#6 Aktivace vývojových mechanismů u dospělého organismu Osnova: •Kdy a proč se reaktivují procesy spjaté s embryonálním vývojem? •Regenerace – buněčné a molekulární mechanismy •Kmenové buňky – definice, ESCs, adult stem cells, stem cell niche •When things go wrong – tvorba nádorů •Cancer stem cell concept, markery, signální dráhy (...a jsme zpět u velké pětky) • Kdy a proč se reaktivují procesy spjaté s embryonálním vývojem? •odpověď je logická: tehdy, když je potřeba znovu vytvářet struktury poškozené či zničené tj. když je potřeba regenerovat •v lidském organismu běžně regenerují celé tkáně – např. vlasové kořínky (doba „života“ 3-4 roky), krypty v tlustém střevě, epitel plic, krevní buňky nebo játra • salamander regeneration přesto se Schopnosti regenerace se liší mezi jednotlivými organismy hand po amputaci hand po 10 letech blastema (a) Zebrafish caudal fin stained with calcein so that bony fin rays are visible. Scale bar, 200 m. (b) Transverse section through a single fin ray. Hemirays (white arrows) are visible as crescents of bone surrounding mesenchymal tissue (fibroblasts, undifferentiated cells, artery, nerve, melanocytes). The bony rays are surrounded by an epithelium, and the basal layer of the epidermis has been labeled (purple stain and arrowheads). Scale bar, 15 m. (c) Cartoon of a longitudinal section of a single amputated fin ray after formation of the immature blastema. The basal layer of the epithelium is indicated by the dotted line. Cells from the epithelium (light blue) cover the wound (side arrows), forming the wound epidermis and apical epidermal cap (AEC). Cells from the stump mesenchyme migrate distally (center arrow), forming the immature blastema (purple). (d) Cartoon of a longitudinal section of a single fin ray following blastemal reorganization. The basal layer of the epithelium is indicated by the dotted line, the AEC in yellow. The distal blastema (red) is distal to the proximal blastema (dark blue). Proliferating cells from the proximal blastema will migrate laterally, toward the basal epidermal layer (pink), and differentiate as bone forming cells. e, epidermis; m, mesenchyme. During limb growth in vertebrates, an essential first step is the establishment of 'signaling centers', localized areas in the limb bud that contribute to the mechanisms regulating outgrowth and pattern formation by secreting signaling molecules such as Fgfs, Wnts, transforming growth factor (TGF)- s or bone morphogenetic proteins (BMPs), and hedgehogs (Hh). In the zebrafish, gene profiling studies have shown that the expression levels of these and other signaling molecules are regulated during the course of regeneratio Blastéma – masa nediferencovaných pluripotentních buněk, která se vytváří po poškození a dává vznik nové struktuře Morphogenetic pathways (canonical Wnt signalling, Hedgehog, TGF, Notch) are required for regeneration in multiple organisms chick axolotl Wnts in fin regeneration zebrafish Wnts in fin regeneration II Lo Celso, C. L. et al. Development 2004;131:1787-1799 Stejné mechanismy aktivují regeneraci i u savců a lidí. Reya & Clevers 2005, Nature Kmenové buňky •embryonální kmenové (ES) • • • •tkáňově specifické blastocysta vyvíjející se tkáň (orgán) dospělá tkáň a) sebeobnova (selfrenewal) b) multipotence den 0 (2.5% trypsin) den6 den 7 vymytí blastocysty ~den 11 ~den 17 (další cykly trypsinizace) ~den 12 zamražení (0.25% trypsin) parkin1 d5 fcs 20x kopie Parkin-D2-FCS1-20x kopie parkin 3c sr 20x parkin 3a sr 20x parkin3 d5 sr20x parkin3 D2 sr20x žádné kolonie připomínající ES buňky Příprava embryonálních kmenových buněk: Bryja V. et al.: An efficient method for the derivation of mouse embryonic stem cells. Stem Cells, April 2006) chimaera-picture ES differentiation blastocysta vyvíjející se tkáň (orgán) dospělá tkáň In