Transkripce přepis genetické informace z DNA do RNA, při které DNA slouží jako matrice pro syntézu RNA. Reakci katalyzuje RNA-polymeráza (transkriptáza) Zpětná transkripce (RT) - přepis genetické informace z RNA do DNA. Reakci katalyzuje zpětná (reverzní) transkriptáza Transkripce DNA do RNA DNA 3' TAC(L AACGCGAATTC • • • • AUGG 5' 5' RNA 3' 3'-TACC C AACGCGAATTC-5' • •• •• •• • AUGGGUUG 5' 3' Značení řetězců DNA podle jejich funkce dsDNA 5' -► 3' kódující (pozitivní) [nepřepisující se] antikódující (negativní) (-DNA) [přepisující se] I transkripce 5'------------------------------3' mRNA 5' GATC 3 3' CTAG 5 I 5' GAUC 3' Směr syntézy mRNA při transkripci, směr translace mRNA a směr syntézy polypeptidů —► 3' 3' Syntéta polypeptidů N-konec.....C-konec Transkripce u prokaryot je spřažena s translací, u eukaryot jsou tyto procesy odděleny Prokaryota Eukaryota Polycistronic mRNA mRNA is translated while it is still being transcribed 3' Monocistronic mRNA AAAAAA(3' Tail mRNA must exit From the nucleus before it can be translated AAAAAA (3' Srovnání prokaryotické a eukaryotické m RNA Srovnání prokaryotických (jednoduchých) strukturních genů s eukaryotickými (složenými) geny Geny mohou být transkribovány z obou řetězců; jako templát je využíván obvykle jen jeden z řetězců na daném úseku DNA FtNA-transkripty 5000 nukleotidových párů Typy RNA vznikající při transkripci u různých typů organismů KEY .., i ■ All organisms Eukaryotes only Bacteria only Molekulární druhy molekul RNA vytvářené transkripcí u eukaryot Transkripce a úpravy RNA probiŕiaji u Jádře. Translace prohiha v cytop-tomS. Enzymy katalyzující transkripci A. DNA-dependentní RNA-polymeráza (RNA-polymeráza, transkriptáza) matricí je řetězec DNA (prokaryota, eukaryota, DNA-viry) B. RNA-dependentní DNA-polymeráza (zpětná/reverzní/ transkriptáza) matricí je řetězec RNA (retroviry, retrotranspozony, retroelementy) Primární transkripty tvořené na řetězci DNA O přepisy strukturních genů (mRNA, pre-mRNA/hnRNA) O přepisy genů pro funkční typy RNA • pre-rRNA • pre-tRNA • malé RNA (snRNA, snoRNA, scRNA, miRNA) Funkce podjednotek RNA-polymerázy podmaňuje vazbu 4— ribonukleotidů na polymerázu udržuje stabilitu molekuly podmiňuje vazbu RNA-polymerázy k promotoru podmiňuje spojení RNA-polymerázy s matricovým řetězcem Struktura RNA-polymerazy newly synthesized short region of RNA transcript DNA/RNA helix Strukturní gen prokaryot s vyznačením signálů pro transkripci a translaci Transkripce strukturních genů Schéma bakteriální mRNA a transkripční jednotky obsahující strukturní geny 4-transkripční jednotka- (vyjádřená v negativním DNA-řetězci) startovací nukleotid \*-strukturní geny- 31 +1 5' TCCT promotoři vedoucí ATC Sekvence TAC AGGA AUG UAG 1 B C TAC ATC AUG UAG TAC ATC AUG UAG terminátor koncová sekvence 5' -Na ribozomu se překládá jen tento úsek- 3' mRNA Úseky obsazené geny A, B, C jsou mnohonásobně delší než ostatní! Schéma upozorňuje jen na složení transkripční jednotky a mRNA. Neupozorňuje na délku jednotlivých úseků. Shineova-Dalgarnova sekvence mRNA je multigenní Slouží bezprostředně jako matrice pro syntézu proteinů velmi rychle se rozkládá ribonukleázou (1-2 min) Funkční elementy bakteriálního promotoru -35 -10 + 1 (A,G) ■ TTGACAT 16-18 b TATAATI5-7bp+1 promotor < silný slabý Pribnowův startovací box nukleotid box = krátká sekvence o stejné funkci Sekvence přirozených a hybridních promotorů -35 Region 17 bp -10 Region CONSENSUS lac trp XPL recA 1 123456789 101112Í3141S161? • • • T TGACA .......