ITP Stanovení aniontů ve vybraných minerálních vodách Minerální voda, zkráceně minerálka, je voda se zvýšeným obsahem minerálních látek. Má v jednom litru vody více než 1 g rozpuštěných minerálů, či přes 1 gram rozpuštěného CO[2], či obsah Rd, H[2]S, jódu, As, Fe. Dále obsahují množství kationtů jako K, Na, Ca atd. a množství aniontů jako SO[4], PO[4], F, NO[3], NO[2] apod. Obsah aniontů ve vodách a především ve vodách pitných je důležitým kriteriem hodnocení jejich kvality. IZOTACHOFORÉZA Úvod Izotachoforéza patří mezi elektromigrační separační metody, které využívají rozdílné pohyblivosti iontů v elektrickém poli. Od ostatních elektromigračních metod se liší tím, že vzorek je dávkován mezi dva elektrolyty - vedoucí (,,leading L“) a koncový (,,terminating T“). Pro jejich výběr platí: Během jedné analýzy mohou být separovány pouze ionty jednoho znaménka, buď anionty, nebo kationty. Izotachoforetický proces začne probíhat po připojení systému k elektrickému poli. Hodnoty konstantního proudu se pohybují v řádu desítek µA. Proces analýzy můžeme rozdělit na dvě části. Nejprve dochází k oddělení složek vzorku, přičemž jednotlivé částice migrují ve směsné zóně různými rychlostmi. V druhé části, kterou můžeme považovat za ustálený stav, se částice rozdělí a všechny se pohybují stejnou rychlostí. Obr.1 Dynamika separace směsi složek A a B, pro které platí je ukázána na obr. 1. Během separace se rychlejší částice dostávají dopředu a pomalejší se zpožďují. Po ustálení vzniká stacionární stav, ve kterém jsou již zóny poskládány podle pohyblivosti svých částic. Mezi zónami vzniklo ostré rozhraní a dále se pohybují všechny stejnou rychlostí (koncentrace iontů v každé zóně je konstantní). Ostré rozhraní mezi jednotlivými zónami ve stacionárním stavu se popisuje pomocí tzv. samozaostřovacího efektu. Všechny ionty, ať pohyblivější nebo ty méně pohyblivé se pohybují stejnou rychlostí. Je to způsobeno rozdílným potenciálovým spádem v každé ze zón. Tento potenciálový spád je tím vyšší, čím méně pohyblivé ionty se v zóně nacházejí. To znamená, že na pomalejší ionty působí větší hnací síla. Analýza minerálních vod Kvantitativní a kvalitativní stanovení aniontů v minerálních vodách se provádí pomocí kapilárního elektroforetického analyzátoru EA 100. Stanovovat budeme anionty NO[3], SO[4], F, PO[4]. V této práci bude používáno jednokolonové uspořádání. Bude použita pouze spodní analytická kolona pro urychlení analýzy. Detekce je konduktometrická a podle zájmu i UV detekce složek vzorku. ÚKOL 1. Změřit neředěný vzorek minerální vody (každý bod bude měřen 3x) 2. Změřit 3 neznámé vzorky minerálních vod metodou přídavku standardu pro každý aniont (každý vzorek měřit 3x) 3. Identifikovat zóny jednotlivých aniontů a kvantifikovat POSTUP 1) Příprava vedoucího a koncového elektrolytu Vedoucí elektrolyt: vypočítáme navážky pro koncentrace 10·10^-3M Cl^-, 3·10^-3M BIS-TRIS propan, 10·10^-3M β-Alanin pro objem 250 ml, rozpustíme je v kádince asi ve 200ml vody. pH vedoucího elektrolytu upravíme na hodnotu 3,6. Pak přidáme 25 ml 1% HEC (hydroxyethyl-celulóza) a doplníme do 250 ml odměrné baňky. Koncový elektrolyt (10·10^-3M citronan lithný): připravíme do 100 ml odměrné baňky reakcí hydroxidu lithného a kyseliny citrónové. Rozpustíme předem vypočítané množství těchto látek v destilované vodě. pH neupravujeme, je adjustováno protiiontem z vedoucího elektrolytu. 2) Úprava vzorku Připravíme si vzorky minerálních vod. Do tří odměrných baněk (25ml) napipetujeme 10 ml vzorku minerální vody a zředíme do plného objemu. V případě analýz minerálních vod je nutno zbavit vzorek volného oxidu uhličitého zahřátím nebo ultrazvukem, tyto obměrné baňky tedy necháme chvíli v ultrazvukové lázni. 3) Příprava standardních roztoků Připravíme si sadu standardů o koncentraci 5 mmol/l pro každý z měřených aniontů (NO[3], SO[4], F, PO[4]). Použijeme chemikálie dostupné v laboratoři a co největší čistotě. 