Izolace jader z buněk lidské tkáňové kultury


Před začátkem práce je nutno si připravit:

Pracovní roztoky – 1xPBS (k dispozici bude 10xPBS), Sacharózový pufr, Glycerolový pufr

Laboratorní pomůcky – centrifugační kyvety nebo Falconky, pipety a špičky, centrifuga s rotorem
odpovídajícím typu kyvet (dát vychladit na 4°C), eppendorfky, skleněný homogenizátor.


Izolace probíhá v komorové lednici nebo v laboratoři, přičemž je nutné držet vzorky maximálně na
ledu. Všechny roztoky a centrifuga jsou předem vychlazené.


1.      Buňky suspenzní kultury se stočí v centrifugační kyvetě nebo eppendorfce (dle objemu
kultury, pro izolaci je třeba přibližně 10^6 buněk). Podmínky centrifugace: 3 000 RPM/10 min/4°C.

2.      Odstraníme supernatant a sediment rozsuspendujeme v 1xPBS; centrifugace jako v bodě 1.

3.      Odstraníme supernatant, přidáme 5 - 10 ml Sacharózového pufru, sediment rozsuspendujeme
pomocí modré špičky. Centrifugace jako v bodě 1.

4.      Odstraníme supernatant, přidáme 5 - 10 ml Sacharózového pufru, sediment rozsuspendujeme.
Přelijeme suspenzi do vychlazeného homogenizátoru, homogenizujeme (20krát).

5.      Přelijeme homogenát do centrifugační kyvety,  centrifugace jako v bodě 1.

6.      Odstraníme supernatant, rozsuspendujeme sediment v 5 ml Glycerolového pufru. Centrifugace
jako v bodě 1.

7.      Odstraníme supernatant, rozsuspendujeme sediment v 1 ml Glycerolového pufru.

8.      Rozdělíme suspenzi jader po 200 ml do eppendorfek, přeneseme v tekutém dusíku do mrazícího
boxu (-70°C), kde se jádra uchovají.


Sacharózový pufr:                                      koncentrace zásobních roztoků:

0,3M sacharóza                                               prášek (Mr=342,30)

10mM HEPES-NaOH, pH 7,9                         1M HEPES-NaOH

1% Triton X-100                                              100% Triton X-100

3mM CaCl[2]                                                       prášek (Mr=147,02 – dihydrát)

2mM octan hořečnatý                                       prášek (Mr=214,46 – tetrahydrát)


Glycerolový pufr:                                       koncentrace zásobních roztoků:

25% glycerol                                                     100% glycerol

10mM HEPES-NaOH, pH 7,9                           1M HEPES-NaOH

0,1mM EDTA                                                     0,5M EDTA

0,1mM EGTA                                                     0,5M EGTA

5mM octan hořečnatý                                        prášek (Mr=214,46 – tetrahydrát)