Molekulární biologie (přednáška JS 2011, 3 hod) prof. RNDr. Jiří Doškař, cSc. Molekulární biologie - předmět studia • Vědní obor zabývající se studiem vztahu struktury a interakcí biomolekul, zvláště informačních biomakro-molekul, k funkcím a vlastnostem živých soustav. • Cílem molekulární biologie je vysvětlit funkce a vlastnosti živých soustav strukturou a interakcemi jejich molekul (makromolekul). • Tento vztah vysvětluje z komplexního hlediska integrujícího fyzikální, chemické a biologické přístupy. Studium procesu, které probíhají v živých soustavách na molekulární úrovni a jimiž se realizuje genetická informace Definice pojmu „Molecular Biology" - is the study of the structure and function of biological molecules. - field of biology that studies the molecular level of organization. - study of the molecular basis of life including the biochemistry of molecules such as DNA, RNA and proteins and the molecular structure and function of the various parts of living cells - a branch of biological science that studies the biology of a cell at the molecular level. Molecular biological studies are directed at studying the structure and function of biological macromolecules and the relationship of their functioning to the structure of a cell and its internal components ... - the science of studying the genetic composition and mechanism of living organisms at the molecular level. The molecular studies of all other organic molecules like proteins, fats, and carbohydrates is called biochemistry. - the study of molecules that are found in cells. - field of biology that concerns itself with understanding the interactions among the molecules of life. - a general term referring to study of the structure and function of proteins and nucleic acids in biological systems. Vznik a vývoj molekulární biologie umožnily tři základní objevy 1. Poznání struktury a funkce nukleových kyselin (DNA a RNA) 2. Rozluštění genetického kódu 3. Poznání procesů, jimiž se realizuje genetická informace (transkripce, translace, regulace genové exprese) Specifické rysy historie molekulární biologie 1. Zaměření molekulární biologie na řešení genetických problémů 2. Návaznost molekulární biologie na biofyziku, fyzikální chemii, biochemii, mikrobiologii a genetiku 3. Vznik molekulární biologie v podobě molekulární genetiky syntézou funkcionalistické a strukturalis-tické koncepce ve výzkumu proteinů a nukleových kyselin Vznik molekulární biologie v podobě molekulární genetiky syntézou funkcionalistické a štrukturalistické koncepce ve výzkumu proteinů a nukleových kyselin Strukturalisté (fyzici, chemici) - zaměření na objasnění struktury biomakromolekul (proteinů, NK) (nezajímali se o funkci biomakromolekul ani genetickými problémy) W. T. Astbury J.D. Bernal L. Pauling E. Chargaff M.H.F. Wilkings F. H.C. Crick Funkcionalisté (biochemici, mikrobiologové, genetici) - zaměření na vysvětlení, které biomakromolekuly jsou nositeli genetické informace a jaké funkce plní (objektem studia byly bakterie a bakteriofágy) M. Delbrück, E. Schrödinger, G.W. Beadle, E.L. Tatum O.T. Avery, C.M. MacLeod, M. McCarty, J. Lederberg, A.D. Hershey, J.D. Watson Důležité etapy ve vývoji molekulární biologie • 1944 - transformace bakterií