1 KlinickoKlinicko--biochemická diagnostikabiochemická diagnostika 1.1. Kvalitativní analýzaKvalitativní analýza 2.2. SemikvantitativníSemikvantitativní analýzaanalýza ­­ diagnostické proužkydiagnostické proužky 3.3. Kvantitativní analýzaKvantitativní analýza Spektroskopické metodySpektroskopické metody -- AbsorpčníAbsorpční FotometrieFotometrie ­­ UV/VIS (kolorimetrie)UV/VIS (kolorimetrie) -- bar. Látky, NAD(P)Hbar. Látky, NAD(P)H Atomová absorpční spektroskopieAtomová absorpční spektroskopie (AAS)(AAS) ­­ Ca, Mg,Ca, Mg, FeFe,, CuCu,, Mg,Mg, MnMn,, ZnZn, ..., ... -- EmisnEmisníí Plamenová emisní fotometrie (PES)Plamenová emisní fotometrie (PES) ­­ Na, K, (Ca, Mg, Li),...Na, K, (Ca, Mg, Li),... Potenciometrické metodyPotenciometrické metody pHpH Krevní plynyKrevní plyny ­­ pCOpCO22, pO, pO22 Iontově selektivní elektrodyIontově selektivní elektrody ­­ Na, K, CaNa, K, Ca Elektroforetické metodyElektroforetické metody ­­ bílkoviny,bílkoviny, isoenzymyisoenzymy,, lipoproteinylipoproteiny ImunochemickéImunochemické metodymetody ­­ bílkoviny, peptidy, hormony, TDMbílkoviny, peptidy, hormony, TDM Chromatografické metodyChromatografické metody ­­ glykovaný Hbglykovaný Hb, léčiva,, léčiva, metabolity,...metabolity,... Analýza anorganických látekAnalýza anorganických látek 2 PESPES ­­ vzorek se rozprašuje do plamene ( propanvzorek se rozprašuje do plamene ( propan 19251925 °°C,C, acetylenacetylen 30003000 °°C)C) KATIONTY:KATIONTY: NaNa++ , K, K++ , Ca, Ca2+2+ , Mg, Mg2+2+ ,, FeFe,, ZnZn,, ...... AASAAS ­­ řádově citlivější; Ca, Mg,řádově citlivější; Ca, Mg, ZnZn,, CuCu,, AlAl,, FeFe ISEISE ­­ měříměří aktivituaktivitu iontiontů (závisí na iontovéů (závisí na iontové síle, vazbě na bílkoviny asíle, vazbě na bílkoviny a aniontyanionty)) aaMeMe == ccMeMe .. yyMeMe ... molární... molární aamMemMe == mmMeMe .. MeMe ...... molmoláálnlníí HH22OO (P) = 0.93 kg/kg(P) = 0.93 kg/kg yyMeMe (P) =(P) = MeMe (P) .(P) . (H(H22O)/O)/HH22OO(P)(P) NaNa++ (P)= 0.74(P)= 0.74 NaNa++ ISEISE 3 Na+ (128-145 mmol/l), K+ (3.0-5.2 mmol/l) většinou kvantifikovány souběžně 1. PES 2. ISE ­ Na (speciální sklo), K (valinomycinová eloda) 3. fotometrické metody a) Na+ enzymaticky Vyvázání nadbytku Na+: Na+ + kryptand Na+-kryptand 2-nitrofenyl-galaktosid O CH2OH O O2N O CH2OH O2N HONa + -galaktosidasa bezbarvý žlutý c) vazba do chromogenních crown-etherů (18-crown-6) b) K+ enzymaticky PEP + ADP pyruvát + ATP pyruvát + NADH + H+ laktát + NAD+ pyruvátkinasa K+ interference Na+ (Na-kryptand), NH4+ (preinkubace s glutamátdehydrogenasou) NH4 + + -ketoglutarát + NADH + H+ Glu + NAD+ + H2O GD Ca2+ (2.5 mmol/l) volný Vázaný s bílkovinami transport plasmou na albuminu (nespecifická vazba, 12-30 Ca na molekulu Alb, kompetice mezi H+ a Ca2+), vazba na globuliny (Alb/globuliny ~ 7/2), vazba i s HCO3-, laktát, citrát .. Ca2+ -prot 1.25 mmol/l ,,ionizovaný"Ca2+ 1.15 mmol/l,,neionizovaný" Ca (soli, komplexy) 0 1 mmol/l závisí na pH ! 