8. Kombinace chromatografických metod s hmotnostní spektrometrií I. Doprava vzorku - plynový chromatograf (GC) (nejběžnější) - kapalinový chromatograf (LC) (závisí na skupenství, - přímý vstup (DIP) polaritě, tep. stálosti apod.) Plynový chromatograf = zastává roli separátoru Hmotnostní spektrometr = zastává roli detektoru PlynovPlynováá chromatografie (GC/MS) a spec. technikychromatografie (GC/MS) a spec. techniky Technika GC/MS [HOLMES, Morrell 1957, komerčně LKB 1967] Analýza těkavých vzorků ! teplotní limit kolony (max. 300C) ! vzorek separace na koloně hmotnostní detekce Základní části pro plynovou chromatografii GC: KlasickKlasickéé:: FID, ECD apod. nebo MSMS, UV apod. Schematické znázornění analýzy vzorku metodou GC: Typický tvar plynového chromatogramu: t RA .... retenční čas pro složku A t0 .... retenční čas pro neadsorbující t'RA .... redukovaný retenční čas pro složku A se látku (často vzduch) (míra interakce se st. fází pro látku A) (mrtvý retenční čas) GC a MS - srovnatelné nároky na množství vzorku => citlivost přístrojů při velkém dynamickém rozsahu: 2mm 0,5mm GC - 10-2 ­ 510-5 g MS - 10-9 g (ng/cm-3) - MS poskytuje spektrum látek (dodatečná informace) - rychlost snímání spekter vs. časová šířka eluční zóny - možnost (a také nutnost) spojení s počítačem Základní problém = tlakový spád až 9 řádů (103 - 10-6 torr) - separátory, omezovače - ppřříímméé spojenspojeníí ! optimalizace množství látek ! NNááplplňňovovéé kolonykolony 2 mm (20 cm3 atm min-1) Splitter: ventil Separátory: obohacení výstupu z GC (sklo, teflon, membrána, adsorbent apod.) Omezovače: odebírání vzorku z GC (open-split, jet-orifice, restriktor) ! umožňují výměnu kolony bez přerušení vakua ! Obohacovací: E = cMS/cGC [mol m-3] faktor Výtěžnost: Y = QMS/QGC [mol] 100 E = Y/100 VMS/VGC KapilKapiláárnrníí kolonykolony 0,5 mm (5 cm3 atm min-1) Přímé spojení: výměna kolony za chodu nejlépe přes restriktor ! Nutný systém výkonných vývěv (olejová, difúzní, turbomolekulární) ! Odsávání prostoru před IZ, IZ (6 - 8 cm3 atm min-1) = diferenční a detektoru srovnej ( 1 cm3 atm min-1) = jednoduché (podrobněji ­ viz. další slide) kvalita separátorů Dodatek k separátorům: Teflon: hlavně pro He - 200C ­ nepropustný 250C ­ značně propustný Adsorbent: např. slitina Ag-Pd = vysoký průchod pro H2 (stěny) Nutnost:Nutnost: rychlý záznam spekter ­ dnes prakticky všechny MS (magnetický = laminární magnety) odstraněn problém vířivého proudu velké D a vysoký IP (dříve snímání spekter při 20eV) NosnNosnéé plyny:plyny: He, H2 apod. Ionizace:Ionizace: EI, CI ScanScan mmóód:d: Full ­ snímání kontinuálního spektra v intervalu m/z SIM ­ snímání na zvolených hodnotách m/z (vhodné pro kvantitativní analýzu ­ zcitlivění až o 3 řády) Náčrt ukazující relativní rozložení a přibližné relativní velikosti vedení a otvůrků pro tok plynu přes IZ (dokumentováno také diferenční čerpání): separátor, restriktor apod. Schematické znázornění přímého spojení GC/MS: TIC chromatogram reprezentující hmotnostní spektra z analýzy prostřednictvím GC: Výsledek TICTIC (total ion curent)= Ii tzn. Ii !! Lze použít i negativně nabitou elektrodu zařazenou na konec IZ, sbírající z vycházejícího paprsku část nabitých iontů !! Hmotnostní spektra (podle pořadí od začátku měření) získaná při analýze prostřednictvím GC: Výsledek - pokračování base peak base peak Srovnání 2 hmotnostních spekter dokumentujících zkreslení intensity píku následkem nekonstantní tenze par vzorku: Rychlost spektrálního záznamu ==>Nejlépe volit rychlost záznamu 88--1010 scanscanůů na jeden pna jeden pííkk SCAN 1 SCAN 2 Schematický diagram membránového separátoru (plocha povrchu elastomerní membrány je přibližně 1 mm2): Separátory MembrMembráánovnovéé:: nosinosičč:: porézní sklo nebo kov (silikovová, polymerní) Schematický diagram efúzního molekulárního separátoru: Separátory - pokračování EfEfúúznzníí:: snížení tlaku na 1 torr (nebo keramika, kov apod.) Pravidla: nutné molekulární proudění (ne viskózní) (zajištěno, když stř. volná dráha molekul velká ve srovnání s velikostí pórů) velikost pórů 1 m N=k p / M N .... množství plynu k .... konstanta (f vodivosti trubice) p .... parciální tlak složky M .... molární hmotnost složkyWatson,Watson, BiemannBiemann (1964)(1964) Schematický diagram proměnně vodivostního separátoru: Separátory - pokračování VodivostnVodivostníí:: malé otvůrky 0 - 100 m kruhová dráha Schematický diagram tryskového separátoru: Separátory - pokračování JetJet--orificeorifice:: prudká expanze plynu do vakua, tzv. supersonická frakcionace molekul Pravidla: nutné difúzní proudění (viskózní) (Grahamův z.) pro každou složku D a f (M) => rychlý průchod => zabránění rozkladných procesů o horké stěny a