pomocí purifikované DNA • 1953 - model struktury DNA (J. Watson, F. Crick, M. Wilkins) • 1956 - genetická informace v DNA je zapsána pořadím bází • 1958 - při replikaci se oddělují komplementární vlákna DNA • 1958 - izolace DNA-polymerázy I a syntéza DNA in vitro • 1958 - vyhlášení ústředního dogmatu molekulární biologie • 1960 -objev mRNAa důkaz její funkce • 1961 - mRNA použita k rozluštění genetického kódu • 1961- experimentální důkaz ústředního dogmatu MB • 1961 - postulování operonové teorie - regulace genové exprese • 1966 - kompletní vyřešení genetického kódu • 1970 - izolace prvního restrikčního enzymu • 1970 - objev reverzní transkriptázy u retrovirů • 1972 - příprava prvních rekombinantních molekul DNA in vitro • 1973 - začátek klonování genů - základ GI Důležité etapy ve vývoji molekulární biologie • 1975 - Asilomarská konference-moratorium na práce s rekombinantní DNA 1977 1977 1977 1981 1982 1983 - proj ■ první rekombinované molekuly nesoucí savčí geny ■ objev složených genů (sestřih pre-mRNA) zavedení metod sekvenování DNA - objev katalytické aktivity RNA komerční výroba lidského inzulinu z bakterií stanovení sekvence DNA bakteriofága A ekty sekvencování genomů modelových organismů Genomická a postgenomická éra • Analýza sekvencí genomů • Vztah genomu k proteomu • Bioinformatické přístupy Současná etapa molekulární biologie Oblast výzkumu O analýza genomu (genomika) a proteomu (proteomika) O studium regulace genové exprese a procesů diferenciace buněk (buněčný cyklus, signální dráhy, poruchy regulace, výzkum kmenových buněk) O neurobiologie O molekulární evoluce O molekulární mikrobiologie, virologie, imunologie, fyziologie... • Praktické aplikace O genové inženýrství - moderní biotechnologie, příprava trans-genních organismů a nových látek cílenou změnou genů O molekulární diagnostika infekčních, dědičných a nádorových chorob, nové způsoby jejich léčby O farmakogenomika - léky „šité na míru" O genové terapie = léčba genetických onemocnění Sylabus přednášky z Molekulární biologie (JS 2011) 1. Úvodní přednáška. Předmět studia molekulární biologie, její vznik a hlavní etapy vývoje. Struktura a funkce nukleových kyselin 2. Genetická informace, genetický kód, definice genu, typy genů, struktura a informační obsah genomů 3. Replikace DNA (zúčastněné enzymy a mechanismus) 4. Transkripce u prokaryot a eukaryot, posttranskripční úpravy RNA, 5. Translace, transferové RNA, ribozomy, kotranslační a posttranslační procesy, samosestavování 6. Regulace genové exprese u prokaryot a eukaryot, struktura a vlastnosti regulačních molekul a regulačních sekvencí, pozitivní a negativní regulace, atenuace, specifické rysy regulace genové exprese u eukaryot. Regulace na posttranskripční úrovni. Sylabus přednášky z Molekulární biologie 2009 7. Molekulární základ tvorby imunitních molekul 8. Změny genetické informace, mutace, obecná a místně specifická rekombinace. Reparace mutačně poškozené DNA 9. Mobilní elementy (prokaryotické a eukaryotické transpozony, retrotranspozony) 10. Základy genového inženýrství, příprava transgenních organismů a jejich využití, mutageneze in vitro, příprava biopreparátů metodami GI, genové terapie Doporučená literatura • Rosypal S. a kol.: Úvod do molekulární biologie. I.