Replikace • Replikace = tvorba replik (kopií) molekul nukleových kyselin zajišťující přenos genetické informace z DNA do DNA nebo RNA do RNA • (z mateřské molekuly se vytvářejí dvě identické molekuly dceřiné) Charakteristické rysy replikace dvouřetězcové DNA 1. Probíhá semikonzervativním způsobem 2. Probíhá semidiskontinuálně Tři možné způsoby replikace DNA Semikonzervativní Konzervativní Disperzní Rodičovská DNA j. ( \ I \ DNA po první replikaci DNA po druhé generaci Semikonzervativní způsob replikace dsDNA <— mateřský řetězec Důkaz semikonzervativní replikace DNA (Meselson a Stahl 1958) 14N Semidiskontinuální syntéza řetězců při replikaci Předpoklady a požadavky pro replikaci nukleových kyselin 1. Templát (matricový řetězec) = mateřská molekula 2. Primer = krátký oligoribonukleotid s volným 3'OH koncem 3. Enzym katalyzující připojování nukleotidů (polymeráza) 4. Nukleotidy (NTP) 3' ATCCGTGCTGCTTGCTTGAATACC 5' UAGGCACGA-3'OH---► RNA-primer nově syntetizovaný řetězec Syntéza DNA při procesu replikace S'-konec řetězce 0 -o-p=o 1 0 1 syntetizovaný řetězec O Q-P=d i O ••'ľ "" .o. OH S'-konec, řetězce O O 0-P-0-P-0-P-0-CH2 „O I 1*1 O" O' 0~ difosfát HO deoxyribonukleosidtrifosfát vstupující do reakce 3:-konec řetězce CH- O = T o o=p-cr O J_L /] !\ i templátový \^ řetězec 0=P-O" Ó CH- G O o 'O CH O 0=P-0" O CH- O I 0=p-cr i O ... 1 <.bn.ee řetězce Směr syntézy polynukleotidového řetězce i 0 o-p=o 1 0" 5'ch (h , h) 0 h 0-p=0 1 0" S'ÍH2 0 oh h 0/0 0 o-p-o-p-o-p-o o o 5 " fosfátový konec Rostoucí řetězec Volný 3_riydroxy!ový .konec 5'ch oh h ^ f P Napojující se nukieozidtrifosfát z Y S = báze dNTP Enzymy kooperující při replikaci a jejich funkce 1. DNA-polymerázy a DNA-primáza: • katalyzují polymerizace NTP 2. DNA-helikázy a SSB - proteiny: • otevření DNA-helixu a stabilizace jednořetězců 3. DNA-ligázy a enzym degradující RNA-primer: • katalýza spojení DNA-opožďujícího se řetězce 4. DNA-topoizomeráza: • odstranění helikálního vinutí 5. Iniciátorové proteiny: • vazbou na ori katalyzují vytvoření replikační vidlice Počátek replikace = ori specifická sekvence na DNA (dnaA box) TABLE 5.01 Proteins Involved in DNA Replication in E. coli Protein Gene Function DriaA dnaA Initiation of chromosome division; binds to the origii replication Helicase dnoB Unwinds the double helix DnaC dnaC Loading of DNA helicase SSB ssb Single strand binding protein Primase dnaC Synthesis of RNA primers RNase H rnhA Partial removal of RNA primers Pol 1 polA Polymerase 1; fills gaps between Okazaki fragments Polymerase III DNA polymerase III holoenzyme fx dnaE strand elongation £ dnoQ kinetic proof-reading e ho/E unknown; part of core enzyme ß dnaN sliding clamp T dnaX dimerizatfon of core enzyme 7 dnoX loading of sliding clamp 5 holA loading of sliding clamp w hoiB loading of sliding clamp X hoiC loading of sliding clamp ¥ holD loading of sliding clamp DNA Ligase l'<9 Seals nicks in lagging strand DNA Gyrase Introduces negative supercoils a gyrA Makes and seals double strand breaks in DNA ß gyrB ATP-using subunit Topoisomerase IV Decatenation A parC Makes and seals double strand breaks in DNA B parE ATP-using subunit Charakteristika DNA-polymeráz • DNA-dependentní-DNA-polymerázy 1. Polymerizace nukleotidů ve směru 5'-3' 2. Odštěpování nukleotidů a) 5'-3'exonukleázová aktivita b) 3'-5'exonukleázová aktivita Odbourávání (exonukleázová aktivita) polymerizace b) a) <......... .........