4) Metoda přídavku standardu Vzhledem k práci s reálnými vzorky bude používána ke kvantifikaci metoda přídavku standardu. Každý vzorek minerální vody bude proměřen samostatně, s prvním přídavkem standardu a s druhým přídavkem standardu. Metodu přídavku standardu použijeme u všech tří vzorků minerální vody pro všechny anionty. V prvním přídavku standardu bude koncentrace příslušného aniontu 0,2mmol/l, v druhém přídavku bude koncentrace příslušných aniontů 0,42mmol/l. 5) Vlastní měření Podle přiloženého návodu připravíme přístroj k měření. Zvolíme optimální metodu (v našem případě metodu určí vyučující) a pomocí programu ITPWin provedeme analýzu. Vzorek minerální vody bude proměřen nejprve neředěný, ředěný 2,5x z první odběrné baňky, dále s 1. přídavkem standardu a s 2. přídavkem standardu. Získané výsledky graficky zpracujeme a spočítáme množství jednotlivých aniontů v neznámých vzorcích minerálních vod. Návod k obsluze kapilárního elektroforetického analyzátoru EA 100 1. Příprava přístroje Před začátkem práce je nutné celý systém promýt destilovanou vodou: a) destilovanou vodou naplníme rezervoáry TE a CE 2 b) injekční stříkačku naplněnou destilovanou vodou vložíme do otvoru IN column 2, otevřeme kohout 2 a mírným přerušovaným stlačováním injekční stříkačky proplachujeme kolonu. Během tohoto proplachování je dávkovací kohout v poloze A. Průtok kontrolujeme tak, že voda nám hadičkou proudí do odpadu. Injekční stříkačku po proplachu nevyndáváme a pod tlakem pomalu kohout 2 uzavřeme. Kolona je nyní naplněna vodou. !! Rezervoáry jsou od kolony odděleny pomocí tenkých membrán, příliš velký tlak při plnění by mohl způsobit jejich protržení, proto pracujte opatně a jemně !! Polohy dávkovacího kohoutu: d) nyní propláchneme dávkovací kohoutu: naplníme rezervoár TE destilovanou vodou, otočíme dávkovací kohout do polohy B a sledujeme, zda voda odtéká do odpadu. V případě, že neodtéká, zkontrolujeme, zda máme rezervoár uzavřen víčkem a pomocí prázdné injekční stříkačky vytvoříme mírný přetlak. e) když máme celou kolonu propláchnutou destilovanou vodu, odsajeme ji z rezervoárů CE 2 pomocí prázdné injekční stříkačky se zúženým nástavcem. Z kolony ji odstraníme tak, že vyndáme stříkačku s destilovanou vodou ze střední části kolony, vyprázdníme je a vložíme je zpět na původní místa ,,naplněné vzduchem“ (kohout 2 je uzavřený). Dávkovací kohout máme opět v poloze A. Otevřeme kohout 2 a při mírném přerušovaném stlačování injekční stříkačky v otvoru IN column 2 pomalu odstraňujeme destilovanou vodu ze spodní kolony. Voda nám proudí do odpadu. Kohout 2 uzavřeme. Rezervoár TE vyprázdníme pootočením dávkovacího kohout do polohy B (zároveň tím kohout promyjeme). Popisek se šipkou doprava: Horní kolona Popisek se šipkou dolů: Kohout 1 Popisek se šipkou doprava: Kohout 2 Popisek se šipkou doprava: Spodní kolona Popisek se šipkou doprava: Zásobník na vedoucí elektrolyt CE 2 Popisek se šipkou doprava: Zásobník na vedoucí elektrolyt CE 1 Popisek se šipkou doprava: Zásobník na koncový elektrolyt TE 2. Plnění a příprava na analýzu a) koncový elektrolyt naplníme do horního rezervoáru TE tak, aby byla ponořena elektroda (dávkovací kohout je v poloze A). Pootočením dávkovacího kohoutu do polohy B necháme odtéct malé množství koncového elektrolytu do odpadu, kvůli eliminaci možných vzduchových bublin (neteče-li použijeme přetlak) a kohout vrátíme do polohy A. b) rezervoár CE 2 naplníme vedoucím elektrolytem, dáváme pozor, aby se nevytvořili bublinky. c) injekční stříkačku naplníme vedoucím elektrolytem a umístíme ji do otvoru IN column 2. Při naplňování postupujeme stejně jako při proplachování. Kolonu naplníme a pod tlakem kohout 2 uzavřeme. Musíme zkontrolovat, zda nám v kapiláře ve spodní koloně nezůstaly žádné vzduchové bublinky. Znemožnily by sepnutí elektrického obvodu. Injekční stříkačku po celou dobu práce nevyndáváme. V případě vzniku bublinek je buď pulzně odstraníme, nebo v nejhorším případě znovu ,,promyjeme vzduchem“ a opět naplníme elektrolytem. Pomocí krytů všechny rezervoáry zašroubujeme. Popisek se šipkou doprava: IN column 1 Popisek se šipkou doleva: IN column 2 !! Pozor na vzduchové bubliny!! Popisek se šipkou nahoru: Dávkování vzorku, vzorek se dávkuje s kohoutem v poloze A Obdélníkový popisek: Pracovní poloha dávkovacího kohoutu (poloha C) po nadávkování vzorku a koncového elektrolytu. Připraven k analýze. 