Translace - překlad genetické informace Složky translačního aparátu: • mRNA • 20 standardních aminokyselin (+ SeCys. Pyrrolyzin)) • molekuly tRNA • aminoacyl-tRNA-syntetázy • ribozomy • translační faktory: IF, EF, RF • ATP, GTP Str kt ra olek ly t Srovnání struktury prokaryotického a eukaryotického ribozomu Prokaryotický ribozom Eukaryotický ribozom Sek dár í str kt ra 16S r Struktura molekul rRNA (5S a 23S) ve velké ribozomové podjednotce bakterií stanovená rentgenovou krystalografií Trojrozměrná struktura rRNA a L1 proteinu v poměrné velikosti Schema sekundární struktury 23S rRNA Peptidyltransferázová aktivita 23S rRNA - ribozymu Purifikovaná 23S rRNA z E. coli katalyzuje vytvoření peptidové vazby mezi aminokysleinami vázanými na tRNA za tvorby dipeptidu Schopnost šesti domén 23S rRNA tvořit peptidovou vazbu. Odstranění domény V vedlo k neschopnosti vytvořit peptidovou vazbu, tj. tato doména má při vytváření peptidové vazby klíčovou funkci Struktura velké podjednotky bakteriálního ribozomu rRNA zodpovídá za: 1. Strukturu ribozomu 2. Interakci tRNA s mRNA při translaci 3. Katalýzu peptidové vazby Struktura ribozomu E. coli s vyznačením funkčních míst schéma ribozomu 70S E neboli místo P neboli peptidylové A neboli aminoacylové exitu tRNA vazebné místo vazebné místo (a) Standardní genetický kód Kodony nukleotid U C A G nukleotid U Phe Ser Tyr Cys U Phe Ser Tyr Cys C Leu Ser N N nebo Secys A Leu Ser N (pyrrolyzin) Trp G C Leu Pro His Arg U Leu Pro His Arg C Leu Pro Gln Arg A Leu Pro Gln Arg G A Ile Thr Asn Ser U Ile Thr Asn Ser C Ile Thr Lys Arg A Met nebo I Thr Lys Arg G G Val Ala Asp Gly U Val Ala Asp Gly C Val Ala Glu Gly A Val Ala Glu Gly G rodiny jsou vyznačeny modře; N = nesmyslný kodon; I = iniciační Secys = kodon pro selenocystein, UAG = pyrrolyzin Čtení genetického kódu molekulami tRNA 20 standardních aminokyselin 20 aa-tRNA-syntetáz 22-45 molekulárních druhů tRNA (tj.antikodonů) l. 61 kodonů se smyslem a1 a2 i / \ tRNA tRNA1 tRNA2 (2 antikodony) { /\ /\ Kolísavé párování bází 1 kodon 4 kodony Kolísavé párování bazí na 5'antikodonu tRNA 3r 1 ^ Antikodon -—Jf i i A G U C GG 5' ■ ♦ ■ ♦ U/C 5 tRNA Kolísavá pozice (první báze antikodonu) 3' -Y- Kodon i- Třetí pozice kodonu Možnosti čtení třetího nukleotidu podle pravidel kolísavého párování bází První nukleotid antikodonu Třetí nukleotid kodonu Možnost čtení Organizmy U UCAG Kodonové rodiny Mitochondrie, Mycoplasma, chloroplasty o5U UAG Kodonové rodiny (Ser UCN, Val, Thr, Ala) Eubakterie mem5U AG Dvoukodonové sady Mitochondrie, bakterie, eukaryota m5s2U A(G) Dvoukodonové sady Eubakterie, eukaryota G UC Dvoukodonové sady Všechny G UC Kodonové rodiny Bakterie Q UC Dvoukodonové sady Eubakterie, eukaryota Hyp UCA Arg CGN Eubakterie Hyp UCA Kodonové rodiny kromě Gly GGN Eukaryota A U Thr ACU, Arg Mycoplasma, mitochondrie kvasinek C G Všude Všechny ■ hypoxantin; Hyp Q queozin O5U = uracil-5-oxyoctová kyselina; m5S2U mem5U = 5-metylkarbonylmetyl-2-tiouracil; 5-metyl-2-tiouracil; párování bází mezi antikodonem CGI v tRNA a třemi odlišnými (synonymními) kodony Čtení kodonů pro serin molekulami tRNA Kodon tRNA Antikodon UCU tRNASeri AGG + kolísání UCC UCA tRNASer2 AGU + kolísání