► 5' 3' AGTC TCAG 3' 5' a-monomei% který katalýzu]e poly-merači. Monomer a se vyznačuje již slabou polymeracní aktivitou o rychlosti polymerace 8 nukleotidů/s. Nemá však exonukleázovou aktivitu; e-monomer vyznačující se 3'-5'-exonukleázovou aktivitou; G-monomer, který stimuluje účinek E-exonukleáz; y-monomer váže ATP; S-monomer se váže na (3; ô'-monomer stimuluje účinek monomeru (3; %-monomer, na který se vážou proteiny SSB; monomer tvoří most mezi % a y. Korektorkská aktivita DNA-polymeázy • 3--- 5' exonukleázová aktivita • počet chybně zařazených nukleotidů = 1/107 • výsledný počet chybných bází = 1/109 Proč je DNA syntetizována jen ve směru 5 - 3' ? Reakce neprobíhá, protože není k dispozici makroergní vazba, která by se štěpila Makroergní vazba je rozštěpena, čímž se získá energie pro polymeraci DNA-lígáza 5'3' 1 DNA-Iigáza (ATP) OATP + dNMPn + dNMPm = AMP + PPan +dNMPn + m DNA-Iigáza (NAD+) ONAD+ + dNMPn + dNMPm = AMP + nAMN + dNMP, n + m Dvousměrná replikace kružnicové chromozomové dsDNA prokaryot Asymetrie replikační vidlice Str kt ra očátk re likace (ori ) Iniciace replikace na chromozomu E.coli Předprimerová fáze replikace DNA v oriC u E. coli Fungování proteinů DnaA, DnaB a DnaC při iniciaci replikace v oriC DnaA se váže na čtyři 9 bp repetice DnaC DNA se ohýbá a začíná se rozmotávat v místě tří 13 bp repeticí - zde se pak vážou DnaB a DnaC, což vede k vytěsnění DnaA a rozmotá se celá oblast bohatá na AT páry. DnaB (helikáza) vytváří dvě replikační vidlice -každou v jednom směru Iniciace replikace DNA prostřednictvím RNA-primerů Průběh syntézy primem pro nový Okazakiho fragment A) PriA DISPLACES SSB PROTEIN C) PRIMASE MAKES SHORT RNA PRIMER Priinosome • DNA řetězec uvolněný z mateřské molekuly • Vytěsněni ssb proteinem PriA tento protein pak navodí napojení primázy (DnaG) • Vazba primázy • Syntéza 11-12 b RNA primem Tři kroky při spojování Okazakiho fragmentů • Nově nasyntetizovaný řetězec tvořený Okazakiho fragmenty • Vazba Pol I a odbourání RNA • Spojení mezery v DNA ligázou Okazakiho fragmenty • Syntéza Okazakiho fragmentů a proces jejich spojování postupným působením enzymů: 1. DNA-polymerázy 2. Nukleázy 3. Ligázy Relativní poloha podjednotek DNA polymerázy III v rvtriau vi 11 puiuiia replikační vidlici A) rm • dve podjednotky Polili 11111111111 ■ i m ii fungují společné Směr syntézy B) ■ ■■■■■■■ 11 ■ i ■■3 • pokud by DNA nevy-iiii in i in n i tvořila ohyb, podjed " by ------ notky by se oddělily C) MIHU Směr syntézy • ohyb DNA umožni podjednotkám zůstat pohromadě Průběh syntézy nových řetězců DNA DNA-polymerázou Syntéza vedoucího řetězce a Okazakiho fragmentů