* • TATA AT* • GGCTTTAC ACTTTATGCTTCCGGCTCGTATATTGT CTGTTGACAATTAATCAT CGAACTAGTTAACTAG GTGTTGACATAAATACCA CTG G C GGTGATACTG A CACTTGAT AC TG T A TGAA GCATACAGTATAATTG tací tacll CTGTTGACAATTAATCAT CGGCTCGTATAATGT CTGTTGACAATTAATCAT CGAACTAGTTTAATGT 15-18 bp / Hybridní promotory tac = lac x trp 5-9 bp +1 Základní schéma typů transkripčních jednotek bakteriálního genomu Neoperonová transkripční jednotka a operony NEOPERONOVÁ TRANSKRIPČNÍ JEDNOTKA startovací nukleotid te^toi- strukturní gen strukturní gen promotor operátor OPERONY strukturní gen strukturní gen +1 T strukturní gen strukturní gen operátor překrývající se s promotorem Transkripce bakteriálního genu RNA-polymerázou 1. iniciace 2. elongace 17\ DNA Vytváření molekul mRNA na prokaryotické transkripční jednotce a spřažení transkripce a translace u prokaryot Iniciace transkripce na promotoru sigma-faktor^^J ní^^R NA-polymeráza cj- faktor rozeznává sekvenci -35 na promotoruA Po skončení této funkce se z RNA-polymerázy 1 uvolňuje. RNA-polymeráza katalyzuje transkripci i bez sigma-faktoru, který je v průběhu elongace nahrazen NusA-proteinem a^PL. NusAj Terminace RNA-polymeráza se z terminátoru uvolní a NusA-protein je opět nahrazen sigma-faktorem. Obr. 148 Vzájemné výměny sigma-faktoru a NusA-proteinu na RNA-polymeráze Terminace transkripce nezávislá na Ró-faktoru Zastavení pohybu RNA-polymerázy Uvolnění hotové RNA Uvolnění RNA-polymerázy z DNA Struktura a funkce prokaryotické RNA-polymerázy RNA-polymeráza (holoenzym) RNA-polymeráza změní tvar i velikost po rozpoznání promotoru sigma-faktorem. a - stabilita holoenzymu p - vazba rNTP na polymerázu p'- spojení s matricovým řetězcem a - vazba k promotoru NusA - protein - nahrazuje sigma-faktor při terminaci transkripce Obr. 144a iniciace transkripce Denaturace v oblasti +1 Iniciace transkripce -40 -30 -20 vazba sigma-faktoru na -35 MM ^+1 + 10 +20 +30 bp Při zakončení fáze iniciace a vstupu do fáze elongace m ní sigma-faktor i RNA-polymeráza svou konformaci, což m m v m m r m m m j m m se projevuje zmenou v její velikosti i tvaru. Sigma-faktor se uvol uje z RNA-polymerázy. Iniciační fáze transkripce u prokaryot Rozpoznání sekvence -1 0 a -35 sigma faktorem negativní (templátový) řetězec Prodlužování mRNA Typy terminátorů transkripce u prokaryot terminátor nezávislý na ró~ faktoru terminator závislý na ro-fakcom Strukturní rozdíly mezi dvěma typy prokaryotických terminátorů (jejich transkriptů) Struktura terminátorů nezávislých na ró-faktoru a jejich přepis do mRNA Struktura transkripčního terminátoru nezávislého na rho faktoru er i ace tra skri ce mRNA 'UUUUU Terminace transkripce za účasti Rho faktoru Elongační fáze transkripce Připojení Rho-faktoru a jeho pohyb po mRNA P k Připojení Rho-faktoru sekvenci terminátoru