-IVdíl. Brno 1999-2002 (třetí vydání). 2006 - I. díl (čtvrté vydaní) • Rosypal S. a kol.: Terminologie molekulární biologie, Brno 2001. • Šmarda J. a kol.. Metody molekulární biologie, Brno, 2005. • Lewin B. Genes VII, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo 2002. • Alberts et al.: Molecular biology of the cell. Garland Publ. 2004. • Alberts a kol: Základy buněčné biologie, Espero, 2000, 2005. • Clark D.: Molecular biology, Elsevier, 2005. • Watson J.D. et al., Recombinant DNA, 2nd ed., W.H.Freeman, New York 1992. • Snustad D.P., Simmons M.J.: Genetika (překlad originálu Principles of Genetics), MU Brno, 2009 • Předlohy k přednáškám: IS MU i von DO MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE Stanislav Rosypal Díl první VSTUP DO MOLEKULÁRNÍ BIO LOGIK • MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE PROKARYOTICKÉ BUŇKY BRNO 2006 ČTVRTÉ (INOVOVANÉ) VYDÁNÍ !ik .J 1/ iiJ ilfl,. !_ Jgr lJJ.J_J Stanislav Rosypal &kol. CESKE ODBORNÉ TERMÍNY, JEJICH DEFINICE A ANGLICKÉ EKVIVALENTY BRNO 2001 PRVNI VYDÁM METODY MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE Jan Šmarda, Jiří Doškář, Roman Pantůček, Vladislava Růžičková, Jana Koptíková GENETIKA Důkaz, že genetická informace je uložena v DNA Nepřímé důkazy: - DNA se nachází v chromozomech, RNA a proteiny jsou i v cytoplazmě - Množství DNA v somatických buňkách koreluje s počtem sad chromozomů, v pohlavních buňkách je množství DNA poloviční - DNA je stabilnější než RNA nebo proteiny Přímé důkazy: - Transformace u Streptococcus pneumoniae - změna virulence - Analýza bakteriofága T2 - do bakteriální buňky vstupuje jen DNA, nikoliv proteiny -U viroidů a některých virů je nositelkou genetické informace RNA Experiment demonstrující transformaci bakteriálních buněk Streptococcus pneumoniae (Griffith 1928) S buňky = virulentní, tvoří hladké kolonie, R buňky = avirulentní, tvoří drsné kolonie Živé buňky R Usmrcené buňky S Živ a usmrcené buňky S myš umírá na pneumonii myš je zdravá myš je zdravá myš umírá na pneumonii hladké kolonie drsné kolonie žádné kolonie drsné a hladké kolonie Princip transformace Donorová buňka ^ ^ ^ Recipientní buňka přijímá volnou DNA Lýze buňky, uvolnění DNA, RNA a proteinů Začlenění přijaté DNA do genomu recipientní buňky, změna znaku (= transformace) Důkaz transformace S. pneumoniae (Sia a Dawson, 1931) živé bakterie typu HR kolonie typu rostoucí v kultivačním médiu tepelně usmrcené bakterie typu HIS v kultivačním médiu tepelně usmrceny typ HIS plus živý typ II R rostoucí v kultivačním médiu Důkaz, že chemickou substancí zodpovědnou za transformaci buněk R na S je DNA (O. Avery, C. Mac Leod, M. McCarty 1944) \ Přidání ^ RNázy \ Extrakt z buněk S (obsahuje DNA, RNA a proteiny) Přidání proteázy _I_ Kultivace Přidání DNázy s buňkami R Potomstvo R buněk vytváří R kolonie a S kolonie Potomstvo R buněk vytváří pouze R kolonie Záver: transformující aktivitu vykazuje pouze DNA, ne RNA nebo proteiny Struktura DNA navržená Watsonem a Crickem (1953) Vlastnosti struktury DNA umožňují: 1. Replikaci spočívající v párování komplementárních bází 2. Spontánní mutabilitu v důsledku tautomerie bází 3. Kódování genetické informace ve formě pořadí (sekvence) bází Dceřiný