UCG AGU tRNASer3 UCG + kolísání AGC Izoakceptorové tRNA jsou tRNA o různých antikodonech vázající tutéž aa Srovnání využívání kodonů silně a slabě exprímovaných genů u E. coli silně/slabě silně/slabě silně/slabě silně/slabě 24 Silně exprimované geny představuje druhů mRNA s celkovým počtem 5253 kodonů. Mezi tyto geny patří gen pro RNA-polymerázu, geny pro dvanáct ribozomých proteinů, několik proteinů vnější membrány a geny pro elongační translační faktory. Slabě exprimované geny představuje 18 druhů mRNA s 5231 kodony. Patří sem několik represorových genů, gen pro transponázu a B-laktamázu. Kodony, které jsou čteny jen jedinou tRNA a jejichž výběr je závislý na povaze a síle interakcí mezi kodonem a antikodonem, jsou v rámečku. Šipkami jsou označeny kodony, které jsou používány jen zřídka a mohou se podílet na regulaci genové exprese. Klasifikace aminoacyl-tRNA-syntetáz První třída (acylace na C2') Druhá třída (acylace na C3') Specificita pro aminokyselinu Počet podjednotek Specificita pro aminokyselinu Počet podjednotek Arg monomerní Ala tetramerní Cys monomerní Asn dimerní Gln monomerní Asp dimerní Glu monomerní Gly tetramerní(a2p2) Ile monomerní His dimerní Leu monomerní Lys dimerní Met dimerní Phe tetramerní(a2p2) Trp dimerní Pro dimerní Tyr dimerní Ser dimerní Val monomerní Thr dimerní Např: Bez ohledu na společnou funkci jsou syntetázy strukturně odlišné Přenos aminokyseliny molekulou tRNA na kodon mRNA aminokyselina (Trp) mRNA ČISTÝ VÝSLEDEK: AMINOKYSELINA JE VYBRÁNA PODLE SVÉHO KODONU Nabíjení tRNA aminokyselinou 1. Vytvoření aminoacyladenylátu 2. Přenos aminokyseliny na tRNA aa + ATP aminoacyl-AMP + PPi aminoacyl-AMP + tRNA aminoacyl-tRNA + AMP 3' Vznik aminoacyl-tRNA působením aminoacyl-tRNA-syntetázy 3 vazebná místa na aa-tRNA-syntetáze 1. 2. aa + ATP --- aa-AMP + PP Vznik aminoacyladenylátu aa-AMP + tRNA vznik aa-tRNA tRNA s nabitou aminokyselinou 1. pro aa 2. pro tRNA 3. pro ATP Vazba správné tRNA je stabilizována konformační změnou enzymu, která umožní rychlou aminoacylaci. Pokud je navázána chybná tRNA, ke konformační změně nedojde. Výsledkem je pomalejší reakce disociace tRNA. ra Přenos na ribozom Inkorpoprace selenocysteinu do polypeptidového řetězce serine 1 A C U seryl-tRNA synthetase seiefiocysteine tRNA SELB se lenocystei ne-specif ic translation factor A C U serine enzymatically converted to selenocysteine Speciální tRNASec selenocysteine ** added to growing peptide chain Vnášení tRNA-sec na vnitřní stop kodon UGA a) U bakterií b) U savců ^ Single protein binds tRNA-Sec and stem - loop niRNA Vlásenka je součástí kódující sekvence mRNA I! H2N— C — COOK CH2 CIL OH serin I II CYSTEINE m RNA Vlásenka je součástí 3'netranslatované mRNA H H„N"— C — COO H CH, 11 SELF.XOCYSTEINE Metionin je po vazbě na fmet-tRNAi formylován na formylmetionin, který je po začlenění do polypeptidu deformylován na metionin, který může být následně z N-konce polypeptidu odstraněn H H N C-COOH H H CH CH S CH N formyl transformyiáza ' CH CH metionin s CH COOH N-formylmetionin deformyiáza aminopeptidáza ) Struktura iniciátorové tRNA Formylace metioninu na iniciátorové tRNA Formylated amino acid I Met I C U CG AG * t • ■ GCUC