Rho faktor rozmotává hybridní DNA-RNA Uvolnění Rho-faktoru, RNA-polymerázy a mRNA Rho-faktor je rozeznáván NusA-proteinem, který je přechodnou součástí RNA-polymerázy. Ró-faktor katalyzuje po vazbě na tento protein odvíjení m RNA z DNA-řetězce a uvolnění RNA-polymerázy. K tomu je zapotřebí ATP, který je hydrolyzován Rho-faktorem vyznačujícím se aktivitou ATPázy. I. Recognition II. Elongation SIGMA IS RELEASED III. MusA IS PICKED UP NusA slSma recognition Sigma displaces NusA Výměna sigma faktoru a NusA proteinu na RNA-polymeráze -Sigma faktor: iniciace -NusA protein - terminace Terminace transkripce závislá na Rho-faktoru Elongační fáze Jakmile se RNA-polymeráza zastaví na terminátorové vlásence, Rho-faktor ji dostihne a oddělí RNA od DNA (Rho = helikáza) Transkripce transkripční jednotky pro rRNA DNA promotory pre-rRNA tRNA geny T 23S-rRNA tRNA 5S-rRNA |tRNA| [Ťl] (Ť2 I transkripce 1 terminátory 16S-rRNA posttranskripční úprava (vyštěpení funkčních produktů) rJU r\ ^\ O <š% -JL^ 5S-rRNA tRNA 5 tRNA 23S-rRNA Transkripce transkripční jednotky pro tRNA geny promotor posttranskripční úprava (vyštěpení funkčních produktů) 4» tRNA tRNA tRNA tRNA mRNA 3' Sestřih pre-tRNA u E. coli * exonukleáza probíhá působením enzymů -O 3' >l 50 nucleotides endonukleáza endonukleáza tRNA- n u kleotidyltransferáza dodatečné připojení ACC Eukaryota Eukaryotické DNA-dependentní RNA-polymerázy negativní Matricí pro syntézu RNA je u všech těchto polymeráz DNA-řetězec. Existují tři druhy těchto RNA-polymeráz: • RNA-polymeráza I, která katalyzuje syntézu pre-rRNA. Nachází se v ja-dérku a není citlivá k a-amanitinu Geny I. třídy • RNA-polymeráza II, která katalyzuje syntézu hnRNA a některých malých rRNA. Je citlivá k a-amanitinu. Vyskytuje se v karyoplazmě. Sestává přibližně z 10 protomerů, z nichž tři největší jsou homologické s protomery a, Ba B'prokaryotické RNA-polymerázy. Protomer 6 váže volné ribonukleotidy, 6' se váže k DNA a a spojuje protomery navzájem. Ostatní protomery se neliší od protomerů polymeráz I a III. Geny II. třídy • RNA-polymeráza III, která katalyzuje syntézu pre-tRNA, 5S-rRNA a některých malých RNA. Citlivost k a-amanitinu je druhově specifická. Vyskytuje se v karyoplazmě. Geny III. třídy Ĺaždá z uvedených tří RNA-polymeráz vyžaduje svůj specifický promotor, na který se váže. To je rozdíl proti prokaryotům, která mají jen jeden typ RNA-polymerázy a jeden typ promotoru Struktura promotoru RNA-polymerázy II Elementy eukaryotického promotoru (Pol II) • +1 (startovací nukleotid + Inr-element) - iniciátor • TATA-box (Hognessův b.) -34 až -26 - TATA-box • CAAT-box -75 až -80 GC-box -90 -- Oktamer ATTTGCAT Elementy proti směru ^ transkripce (upstream elements) Vazebná místa eukaryotického promotoru pro RNA-polymerázu II iniciace transkripce eukaryotních genů RNA-polymerázou II za účasti obecných transkripčních faktorů Posttranskripční úpravy hnRNA Úpravy konců • 5'-konec: připojení čepičky (cap) • 3'-konec: polyadenylace Úpravy vnitřní sekvence • Metylace • Sestřih • Editace (redakční úprava) Posttranskripční úprava transkriptů strukturních genů eukaryot intron _a_ transkripce pre-mRNA