4 Stanovení CaStanovení Ca2+2+ Celkový CaCelkový Ca PES, AASPES, AAS FotometrieFotometrie ­­ tvorba barevných komplexůtvorba barevných komplexů ((alizarinalizarin,, methylthymolovámethylthymolová modř, omodř, o--kresolkresol-- ftaleinkomplexonftaleinkomplexon)) CaCa2+2+ + o+ o--kresolftaleinkresolftalein červený komplex (570červený komplex (570 nmnm)) yyCaCa2+2+ = 0.29= 0.29 KomplikaceKomplikace ­­ koncentracekoncentrace CaCa2+2+ závisí nazávisí na pHpH standardizacestandardizace nana pHpH 7.47.4 Ionizovaný CaIonizovaný Ca -- ISEISE Iontově selektivní membrána:Iontově selektivní membrána: IontoměničeIontoměniče ­­ na bázina bázi organofosfátůorganofosfátů ((dioktylfenylfosfátdioktylfenylfosfát)) Neutrální nosičeNeutrální nosiče s vhodnýmis vhodnými stérickýmistérickými aa elektrostatickými vlastnostmielektrostatickými vlastnostmi Mg2+ (0.65 ­ 1.05 mmol/l), 71% volný, 22% Alb, 7% globuliny Poskytuje barevné komplexy s řadou látek Methylthymolová modř komplex 510 a 600 nm kalmagit fialový komplex 532 nm Enzymové metody (komplex Mg.ATP) Glycerol + Mg.ATP glycerol-3-P + Mg.ADP glycerolkinasa glycerol-P-oxidasa H2O2 D-glukosa + Mg.ATP D-glukosa-6-P + Mg.ADP hexokinasa Glukosa-6-P-dehydrogenasa NADPH 5 Fe (7.16 ­ 28.6 mol/l), 500 - 1600 g/L Stanovení ferritinu 15 - 200 g/L TIBC ­ celková vazebná kapacita 2500 - 4000 g/L nepřímé stanovení transferinu Saturace transferinu nadbytkem Fe, odstranění nadbytku adsorbentem (ionexy, MgCO3), stanovení koncentrace Fe v původním vzorku a po nasycení AAS kolorimetrie Fe2+ - barevné komplexy s řadou látek bathofenantrolin, trispyridyltriazin (TPTZ), ferrozin (3-(2-pyridyl)-5,6-bis(4-fenylsulfonát)-1,2,4-triazin) 1. Disociace Fe z transferinu (kyselé prostředí) 2. Redukce Fe3+ na Fe2+ (hydrazin, hydroxylamin, kys. thioglykolová, askorbová, siřičitan, ... 3. Tvorba komplexů a fotometrie ANIONTY:ANIONTY: ClCl-- (101(101 ­­ 111111 mmolmmol/l)/l) 1. Merkurimetrická titrace 2 Cl- + Hg(NO3)2 HgCl2 + 2 (NO3)nadbytek Hg2+ + bisfenylkarbazon modrý komplex 2. Coulometrická titrace (referenční metoda) titrace Ag+ vznikajících elektrolýzou Ag elektrody, měří se doba rozpouštění elektrody do ekvivalentního bodu) 3. Fotometrické stanovení - thiokyanátová metoda Hg(SCN)2 + 2 Cl- HgCl2 + 2 SCN- 3 SCN- + Fe3+ Fe(SCN)3 ... červený komplex Anorganický fosfor (0.81Anorganický fosfor (0.81 ­­1.551.55 mmolmmol/l)/l) H2PO4 -, HPO4 2(1:1 acidosa, 1:9 alkalosa, 1:4 pH 7.4, 100:1 pH 4.5 v moči) 1. tvorba fosfomolybdenových komplexů v kyselém prostředí - měřeny přímo : (NH4)3[P(Mo3O10)4] ... 340 nm - po redukci na fosfomolybdenovou modř ... 600 nm (kys. askorbová, kys. aminonaftolsulfonová, SnCl2, ..) 6 2. Enzymové metody Schulz: fosfát glykogen fosforylasa glc-1-P fosfoglukosamutasa glc-6-P 6-P-glukonát NADP + NADPH H + + glc-6-P-DH glc-6-P Scopes: fruktosa-1,6-bis-P F-1,6-P-aldolasa glyceraldehyd-3-P ga-3-P-DH NADH 1,3-P-glycerát fosfoglycerátkinasa 3-P-glycerát glc-6-P glc hexokinasa ADP ATPADP NAD + fosfát H +