G-C C-G G-C G-C U G-C C GG C C i t t i ■ > GUUGG_ C u G * G formylace 11 A A A GGD U-A C-G G-C G-C <■ G-C C A U A C . U A 10-formyl tetrahydrofolate Sekvence umožňující vstup do P místa CH3SCH2CH2 - C-NH-C-H 1 " c=o o I O i ^ N-formyl-Met-tRNAj. tetrahydrofolate Zařazování metioninu do polypeptidu během iniciace translace a během její elongace formyl fMet-tRNAfMet IF2 30S Vazba na iniciační kodon AUG tRNAMet EF-Tu Kompletní ribozom I Vazba na kodon AUG pro Met uvnitř genu fMet---protein / \ Deformylace fMet (deformyláza) (aminopeptidáza) Fáze tra slace prokaryot Iniciace translace u prokaryot (E. coli) Iniciační fáze translace u prokaryot Vazba mRNA na 16S-rRNA 3- mRNA t 5' AUUCCUCCACUAG i i i i i i i i i i i A G G A G G U G A U C Shineova-Dalgarnova sekvence RBS Shineova-Dalgarnova translační sekvence iniciační kodon mRNA i-A-1 r^S 5' -AACAC ■ AUUAUCC UCGACUCGTAU 3' 16S rRNA oblast párování bází S-r A U G Iniciační kodon P místo 3' ^UUGGCGUCCAAGGGGGAUGCCAA 5' konec 5' \ 3' Elongační fáze translace 1. aa-tRNA (druhá a všechny další) vstupuje do místa A a váže se svým antikodonem na kodon mRNA v A místě 2. Vytváří se peptidová vazba mezi poslední aminokyselinou rostoucího polypeptidu a aminokyselinou vázanou na tRNA, která se posunuje do místa P. Začíná translokace ribozomu. 3. Ribozom se posunuje na mRNA o jeden kodon, prázdná tRNA ze uvolní z místa E 4. Do místa A vstupuje další aa-tRNA Účast translačních faktorů při zajištění přesnosti translace i. 2. 3. 4. 5. aa~tRNA pevně vázaná na EF-Tu se přechodně váže s kodonem v A-místě 30S. aa~tRNA se nachází v hybridním místě, párování kodon-antikodon vede k hydrolýze GTP navozené EF-Tu. Chybné zařazení tRNA zpomaluje hydrolýzu a aa~tRNA tak může opustit ribozom ještě před vytvořením peptidové vazby. Časový prostoj mezi vazbou aa~tRNA na kodon a její dostupností pro elongaci zvyšuje přesnost translace V případě zařazení správné aa~tRNA dochází k disociaci EF-Tu a aa~tRNA se tak dostává do místa A a může se účastnit elongace peptidového řetězce. Na ribozom do (nebo poblíž) místa A na 50S se váže EF-G +(GTP) a urychluje pohyb tRNA do hybridních míst A/P a P/E. Kontakt EF-G s ribozomem stimuluje GTP-ázovou aktivitu EF-G - dochází ke konformační změně EF-G, pomocí níž je tRNA přesunuta z hybridního místa A/P do místa P a proces translace tak posune o jeden kodon = translokace ribozomu. Rychlost syntézy: 2-20 aminokyselin/sec Terminace translace 1. Do místa A se dostává terminační kodon na mRNA 2. V místě A se na terminační kodon váže terminační (uvolňovací) faktor (RF1,RF2 n. RF3) terminační faktory = molekulární mimikry 3. Změna aktivity peptidyltransferázy vede k uvolnění karb°Xylového konce peptidovéh° řetězce z P místa, volná tRNA se přesouvá do E místa a opouští ribozom 4. Ribozom disociuje na podjednotky, které se mohou účastnit dalšího cyklu translace H20—. terminace wCOOH M AUGAACUGGUAGCGAUCG Elongace polypeptidového řetězce (1) Terminace polypeptidového řetězce Zakončení translace molekulou tmRNA tmRNA (transfer/messenger) mRNA s neúplnou délkou Pozastavený ribozom na mRNA Short message (.