Krátké shrnutí základů z Vývojové fyziologie živočichů I Buňka ve vyvíjejícím se embryu musí umět a vědět nejrůznější věci: •vědět kdo je, kde je, kým bude a co bude dalším krokem v jejím buněčném životě •buňka činí rozhodnutí na otázky typu jako: Dělit se? Diferencovat? A v co diferencovat? Migrovat? A kam? Zemřít? • • • Pavlovy movies Co poskytuje buňce tyto informace? •a) signály z okolního prostředí b) transkripční program v jádře jednotlivé signální dráhy modulují transkripci a strukturu chromatinu transkripce určuje citlivost buňky k vnějším signálům (např. regulací exprese receptorů či komponent přenosu signálu) Signály z vnějšího prostředí ruka Notch Signály z vnějšího prostředí ruka Notch TGFb nadrodina má následující podrodiny: 1.TGFb1-3 2.BMPs – 20 různých ligandů 3.GDF (growth differentiation factor): 9 ligandů 4.activin/inhibin/nodal Společným znakem je signalizace přes: - konzervativní rodinu Ser/Thr kinázových receptorů – jsou dvou typů a po vazbě ligandu dimerizují - cytoplazmatická signalizace přes tzv. SMAD proteiny Inhibitory BMP faktorů, jsou klíčové pro fyziologické funkce BMP: •noggin •chordin (Chd) •sklerostin chordin vs chordin vs Přímá fyzická interakce mezi chordinem a BMP je podstatou inhibičního působení chordinu LR assymetry in GDF mutant Figure 2. Analysis of situs defects in Gdf1-/- mice. a, Gdf1 +/- and Gdf1 -/- newborn mice with stomachs (arrowheads) on the left and right sides, respectively. Ventral views of tissues from newborn Gdf1 +/- (b,d,f,h) and Gdf1 -/- (c,e,g,i) mice are shown. b,c, Reversal of the orientation of the abdominal organs in Gdf1 -/- mice. Note also the streak-like appearance of the spleen and the abnormally shaped medial lobe of the liver. H, heart; Lv, liver; St, stomach; Sp, spleen; AC, Signály z vnějšího prostředí ruka Notch Notch and the segmentation clock Signály z vnějšího prostředí ruka Notch Receptorové tyrosin kinázy (RTK) RTKs - simplified scheme of action Schematická struktura jednotlivých receptorů RTK families transmembránová doména tyrosin-kinázová doména extracelulární domény vážící ligand Erk MAP kinase activity is necessary for FGFR3 phenotype in cartilage FGFR3 Ras Raf-1 MEK Erk FRS2 FGF2 C-type Natriuretic Peptide (CNP) over-expression results in skeleton overgrowth in mice CNP wild-type CNP over-expression??? CNP wild-type VEGF in angiogenesis Blood vessel formation and tumor angiogenesis. During development, VEGF induces differentiation and proliferation of endothelial cells from its progenitors (the hemangioblast and angioblast) to form a poorly differentiated primitive vascular plexus (vasculogenesis). Angiopoietin-1 (Ang-1) and other morphogens (e.g. Ephrins-Eph) induce remodeling of the vascular plexus into a hierarchically structured mature vascular system through endothelial cell sprouting, trimming differentiation and pericytes recruitment (angiogenesis). During tumor angiogenesis, angiopoietin-2 (Ang-2) destabilizes the vessel wall of mature vessels. Quiescent endothelial cells become sensitive to VEGF (or other angiogenic factors), proliferate and migrate to form new vessels. Bone marrow-derived endothelial cell progenitors are found in the peripheral blood and can recruit at sites of angiogenesis. Eph/ephrin komplex •ephrin – jsou membránově vázané ligandy (podobně jako ligandy Notch dráhy) •ephriny A – na membráně upevněny pomocí tzv. GPI kotvy •ephriny B – transmembránové ligandy, které samy jsou schopny signálovat do buňky •Eph/ephrin systém je zapojen zejména do „navigace“ buněk (např. buněk cév) či jejich částí (např. navádění axonů v nervové soustavě), a do „contact-mediated cell sorting“ ve vyvíjejícím se embryu. Jde o obecný mechanismus regulující migraci buněk. ephb4 Signály z vnějšího prostředí ruka Notch Wnts (Wingless/Int) - family of ligands - 19 members in human and mouse - glycosylated and palmitoylated