vivo ES differentiation In vitro Pravoúhlý trojúhelník: ontogeneze ontogeneze blastocysta vyvíjející se tkáň (orgán) dospělá tkáň Celso, C. L. et al. Development 2004;131:1787-1799 kmenová progenitorová diferencovaná Klíčové regulátory (Velká Pětka): Wnt, Shh, BMP/TGF, RTK (FGF), Notch Kde jsou adult stem cells a jak vypadají? Reya & Clevers 2005, Nature Prostředí kmenových buněk (stem cell niche) vlasový kořínek Reya & Clevers 2005, Nature Prostředí kmenových buněk (stem cell niche) kostní dřeň Moore & Lemischka, Science, 2006 Prostředí kmenových buněk (stem cell niche) střevní epitel Prostředí kmenových buněk (stem cell niche) střevní epitel – latest developments aneb jak opravdu na to (Barker et al., Nature, October 2007) A. Příprava transgenní myši č. 1 za účelem zjistit, kde je nový potenciální stem cell marker exprimován (in vivo expression profiling). Lgr5 je exprimován specificky v buňkách ve spodní části krypty. Prostředí kmenových buněk (stem cell niche) střevní epitel – latest developments aneb jak opravdu na to (Barker et al., Nature, October 2007) B. Příprava transgenní myši 2, 3 a 4 za účelem zjistit, co všechno vzniká z Lgr5-pozitivních buněk (Lgr5+ lineage tracing). Lgr5 pozitivní buňky dávají vzniknout všem částem buněčného epitelu. Prostředí kmenových buněk (stem cell niche) střevní epitel – latest developments aneb jak opravdu na to (Barker et al., Nature & Sato, Nature 2009) C. Lgr5 pozitivní buňky in vitro dávají vzniknout kompletní villus-crypt struktuře in vitro (Doposud se to s žádnými jinými buňkami nepodařilo) Prostředí kmenových buněk (stem cell niche) střevní epitel – latest developments aneb jak opravdu na to (Barker et al., Nature, October 2007) D. Závěr: Kmenové buňky epitelu tlustého i tenkého střeva jsou protáhlé, dříve nepovšimnuté buňky, v relativní pozici 1´, 2´ a 3´od spodu krypty. Všechno co se říkalo předtím byly jen žvásty J Prostředí kmenových buněk (stem cell niche) Wnt nádorovost Pravoúhlý trojúhelník: ontogeneze ontogeneze blastocysta vyvíjející se tkáň (orgán) dospělá tkáň tvorba nádoru regenerace Cancer stem cell hypothesis Aktivace nádorových kmenových buněk jako důsledek chronického poškození a regenerace Klasické morfogenetické dráhy (Wnt, Hh, Notch a další) regulují regeneraci, tkáňové specifické kmenové buňky i nádory nádorovost Pravoúhlý trojúhelník: ontogeneze ontogeneze blastocysta vyvíjející se tkáň (orgán) dospělá tkáň Počet mutací nutných pro vznik nádoru: 0 teratoma1 teratoma2 Teratomy nádorovost Pravoúhlý trojúhelník: ontogeneze ontogeneze blastocysta vyvíjející se tkáň (orgán) dospělá tkáň Počet mutací nutných pro vznik nádoru: 0 1-5 5 a více Je to pravda? Experimentální důkaz: Vznik malých adenomů, které neprogredují Zkříažení s APC flox/flox myšima + tamoxifen Nekontrolovaná aktivace kmenových buněk má fatální následky Rychlý vznik adenomů a nádorů Zkříažení s APC flox/flox myšima + tamoxifen DMBA-TPA induced tumors DMBA/TPA-induced skin carcinogenesis - benign papilomas, which in some cases progress into squamous cell carcinoma (SCC) DMBA/TPA-induced skin carcinogenesis Malanchi et al. 2008, Nature CD34+ CD34- Malanchi et al. 2008, Nature Malanchi et al. 2008, Curent Opinion in Oncology Cancer stem cell based therapy Cancer_stem_cells_therapy Cancer stem cell based therapy - naděje pro nemocné s nádorem slinivky? •Pancreatic adenocarcinoma - čtvrtý nejčastější důvod úmrtí u pacientů nádorových onemocnění •Median survival - 4-6 months •5-year survival - 1% •Treated with gemcitabine - does not work Cancer_stem_cells_therapy Cancer_stem_cells_therapy gemcitabine Cancer_stem_cells_therapy Nodal gemcitabine Terapie budoucnosti? SDF1/CXCL12 - chemokin, ligand exprimovaný v plicích, játrech, kostní dřeni a lymfatických uzlinách; tj. hlavních cílech metastáz Metastasis driving cancer stem cells