob podávání léku - koncentrace a doba a dále morfologické podmínky absorpce, metabolismus, vaskularita a okysl ičování tkáně. Kromě těchto faktorů, které mohou být ovlivněny přizpůsobením režimu, existují různé buněčné mechanismy odpovědné za nízkou či vysokou hladinu rezistence. a MDR cells b Tumour stGin cell Figure 2 | Models of tumour drug resistance, a | In the conventional model of tumour-cell drug resistance, rare cells with genetb alterations that confer multidrug resistance (MDR) form a drug-resistant clone (yello/^. Following chemotherapy, these cells survive and proliferate, forming a recurrent tumour that is composed of offspring of the drug-resistant clone, b | In the cancer-stem-cell model, drug resistance can be mediated by stem cells. In this model, tumours contain a small population of tumour stem cells (red) and their differentiated offspring, which are committed to a particular lineage (blue). Following chemotherapy, the committed cells are killed, but the stem cells, which express drug transporters, survive. These cells repopulate the tumour, resulting in a heterogeneous tumour composed of stem cells and committed but variably differentiated offspring, c | In the 'acquired resistance' stem-cell model, the tumour stem cells (red), which express drug transporters, survive the therapy, whereas the committed but variably differentiated cells are killed. Mutation(s) in the surviving tumour stem cells (yellow) and their descendants (purple) can arise (by mechanisms such as point mutations, gene activation or gene amplification), conferring ad rug-resistant phenotype. As in model a. the stem cell with the aquired mutations could be present in the population before therapy, d | In the 'intrinsic resistance' model, both the stem cells (yello//) and the variably differentiated cells (purple) are inherently drug resistant, so therapies have little or no effect, resulting in tumour grot Ah. Některé parametry lékové rezistence Determinanty dodání léku do cílového místa Determinanty působení léku v cílovém místě Neonkogenni a onkogenni lekova rezistence Non-oncogen ic RESISTANCE Oncogenic resistance 1 10 100 10OQ Drug concentration Figure 1 Nononcogcnic and oncogenic drug resistance- Conventionally, drug resistance is measured by a drug concentration that inhibits cell growth and survival by a certain percent. For example, IC50 is a concentration that causes 50% decrease in cell survival (e.g. in drug-sensitive cells (red line), IC50 is I), In nononcogcnic (blue line) resistance, the dose cytotoxicity curve is shifted to the right. An TC5(> is increased due to a failure of a drug to inhibit its target. In contrast, in oncogenic resistance, IC50 is normal but lC7i} is not achieved. The killing curve reaches a plateau, because a drug (although normally interacts with its target) does not kill the cells Figure 2 Two ways to overcome oncogenic resistance, (a) Oncogeneic resistance, inhibitors of apoptosis (block of apoptosis) prevent cell death, even though anticancer drug engage its target (e.g. microtubules, topoisomerases, DNA), (b) Targeting apoptotic pathways downstream of the block, (c) inhibition of antiapoptotic pathways (releaving a block of apoptosis) restores sensitivity to anticancer drugs Antiangiogenní terapie Hypoxia-Cancer/ activated prodrug Deep hypoxia? Acidosis, necrosis Figure 6 Antiangiogenic therapy, (a) Targeting endothelial cells causes a HlF-dependent response. Sensing hypoxia, cancer cells stimulate angiogenesis. (b) A combination of antiangiogenic and anti-HIF agents may cause profound anoxia and cancer cell death, which could be further enhanced by anoxia-activated prodrugs Cykloterapie Kinase inhibitor /modulator J I Cell survival Growth arrest Reversal of a popto sis-resistance y ^ Cyclo-therapeutic agent Kigure 5 Cyclotherapy. Initially, a normal cell is apoptosis prone, whereas a cancer cell is apoptosis reluctant and resistant to cyclotherapeutic agent. A modulator such as a kinase inhibitor reverses resistance of cancer cells (see Figure 2c). Simultaneously, cells with normal cell cycle control are arrested by the same modulator and therefore 'escape* a cyclotherapeutic agent Liposomes and gene therapy Liposome vector Targeted liposome vector for gene delivery for gene delivery Figure 3. (a) Liposomes for gene therapy, (b) Targeting gene delivery via cellular receptors. Využití LAK (lymphokine-activated killer )buněk v protinádorové terapii MOUSE WITH TUMOR LAX CELLS (lymphokme-activated killer cells), which were first described in 1980, are another experimental anticancer weapon. For study in mice (M/1 )i P r oduction begins wi th ihe removal of the spleen from healthy animals (a^ The lym phones in the spleen are isolated (b) and cultured for three days with inter-leuIdn-2