extracellular proteins - short range of action, bind to extracellular matrix - only in multicellular animals canonical (eg. Wnt-1 or Wnt-3a) non-canonical (eg. Wnt-5a) Wnt/b-kateninová dráha WNTSignPathFig1 Deplece Wnt/b-kateninové dráhy při gastrulaci = ztráta zadních částí těla wild type Wnt-3a knockout Deplece inhibitorů Wnt/b-kateninové dráhy při gastrulaci = ztráta předních částí těla wild type vs. Dkk1 knockout Molekulární mechanismus ustavení PCP Seifert and Mlodzik, Nature Reviews in Genetics, 2007 Wnt-induced assymetry W-RAMP = Wnt-mediated receptor-actin-myosin polarity Signály z vnějšího prostředí ruka Notch Hedgehog dráha •hedgehog (Hh) u octomilky – název „ježek“ podle fenotypu larvy •u savců jsou tři homology – sonic hedgehod (Shh), indian hedgehog (Ihh) a desert hedgehog (Dhh) hedgehog in Drosophila Sonicrun_2006 Sonic the Hedgehog Shh – jeden z nejlépe popsaných klasických morfogenů (tzv. model francouzské vlajky) – v závislosti na koncentraci morfogenu se spouští odlišné transkripční programy Limb_bud Shh Např. specifikace jednotlivých prstů končetiny Shh in limb Shh limb phenotypes Limb_bud Shh Co poskytuje buňce tyto informace? •a) signály z okolního prostředí b) transkripční program v jádře jednotlivé signální dráhy modulují transkripci a strukturu chromatinu transkripce určuje citlivost buňky k vnějším signálům (např. regulací exprese receptorů či komponent přenosu signálu) 1. HOMEODOMAIN FACTORS Homeodomain – 60aa sequence that interact with DNA, encoded by homeobox in the particular gene. Many homeobox genes regulate segment identity. Homeotic genes cause homeosis – a transformation of one whole segment into another related one, such as antenna into leg. Segment polarity genes – basic shape of segment, same for all segments. Homeotic selector genes – control the differences in segment development via initiation of future developemntal pathways in each segment. TRANSCRIPTION FACTORS -ultimate effectors of the outside-in intercellular signaling -one of the most important molecules in shaping of the embryo -classified in families by DNA-binding domain Antennapedia Bithorax Chinook 1. HOMEODOMAIN FACTORS Two LIM domains fused to DNA-binding homeodomain Islet-1 2. LIM-HOMEODOMAIN PROTEINS (myosin-light chain) Isl1-/- Isl1-/- wt wt sv – sinus venosus ot –outflow tract E9.5 DNA binding region: paired domain with 6 a-helical segments 3. PAX PROTEINS Pax6 (paired box gene 6) Pax6-/- wt E11.5 se - surface ectoderm ms –mesenchymal-like cells rpe – pigmented retinal epithelium ret – retina os – optic stalk ov- optic vesicle nc – nasal cavity ls -lens Bind DNA via zinc-finger motif 4. ZINC-FINGER PROTEINS Dracula fish – loss-of-function mutation in GATA1 – impaired erythroid differentiation Intracellular receptor that function as transcription factors. Lipophilic ligands: steroids, thyroid hormone, retinoid acid. Inactive – Hsp90-bound in cytoplasm, complexed with ligand, - nuclear. 5. NUCLEAR RECEPTOR SUPERFAMILY Retinoid acid signaling in limiting the cardiac progenitor pool (RAR antagonist) precardiac mesoderm cardiomyocytes MyoD+/- Myf-5+/- 6. BASIC HELIX-LOOP-HELIX (bHLH) FACTORS MyoD-/- Myf-5-/- a-actin IHC (smooth and striated muscle fibers) desmin IHC (skeletal muscle fibers, myoblast-like cells) Contain basic DNA binding region and hydrophobic helix-loop-helix region responsible for dimerisation DNA binding domain derived from the prototype gene called transcription factor T. Limb identity factors Tbx4 and Tbx5 7. T-BOX FACTORS Operate via bending DNA to bring regulatory sites with transcriptional complex Sox9 (Sry-Box9) – master inducer of cartilage 8. HIGH MOBILITY GROUP (HMG)-box FACTORS wt Sox9+/- Sox9-/- alcian blue collagen type II IHC 10. RUNT DOMAIN-CONTAINING FACTORS Runx2 (Runt-related transcription factor 2) Runx2+/- Runx2-/- wt 2006- INDUCIBLE PLURIPOTENT CELLS (iPS)