duplex Mateřský duplex Zreplikované řetězce Nukleové kyseliny • DNA - tvoří genom prokaryot, eukaryot a DNA-virů • nDNA - jaderná, gDNA - genomová, mtDNA - mitochondriová, ctDNA -chloroplastová, pDNA - plazmidová, recDNA - rekombinantní, rDNA -ribozomální, • cDNA (copy DNA, complementary DNA) - komplementární; • dsDNA - dvouřetězcová, ssDNA - jednořetězcová, cccDNA - kovalentně uzavřená kružnicová, ocDNA - otevřená kružnicová, linDNA - lineární • A-DNA, B-DNA, Z-DNA - konformace ovlivněná sekvencí a prostředím • RNA - tvoří genom RNA-virů, u buněčných organismů je složkou ribozomů a plní různé funkce při přenosu a realizaci genetické informace • mRNA - mediátorová, hnRNA - heteronukleární, tRNA - transferová, rRNA - ribozomová, snRNA - malá jaderná, snoRNA - malá jadérková, scRNA - malá cytoplazmatická, gRNA - řídící • Ribozymy: RNA s katalytickou funkcí (např. siRNA, miRNA) Složení nukleových kyselin • Nukleotid O kyselina fosforečná O pentóza • ribóza • deoxyribóza O organická báze • purinové báze • adenin • guanin • pyrimidinové báze • cytozin • tymin • uracil N-glykozidická vazba • Nukleozid = pentóza---org. báze • Kys. deoxyribonukleová O kys. fosforečná O deoxyribóza O adenin, guanin, cytozin, tymin* • Kys. ribonukleová O kys. fosforečná O ribóza O adenin, guanin, cytozin, uracil* *modifikace bází (metylace, acetylace...) Organické báze Adenin = 6-aminopurin Guanin = 2-amino-6-oxopurin Cytozin = 4-amino-2-oxopyrimidin Tymin = 2,4-dioxo-5-metylpyrimidin Uracil = 2,4-dioxopyrimidin Purinové báze Pyrimidinové báze H Pentózy nukleových kyselín RNA 5'HO-CH 2 4' o OH H OH 1' H 2' DNA 5'HO-CH 4' 2 o OH H 2 H 6-D-ribóza 6-D-ribofuranóza B-D-2-deoxyribóza 2-deoxy-6-D-ribofuranóza Nukleotidy (nomenklatura) 2' -deoxyadenozin-5' -monofosfát 2' -deoxycytidin-5' -monofosfát -difosfát, -trifosfát ATP, GTP Polynukleotidový řetězec Významné strukturní rysy: O5'- a 3'- konec polynukleotidového řetězce O Páteř polynukleotidu (pentózafosfátová kostra, cukr-fosfátová kostra) O prodlužování polynukleotidového řetězce - probíhá vždy ve směru 5'- 3' Část polynukleotidového řetězce DNA NH 5'-konec OH I ♦ HO-P-O-CH li 2 N N NN 3-5' -fosfodiesterová vazba H H H 3 OH H O páteř polynukleotidu cukrfosfátová kostra 2 Strukturní úrovně DNA • Polydeoxyribonukleoti-dový řetězec b dvoušroubovice DNA nadšroubovicové vinutí • nadšroubovice DNA superhelix primární struktura sekundární struktura terciární struktura 4 relaxovaná DNA adšro bovice kružnicová nebo lineární *zrušení nadšroubovicového vinutí árová í ází párování bází = spojování protilehlých bází vodíkovými vazbami mezi dvěma řetězci = duplex a) 11 icjzi uv^uia ic^zc b) mezi třemi řetězci c) mezi čtyřmi řetězci d plex triplex kvadruplex Watsonovo-Crickovo párování bází adenin tymin (aminoforma) (ketoforma) Watsonovo-Crickovo párování bází 0-------H-ř H I « H guanin cytozin (ketoforma) (aminoforma) Watsonovo-Crickovo párování bází adenin uracil (aminoforma) (ketoforma) Charakteristika dsDNA 1. společná osa 2. komplementarita řetězců 3. vnitřní část tvoří báze AT a GC 4. páteř - osa = 1nm 5. antiparalelizmus = směr fosfodiesterových vazeb 5'-3' a 3'-5' 6. Chargaffovo pravidlo A+G G+C T+C = 1 A+T je různý 7. planární charakter bází 8. menší a větší