Materiál na úlohy z GI (BLOKOVÉ PRAKTIKUM LETNÍ SEMESTR)



Izolace restriktáz


 1. 4× 20 ml MPB v Erlenkách 100
 2. 4× 500 ml MPB v Erlenkách 1000
 3. V pátek naočkovat do 20 ml MPB S. aureus PS3A a S. aureus PS96 (krabice 26)
 4. V neděli naočkovat 5 ml do 500 ml MPB a dát třepat při 37° C
 5. sterilní kádinky 25 ml překryté alobalem (6×)
 6. sterilní kádinky 50 ml překryté alobalem (6×)
 7. sterilní válec 100 ml (2×)
 8. sterilní ultracentrifugační zkumavky NALGENE 10 ml  (15 ks)
 9. 500 ml promývacího pufru do 1L lahve s modrým uzávěrem
  + 25 ml 1 M Tris.Cl pH 7,4
  + 13,3 g citran sodný
  + doplnit H[2]O na 500 ml
  + autoklávovat
10. 3000 ml sonikačního pufru do 5L lahve s modrým uzávěrem
  + 30 ml 1 M Tris.Cl pH 7,5
  + 2970 ml H[2]O
  + autoklávovat ve varně ve velkém autoklávu
  + po vychlazení přidat 2,34 ml 2-merkaptoetanolu  (v digestoři, rukavice, respirátor)

11. 4 polystyrénové vaničky na led
12. 50× TAE, agaróza, DNA fágů (3A, 96, 53, lambda), restrikční pufry A,M,H,uni.
13. sterilní Eppendorfky
14. sterilní deion. H[2]O v Eppendorfkách 5×


Materiál na úlohy z GI (BLOKOVÉ PRAKTIKUM LETNÍ SEMESTR)



Modifikace konců DNA a klonování


 1. DNA 4 koaguláza negativních stafylokoků naizolovat týden před praktikem:
Staphylococcus succinus CCM 7314, Staphylococcus sp. CCM 2994,  Staphylococcus sp. CCM 2995,
Staphylococcus sp. CCM 3835
 2. degenerované primery s RE místy pro HSP60: 10× ředěné H279 a H280
 3. materiál na PCR: dNTP, deion. H[2]O, pufr, Taq-poly
 4. QiaQuick PCR Purification Kit
 5. DNA vektoru pBluescript (4×80 µl)
 6. DNA vektoru pBluescript štěpená současně EcoRI a BamHI (4× 25 µl) a přečištěná
 7. materiál na ligaci: ligační pufr, T4-ligáza, deion. H[2]O
 8. kompetentní buňky E. coli TOP10F’ (60 × 200 µl)
 9. LB agar 8× 300 µl
10. IPTG 12 ml zásobního 0,1M roztoku, zamrazit -20°C
11. X-gal 6 ml zásobního roztoku 20 mg/ml v dimethylformamidu! , zamrazit -20°C
12. Ampicilin 100 mg/ml (4× 1 ml)
13. plastové Petriho misky
14. sterilní párátka
15. STET pufr na izolaci plazmidu (100 ml v lahvi s modrým uzávěrem)
16. Izopropanol
17. 10M NH[4]-acetát
18. 50× TAE, restriktázy EcoRI a BamHI, RE pufry, agaróza

Materiál na úlohy z GI (BLOKOVÉ PRAKTIKUM LETNÍ SEMESTR)



Klonování a exprese genu pro bakteriofágový endolyzin



 1. Kompetentní buňky E. coli JM109(DE3) produkující T7 RNApolymerázu (40 × 200 µl)
 2. DNA vektoru pSP72 (4×80 µl)

3.       DNA 4 rekombinantních vektorů

a.       pBluescript SK- (812F1endo)

b.       pBluescript SK- (812endo)

c.       pBluescript SK- (311endo)

4.      Restriktázy KpnI a SacI, PvuI, Alkalická fosfatáza, Rapid ligation pufr, T4 DNA-ligáza

5.       Low melting agaróza, preparativní agaróza (Gibco BRL)

6.      QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen)

7.      SM pufr (5,5 g NaCl, 2 g MgSO4.7H2O, 50 ml 1M Tris-Cl pH 7,4, doplnit do 1 l vodou,
autoklávovat)

8.      bakteriologické hokejky – sterilní

9.      usmrcené buňky Staphylocccus aureus SA812, čerstvě připravené

10.  vodní agar 0,4% rozplněný po 3 ml do Wasrman. zkumavek, 40 ks, autoklávovat

11.  LB agar (4 × 300 ml)

12.  YT médium + 0,3 g glukózy + 1,5 mg thiaminchloridu (2× 300 ml)

13.  2YT médium (4× 20ml)

14.  IPTG (0,1 M roztok)

15.  ampicilin (roztok 100 mg/ml).