Pro zjednodušení není zakreslena 6-svorka a y-komplex Úloha podjednotek gama a beta při replikaci y -komplex Nakládá p -svorku na dvouřetězcový úsek složený z RNA-primeru a matricového DNA-řetězce a rozeznává RNA-primtf.vtéto sestavě. Y2ÔÔ'XV prodlužovaný vedoucí 5f a - podjednotka DNA-polymerázy IN 3' P -svorka Stabilizuje dvouřetězcovou strukturu a hlavně zvyšuje procesivitu DNA-polymerázy III. matricový DNA-řetězec Nakládání DNA polymerázy na opožďující řetězec ß-svorka previously synthesized RNA primer /__DNA polymerase Okazaki fragment lagging-strand DNA template Y-komplex SYNTHESIS OF OKAZAKI FRAGMENT STALLING OF DNA POLYMERASE TRIGGERS ITS RELEASE FROM CLAMP Globální pohled na průběh replikace dsDNA 5' 3- m 5 5'i >3' prodlužování vedoucího řetězce (polymerace ) H rONA-polvmeráiaW primézaza r hotový RNA-primer fragment Odbourávání primeru prodlužující se Přidávání nukleotidů k 3'-konci Okazakiho Spojení fragmentu-Okazakiho fragmentů. z jeho 5''-konce. Okazakiho fragment 5' 3 Terminace replikace bakteriálního chromozomu Ter - místa (23 bp) spolu Zjednodušené schéma buněčného cyklu zdůrazňující počet molekul dsDNA v chromozomech v jeho různých fázích Struktura chromozomu během děleni buňky telomera replikační počátek centromera ori INTERFÁZE MITOZA i r replikační bublina Chromatinová doména = replikon část mitotického vřeténka INTERFÁZE duplikované chromosomy v oddělených buňkách Počet počátků replikace u různých organismů Organismus Počet replikonů Velikost replikonů Rychlost pohybu vidlice (E. coli) (S. cerevisiae) (D. melanogaster) (X. laevis) (M. musculus) (V. faba) 1 500 3 500 15 000 25 000 35 000 4200 kb 40 kb 40 kb 200 kb 150 kb 300 kb Rozdíly v rychlosti syntézy ŕ 50 000 bp/min 3 600 bp/min 2 600 bp/min 500 bp/min 2 200 bp/min Složky bakteriálního a eukaryotického replizomu Složka replizomu U bakterií U eukaryot Replikativní polymeráza lloloenzym polili* pola/primáza v komplexu s pol 5 Faktor zvyšující procesivitu replikativní polymeráty p- svorka PCNA Faktor nakládající p-svorku (PCNA) y-komplex RFC Primáza jen DNA-primáza (DnaG-protein) komplex pola/primáza Helikáza DnaB-protein, n-protein ? Odstranění primeru DNA-polymeráza I exonukleáza MF1 Oprava opožďujícího se řetězce DNA-polymeráza I a DNA-li gáza Komplex pol 5/pol e ? a DNA-ligáza DN A-to poizome ráza II (gyráza) II Proteiny vázající se na jed no řetězcové úseky DNA SSB-proteiny replikační protein A (RP-A) nebo lidský SSB (HSSB) Eukaryotické DNA-polymerázy • a Syntéza Okazakiho fragmentů, 3-5' exonukleáza • ß Syntéza krátkých řetězců při reparaci DNA • y Syntéza mitochondriové DNA • ô Syntéza vedoucího řetězce a dokončení syntézy opožďujícího se řetězce 3-5' exonukleáza • e Neznámá funkce Přehled vlastností a funkcí eukaryotických DNA-polymeráz Proliferační buněčný antigen (proliferating cell nuclear antigen) ~ ß-svorka Označení y u savců,; ' P Bil?