žlábek = místa vazby proteinů k DNA. Vazby jsou ■ r. r vodíkové 3 + 9 12 = _ _ = 1 A G G G G G G G A A G G puriny 3 + 9 12 T C C C C C C C T T C C P—ny 9 + 9 = 1 8 je různý (%gq 3 + 3 6 Sekundární struktura DNA (schéma dvoušroubovicové DNA - konformace B) vzdálenost y" páteře od osy vzdálenost mezi dvěma páry bázi ^0,34 nm 3,4 nm jeden závit r 10,5 bp elký a alý žlábek a s Rekogniční kód DNA malý žlábek Antiparalelismus komplementárních řetězců DNA = opačný směr fosfodiesterových vazeb 5'-konec p D p l D p D 3'-konec 5 D P D OH báze -A :::::::::::= T -G =}}}=C A ::::::::::::::::::::: T ■ T ::::::::::::::::::::=A oh a 3'-konec T A I D p D p D p D p D p deoxyribóza fosfodiesterová vazba 5'-konec Vinutí dvoušroubovice DNA • Vinutí = mnohonásobné otáčení jednoho řetězce kolem druhého • Vinutí může být pravotočivé nebo levotočivé i tí vo šro bovice Levotočivé a pravotočivé vinutí šroubovice levotociva šroubovice pravotočivá šroubovice \ 4 Konformace dvou řetězcové DN A (RNA) • Konformace = prostorové uspořádání biomakromolekuly do struktury, která je za daných podmínek energeticky nejvýhodnější • Konformace DNA závisí na: O nukleotidové sekvenci O obsahu vody v prostředí O iontové síle prostředí Konformace dsDNA A-DNA menši žlábek vetsi žlábek menši žlábek vetsi žlábek B-DNA Z-DNA menši žlábek vetsi žlábek A, B = pravotočivá A-DNA • • dsDNA při vysoké konc. solí nebo dehydrataci dsRNA, DNA/RNA hybrid, Z-DNA • vysoké konc. solí • úseky obsahující (GC)n nebo (GT)n Z = levotočivá erciár í str kt ra • Terciární struktura dsDNA = nadšroubovice • Vzniká zavedením dalšího vinutí (záporného nebo kladného) do dvoušroubovice. • Nadšroubovice se může vytvářet jak z relaxované uzavřené kružnicové DNA, tak i z lineární DNA • Záporné vinutí vzniká odvinováním dvoušroubovice (ubíráním závitů), kladné vinutí jejím svinováním (přidáváním závitů). Konformace dvouřetězcových kružnicových molekul DNA Kovalentně uzavřené kružnicové adšro ovicové a relaxova é oblasti v li eár í dvouřetězcové DNA závity solenoidové relaxovaná nadšroubovice smyčky oblast Eukaryotická DNA, která je lineární a dvouřetězcová, se váže k proteinovému lešení. Tvoří se v ní závity nadšroubovice, solenoidové smyčky a také relaxované oblasti. Přechod relaxované DNA do nadšroubovicové levotočivá pravotočivé solenoidové nadšroubovice smyčky Parametry nadšroubovice W je záporné, když vyjadřuje počet záporných nadšroubovicových závitů, nebo kladné, jestliže vyjadřuje počet kladných nadšroubovicových závitů Příklad vztahů mezi veličinami L, T a W Přechodné stavy - vzniká pnutí volné lineární dsDNA volné konce L = 16; T=16; W = 0 konce dooooocxxxxxxxxíco: 1 2 3 4 5 6 7 8 910111213141516 početzávítů Spojen/ relaxovaná kružnlcová dsDNA-*— volných- K částečně odvinutá kružnicová dsDNA Odvinutí 4-šesti závitů. Vnesení záporného nadšroubovicového vinutí L se smzi o počet nadšroubovicových závitů Přechod relaxované uzavřené dsDNA do nadšroubovice nebo toroidní (solenoidní) dsDNA Uzavřená relaxovaná o Zavedení záporného nadšroubovicové-ho vinutí. Ubírání závitů (odvinování). Záporná nadšroubovice • Má záporné vinutí. • Je pravotočivá. • Proti relaxované dsDNA má nižší hodnotu L. LL o it pravotočivá toroidní (solenoidní) dsDNA L = celkové