3. Příprava řídícího počítače a injektáž vzorku a) zkontrolujeme připojení jednotky EA 100 a řídícího počítače do sítě. Na izotachoforetickém přístroji zapneme spínač umístěný vzadu vlevo dole. Naskočí displej vodivosti. b) zapneme řídící počítač (není-li už zapnut) a spustíme program ITPWin umístěný na ploše počítače. Otevře se nám okénko Main ITPWin Window, kde zvolíme MEASURE. c) naskočí nám měřící okno, kde v horní nabídce vybereme METHOD a zvolíme požadovanou metodu. V našem případě je to metoda d) připravený vzorek nasajeme do injekční stříkačky a vložíme do otvoru v horní části separační jednotky. Dávkovací kohout máme stále v poloze A. Vstříkneme malé množství vzorku, které necháme protéct do odpadu. Nyní nastříkneme vzorek již na měření. Dávkovací kohout pootočíme do polohy B a sledujeme, zda v zásobníku TE ubývá elektrolyt, po pár mm přepneme do polohy C. Teď je systém připraven pro analýzu. e) dávkovací kohout máme tedy v pracovní poloze C a zavřeme dvířka přístroje. Analýzu spustíme příkazem START. Rozsvítí se červená kontrolka HIGH VOLTAGE signalizující zapnuté napětí. !! V žádném případě neotvíráme dvířka při probíhající analýze (při svítící kontrolce HIGH VOLTAGE)!! Poznámka: V případě, že se v systému objeví vzduchové bublinky, analýza se nerozběhne a počítač nás buď upozorní, že se stala chyba. Je třeba systém opětovně propláchnout vedoucím elektrolytem a znovu nadávkovat vzorek. !! Po doběhnutí analýzy otevřeme dvířka a dávkovací kohout musíme vrátit do polohy A!! f) v prvním kroku probíhá předseparace v horní koloně (Upper), na obrazovce sledujeme postupující čas, velikost proudu a velikost napětí. Zároveň se zaznamenává konduktometrická křivka detektorem umístěným na horní koloně g) po přepnutí na dolní kolonu (Lower) se objeví analogický panel. Po skončení analýzy se program automaticky zastaví a zeptá se na uložení. Dávkovací kohout otočíme zpět do polohy A a připravíme pro další analýzu. Naměřená data tedy uložíme a později zpracujeme. 4. Příprava opakované analýzy a) dávkovací kohout máme v poloze A, obě kolony propláchneme stejným způsobem jako při naplnění kolony. Na propláchnutí kolony stačí přibližně 2 ml vedoucího elektrolytu z injekčních stříkaček. Nadávkujeme vzorek, pootočíme dávkovací kohout do polohy B, necháme odtéct trochu koncového elektrolytu a otočíme do pracovní polohy C. V horním panelu spustíme Start. !! Před každým dávkováním vzorku injekční stříkačku propláchneme destilovanou vodou, kontrolujeme, zda se nám do kolony nedostali bublinky!! 5. Ukončení analýzy a) po naměření poslední analýzy vypneme spínač na zadní straně b) roztoky vedoucího elektrolytu odsajeme z rezervoárů pomocí stříkačky s nástavcem a z kolony jej vytlačíme pod tlakem prázdnými injekčními stříkačkami do odpadu, poté promyjeme destilovanou vodou stejně jako v předchozích případech. c) všechny použité injekční stříkačky propláchneme destilovanou vodou a uložíme. Odpad z nádobky vylijeme a pomocí krytů zašroubujeme všechny rezervoáry. Poznámka: Celý systém zůstane naplněný destilovanou vodou 6. Vyhodnocení výsledků a) v hlavní nabídce otevřeme okno LOWER detektor a vybereme naměřený soubor. b) po zobrazení grafu označíme ve spodní nabídce IdealGr (grafem se proloží ideální tvar a číselným označením píků). V horní nabídce ANALYZE zvolíme ZoneTable a zobrazí se nám tabulka s čísly píků, pro pík odpovídající kyselině glutamové odečteme délku (Lenght). c) do grafu vynášíme délku píku v závislosti na koncentraci příslušných aniontů. Množství neznámého vzorku získáme pomocí extrapolace přímky z rovnice regrese. Nezapomeňme vynásobit příslušnou koncentraci ředěním!!