-ltfaa) age Stop codon tmRNA navázaná v A místě Translace u eukaryot 1. na čepičku na mRNA se postupně navážou eIF-4F, eIF-4A, a eIF-4B (dohromady tvořící CBP-protein) 2. Je vyhledán iniciační kodon a Met-tRNAmet je umístěna proti němu (v P místě) 3. Uvolní se iniciační faktory a připojí se podjednotka 60S 4. Začíná fáze elongace EF-1 a EF-2 (analogy EF-Tu, Ts) malá ribosomální ^ podjednotka s navázanými iniciačními taktory čepička RNA Met Iniciační tRNA se pohybuje poděl mRNA, a hledá první triplet AUG naváže se velká r'bosomální podjednolka tvoří se první peptidová vazba (2. krok) eIF4A a B se podílejí mRNA eIF6 udržuje ribozom v disociovaném stavu 1. u baktérií se iniciační komplex tvoří přímo na sekvencích ohraničujících AUG 2. u eukaryot nejdříve 40S rozpozná 5' konec mRNA a pak se pohybuje k iniciačnímu místu, kde se spojuje s 60S Iniciace translace u eukaryot eIF-4G je vázán na polyA-konec mRNA a na eIF-4E = translatovány budou jen mRNA s úplnou délkou Struktura lidského terminačního faktoru eRFI a jeho podobnost s molekulou tRNA eRFI tRNA Standardní signální sekvence exportovaných proteinů Pozitivní doména Hydrofobní doména Oblast štěpení zbytek proteinu místo štěpení vedoucí (signální) peptidáza Kotranslační export proteinů u bakterií Syntéza extracelulárních a membránových proteinů preprotein = polypeptid se signálním peptidem na N-konci Translokace proteinu membránou do vnitřního prostoru endoplazmatického retikula Začlenění transmembránového proteinu do membrány ER Posttranslační procesy 1. Kotranslační úpravy * deformylace * odštěpení aminokyselin z N-konce aminopeptidázou * chemické modifikace aminokyselin (taydroxylace, fosforylace, acetylace, aj). * tvorba disulfidových můstků - vznik terciární struktury * připojení cukerných zbytků (oligosacharidů) - glykozylace, vznik glykoproteinů * vznik sekundární a terciární struktury 2. Posttranslační úpravy * vyštěpení peptidů (proinzulin > inzulín) * tvorba kvarterní struktury (spojování protomerů do aktivních oligomerů) * přidání prostetických skupin, koenzymů apod. (hemoglobin) * posttranslační štěpení polyproteinů (polypeptidový prekursor > peptid, např. ACTH) * proteinový sestřih (vyštěpení IVPS - intervening protein sequence), vytvoření nové peptidové vazby 3. Sestavování oligomerních proteinů a nadmolekulárních struktur (nekovalentní interakce mezi rozpoznávacími místy polypeptidových řetězců) * tvorba organe! (membrány aj) účast chaperonů a chaperoninů při sestavování struktur 4. Samosestavování (spontánní seskupení proteinových podjednotek) * ribozomy * morfogeneze virů (sestavení virových kapsidů) Modifikace aminokyselin Dekódováním mRNA při translaci je možno do bílkoviny vybrat jen asi 20 aa - z bílkovin lze však vyizolovat až 100 různých modifikovaných forem aminokyselin: a) hydroxylovaný prolin a lyzin b) fosforylovaný serin, treonin, tyrozin c) karboxylovaná kys. glutamová d) acetylovaný lyzin e) metylovaný lyzin a prolin f) adenylovaný tyrozin g) glykozylované zbytky glykozylovane zbytky h) modifikace lipidickými zbytky y nenasycených mastnýc 14C - myristylace, 16C - | y polyizoprenového char 20C - geranylgeranylace) Mnohé modifikační enzymy se nacházejí v ER a Golgiho Mikrozomální ) zbytky nenasycených mastných karbonových