- B(|9| Označení ; u kvasinek poli po!4 polM Pol3 pol2 Umístění v jádře v jádře v mito-chondríích v jádře v jádře Počet ..podjedrio-tek 4 1 2 2 >1 Polymerá-zová : aktivita 5'-3' ' + + + + + Exonukleá-zová aktivi- - + + + Primáza -■ - - - Sdružené faktory žádný žádný ^" žádny H ► PCNA žádný Procesivíta mírná nízká vysoká vysoká ve sdružení s PCNA vysoká Funkce začátek syntézy Okazakiho fragmentů primery oprava poškozené DNA katalýza replikace v mito-chondriich syntéza prodlužujícího sé řetězce a dokončení syntézy Okazakiho fragmentů neznámá Struktura počátku replikace u kvasinek Soubor proteinů = ORIZOM transkripční faktory XX) proteiny rozeznávající transkripční počátek replikace (oři) faktory äúxHO sekvence potřebná k odvíjení DNA vazebné místo pro transkripční faktory 4 DNA sekvence, na níž se zahajuje odvíjení DNA vazebné místo pro transkripční faktory rozeznávací sekvence počátku replikace 1. Vazba inciačních proteinů na sekvenci ore (helikáza, polymeráza atp) 2. Vazba transkripčních faktorů a jejich interakce s proteiny v místě ORE 3. Iniciace replikace, rozmotání DNA v místě DUE Různé transkripční faktory aktivují různé počátky replikace Před zahájením replikace se poblíž počátku replikace naváže RLF (replication licensing factor), který je po zahájení replikace odstraněn: koordinace iniciace mnoha ori Iniciace replikace u eukaryot - rozdíly oproti bakteriím A) B) a) Primáza syntetizuje RNA-primer, poté se váže DNA polymeráza a, která nasyntetizuje iDNA (iniciátorova DNA). D) Sliding clamp PCNA b) RFC nasedá na iDNA c) RFC napomáhá navázat DNA-polymerázu ô a PCNA protein (trimer) d) DNA-polymeráza ô pak prodlužuje nový řetězec DNA Základní složky replizomu eukaryot replikační faktor C Globální pohled na elongaci vedoucího a opožďujícího se řetězce v replikační vidlici eukaryotické chromozomové dsDNA Schéma replikační vidlice eukaryotické jaderné DNA nové nukleozomy "TU staré nukleozomy Staré a nové nukleozomy se na matricových a podle nich syntetizovaných komplementárních řetězcích rozdělují náhodně Na obrázku je pro jednoduchost schématického vyjádření nukleozom znázorněn jako tetramer histonů. Ve skutečnosti však jde o oktamer. Nukleozomy se rozpadají při replikaci. nové histony zásoba histonů _ rekonstituce nukíeozomů OO staré histony Problém doreplikování 3'konců lineárních chromozomů problém s příměrem pro telomery na opožďujícím se vlákně konec směřující k centromere vzdálený konec 5'.....""I I I I I I I I 11 M I I I I I I 11 I I I I I I III I 3 3' ■.......fllllllllfl1lll>lll1lllll.lttll5- L J Okazakiho fragment RNA-primer I 5' 3' ' 11111 I 1111111 I 11111111111 I 11 T3 3'-OH skupina není k dispozici pro kovalentni prodloužení [-«T—5'3-<- -<-S' I 3' RNA-primer Okazakiho fragment 3' primer pro syntézu krátkých repeticí - telomeráza Prodlouženi 3-konce. Syntéza Okazakiho fragmentů na prodlouženém konci. S 3*-«-5' primer pro syntézu krátkých repeticí Str kt ra telo erázy Funkce telomerázy TELOMERASE BINDS s parental strand / 3' TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG FjAACCCCv jncomp|etef new|y synthesized lagging strand TELOMERASE EXTENDS 3' END (RNA-templated DNA synthesis) 3'