možnému zkreslení RT expanze optimalizováno na daný vzorek a nosný plyn (olejové) ca 10-2 torr ! Nutný znatelný rozdíl Mplyn a Mvzorek => často He jako nosný plyn ! až 90% odstranění nosného plynu (tryskový) RyhagRyhag (1964)(1964) Schematický diagram otevřeného napojení: Interface OpenOpen -- splitsplit:: kapilární omezovač (restriktor) odváděcí plyn - do MS projde pouze definované množství látky - dominantně odchází rozpouštědlo a jiné nežádoucí látky (otevřené napojení) existuje také spojení kapilární kolony přes širší kapiláru do jiné Schema SSL 71 split/splitless injektoru: Split ­ splitless injektor Dnes Použití kapilárních kolon - díky diferenčnímu čerpání výkonnými turbomolekulárními pumpami - existuje široké spektrum polarity kolon s libovolnými parametry (délka, tloušťka filmu stac. fáze apod.) - nejlépe využít katalogů firem v tištěné nebo elektronické podobě (CD, DVD) nebo Internetu (např. J&W Scientific) ­ následující průsvitky NNáásleduje:sleduje: -- definice polaritydefinice polarity -- parametry kolonparametry kolon -- vhodnost pro typy lvhodnost pro typy láátektek -- referenreferenččnníí analýzyanalýzy J&W Scientific nepolární středně polární polární Čeho se vyvarovat? Krvácení kolony: - depolymerizace organických polymerů ze stacionární fáze - zvyšování pozadí a interference s komponentami o nízké c - nelineární nárůst s teplotou (! nepřeračovat povolenou teplotu !) Septum: ftaláty apod. zvyšují pozadí a interferují s komponentami o nízké c Problémy: malá těkavost => kontaminace vnitřních prostorů MS (IZ, iont. opt.) (t 150C) neoptimální fokusace elektrické přerušení nebo výboj Při analýze: aplikace větší koncentrace analytu odečet pozadí od vzorku (dnes zajišťováno automaticky při měření) Využití: vnitřní standard pro kalibraci MS (známé hmoty ­ 207, 281, 355 apod., 149 atd.) Kondiciování kolony: t = o 20 - 25C vyšší než při běžných analýzách Rozpouštědlo:často prostorový náboj - zamezení ventilem - měření až po odchodu rozp. trpí také filament (! na agresivní látky ­ azidy apod. !) MS a FID Preferentní použití FID - nezkresluje MS - TIC ­ poloha signálů ve spektru nemusí dát spolehlivou representaci složení vzorku (diskriminace) Příčiny: - použití efúzního (difúz.) separátoru - složky o nižší M méně zastoupeny - elektronový násobič ­ citlivý k rozdělení m/z v TIC (hmoty se mění od složky ke složce) - každá složka má jiný srážkový pro různá ionizační média a podmínky nejlépe kombinovat obojí Další poznatky -pro koncentrované vzorky využít raději split než separátor (protože např.) -pozor na možné reakce látek s povrchem separátoru nebo interface (silanizace, teflon) a na tepelný rozklad o stěny (teplota pece) Derivatizace: analýza málo těkavých látek a zamezení fragmentace Léky: analýza metabolitů ­ mnohdy komplikované Derivatizace Princip: převedení analyzované látky na těkavější sloučeninu Činidla: - silyly trimetylsilyl (TMS) terciální butyldimetylsilyl (BDMS) ROH R-OSi(CH5)2But - acetyl, triflouracetyl, metylestery apod. (! někdy ale výsledný produkt neposkytne dobrou strukturní informaci !) ==> pak - jiná činidla vznik O-metyloximů z aldehydů a ketonů vznik těkavých cyklických boronátů z vicinálních a 1,3-diolů apod. (! Stabilní molekulární ionty a strukturně důležité fragmentační ionty !) Faktory pro volbu derivátu: Musí být dosažena účinná GC separace Skupina derivátu má mít malý hmotnostní přírůstek Skupina derivátu musí dát významné vysokohmotnostní ionty Někdy lze vysokohmotnostní skupinu využít na odlišení analytu od interferujících píků z krvácení kolony Některé obecně používané deriváty pro GC/MS a jejich odpovídající hmotnostní přírůstky Další chromatografické metody SFCSFC - ještě větší tlakový spád (kapilární omezovače ­ Pt kapilára 2-10 m) 200 - 450C - suprekritické fluidum = mobilní fáze kapalina plyn TLCTLC - [Kaiser 1969] - OFF line - seškrabání sorbentu se skvrnou a analýza jako pevný vzorek - seškrabání sorbentu se skvrnou a extrakce ­ pak GC - ON line - ohřev skvrny plamínkem a GC (Kaiser) Head space - statická extrakce plynem - rovnováha plynu s kapalinou (uzavřená nádoba) - zavedení nekolika l parní fáze - ! na rozmytí píků (kvantum látky) => zařazení předkolony Flash - velmi rychlá GC - t nárůst až 100C/s => aplikace modifikované pece => kolona upravena ­ plot technologie (max. 6m) => detektor ­ nová technologie (rychlá odezva) (Light Scattering detector apod.) - stejné průtoky jako u klasické GC, ale plyn předehříván - dělení dáno rychlým t režimem => velmi úzké píky (např. PCB ­ 25s) ! problém = obtížná T desorpce nebo rozklad ! ! syntéza vlastností GC a LC ! zamezení podchlazování při expanzi př. analýza PCB (Delor 103) Identifikace v knihovně spekter NIST