kyselin (acylace: 12C - laurylace, 14C - myristylace, 16C - palmitylace) zbytky polyizoprenového charakteru (iso/prenylace: 15C - farnesylace, y se n aparátu, někdy však dochází ke změnám až mimo buňku. frakce Průběh vzniku funkčního proteinu Nascentní polypeptidový řetězec Sbalování, vazba kofaktorů (nekovalentní interakce) Kovalentní modifikace (glykozylace, fosforylace, acetylace aj) Vazba dalších proteinových podjednotek Zralý funkční protein Kotranslační sbalování proteinu Sbalená C-terminální Sbalování proteinů za účasti chaperonů Nesbalený protein Správně sbalený protein Molekulární chaperony/chaperoniny • speciální skupina proteinů podílejících se na sbalování polypeptidů (zabraňují chybnému sbalování) • hlavní rodiny chaperonů: proteiny hsp60 a hsp70 Ohsp7G: rozpoznávají krátké úseky polypeptidu tvořené hydrofobními aminokyselinami během jeho syntézy na ribozomu OHspóO (GroE; Hsp60/Hsp10): vytvářejí soudkovité struktury, v nichž se upravují kompletně ^ nasyntetizované proteiny Dva obecné mechanismy působení chaperoninů Účast chaperonů na procesu sbalování proteinů Hsp70 se váže na hydrofobní oblasti (GroEL, GroES) proteinu a zabraňuje jeho agregaci. Další úlohy: • transport • disagregace denaturovaných hsp = heat shock protein proteinů (např. Hsp60) Posttranslační úprava proinzulínu C-řetězec Enzymaticky se vyštěpí N 63 //\ štěpení 64 B-řetězec 31 štěpení Srovnání způsobů odstraňování intronů a inteinů Inteiny byly zjištěny u kvasinek, řas, bakterií a archebakterií - obvykle j e přítomnen jen j eden inteín, výjimečně dva Intein katalyzuje své vlastné vyštěpení Protein prior to splicing Final protein formed Průběh sestřihu inteinu - probíhá ve dvou krocích 1. Extein 1 je uvolněn a připojen k cysteinu exteinu 2 - vzniká větvený intermediát 2. Intein je vyštěpen a oba exteiny se spojí do zralého proteinu Inteins are currently known in more then 50 types of proteins with diverse in functions. These proteins include metabolic enzymes, DNA and RNA polymerases, proteases, ribonucleotide reductases, and vacuolar-type ATPases. Sestřih inteinu (proteinový sestře) Intein DNA jumps Cut by the intein íntein-containing gene Intein homing Transcription extein Sestřih Sekvenčně-specifická endonukleáza ww-*-»■■■■■ Štěpení genu bez inteinu v místě, kam se má začlenit intein Konzervativní sekvence aminokyselin Inteín-minus gene 300-600 aa TŘI SESTAVOVACÍ ŘADY ocásek I S.6.7.8.10.25,26. 1 27,28,29.48.51,53 hlava vlákna ocásku 37,38 bazálni destička bazálni -destička spojená s proteiny dutiny ocásku připojeni obalového prcäsinu Čísly jsou označeny strukturní geny, kterými jsou kódovány proteiny fága kompletní vlákna ocásku kompletní fágový virion + labilní faktor Buněčné mechanismy monitorující kvalitu proteinů po translaci Proteinové agregáty Správně Správně sbalen sbalen bez s pomocí cizí pomoci chaperonů Neúplně sbalená forma je rozložena v proteazomu Odbourávání proteinů v proteazomech (eukaryota) Schéma cyklu ubikvitinu E1 = enzym aktivující ubikvitin. £2 ■ enzym přenášející aktívni ubikvitin Protein urČený sbalený protein na sbalený protein, k odbourání , centrální cylindr aktivní místa proteáz 19S „cap" - váže označené proteiny