číslo vinutí po svinování nebo odvinování L0 = celkové číslo vinutí před svinováním nebo odvinováním Účinek topoizomerázy I Vytvoření zlomu Přesunutí druhého Mechanismus účinku topoizomeráz I a II typu Zlom v jednom Nadšroubovicová DNA Zlom v obou / řetězcích Řetězec se přesune přes zlom a spojí se L se sníží o 1 Oba řetězce se přesunou přes zlom spojí se s a L se sníží o 2 Nadšroubovicové uspořádání dsDNA Kružnicová uzavřená Nadšroubovicová Nadšroubovicové uspořádání DNA (relaxovaná) DNA (negativní) DNA - bakteriální chromozom Typy sekvencí zodpovědné za vznik alternativních struktur • Jedinečná DNA sekvence: ....AATGCTGATGTCTGACTCGGA... • Repetitivní (opakující se) sekvence neboli repetice (jednotka repetice, délka jednotky repetice, četnost repetice). ATG_ATG_.ATG_.ATG_ (jednotka = ATG, délka = 3 nukleotidy, četnost = 4x) • Tandemová repetice ..ATGCATGCATGC.. • Přímá repetice (5' _.ATGC.....ATGC.....3') opakuje se na témže řetězci ve stejném směru (5'—► 3') Obrácená repetice (opakuje se na druhém řetězci v obráceném směru - potenciál pro vytvoření vlásenky nebo vlásenky se smyčkou) 5'...ATGCGCAT...3' palindrom (vlásenka) 3'...TACGCGTA...5' (madam; Karla zamazal rak, tahat) 5' ...ATgCxXXXXGCAT...3 ' vlásenka se smyčkou 3' ...TACGYYYYYCGTA...5' (na dsDNA vzniká křížová struktura) • Dlouhá koncová repetice (sekvence LTR) 5'-ATGCGCAT.........................ATGC.GCAT-3' 3' -TACG...CGTA.........................TACG...CGTA-5' Schéma vlásenkových struktur DNA (RNA) Vlásenkové struktury se vytvoří na jednom řetězci DNA v místech, kde se vyskytují obrácené repetice. atctaltagát vlásenka \/ obrácené repetice vlásenka se smyčkou atctA tccag Tagat a t c t a t a g a T c ■ a t c t a t a g a t Vznik křížových struktur křížová struktura bez smyčky TCTATAGA i i i i i i ii AGATATCT "A — tÍ T - A C - G T - A G A T palindrom křížová struktura se smyčkou m Ví -atctaltccag itagat '..... i i i i i i iii i tagat aggtc atcta G A T e at race a re at race s • denaturace dsDNA = přechod dsDNA na ssDNA, opačný pochod = renaturace • k denaturaci dsDNA dochází zvyšováním teploty roztoku, k renaturaci snižováním teploty (nebo změnou pH prostředí z neutrální hodnoty na alkalickou nebo kyselou) • denaturace dsDNA se projevuje hyperchromním efektem, tj. zvýšením absorbance UV-světla o vlnové délce 260 nm. • hodnota Tm nebo-li teplota tání = teplota, při které zdenaturovalo 50% molekul dsDNA Denaturační křivka dsDNA Arx 260 At25 260 14 t ' A * = absorbance roztoku DNA při 260 t > 25 °C. At25 1 3 A260 = absorbance roztoku DNA pn It = 25 o C. Absorbance se stanoví při 260 nm. 1, 2 1,1 50 % molekul DNA zdenaturováno 1 50 60 70 80 Tm90 teplota roztoku DNA (°C) 100 Odtud GC = 'm V definovaném roztoku např. platí, že Tm= 69,3 + 0,41 (GC). Tm - 69,3 0,41 GC = molární podíl guaninu a cytozinu v DNA, 69,3 a 0,41 jsou empiricky stanovené koeficienty; pro poly(AT) Tm = 69,3. Denaturace, renaturace a hybridizace molekul dsDNA molekuly dsDNA 1 denaturace 1 1 ■ i ii homologické renaturace 1 DNA Čím více se hybridizované molekuly shodují v sekvencích neboli čím vyšší je jejich sekvenční homologie, tím je větší pravděpodobnost jejich hybridizace. nehomologické DNA nebo slabě hybridní velmi slabě homologické + + + + +