Úvod do studia biologie kmenových buněk Jiří Pacherník e-mail: jipa@sci.muni.cz tel: 532 146 223 Co jsou kmenové buňky? - buňky schopné vlastní obnovy (sebeobnova) - buňky schopné dávat vznik jiným typům buněk (schopnost diferenciace / rozrůzňování) 322_1490_F3 Kmenové buňky v dospělém organismu 01-5 ASC Původ kmenových buněk SC diferenciace & proliferace Vnější faktory zodpovědné za zachování kmenových buněk auto- a parakrinně působící faktory niche diferenciace & proliferace p-Naveiras2006-niche_Page_5_Image_0001 Niche (Naveiras, 2006) stemcells Pluripotentní embryonální kmenové buňky Embryonální kmenové buňky (Embryonic stem cells – ES) Embryonální zárodečné buňky (Embryonic germ cells – EG) Embryonální nádorové buňky (Embryonal carcinoma cells – EC) Donovan 2001 ES EG EC DBiologystr242 finito Gilbert 1997 / Bílek 2004 Diferenciační potenciál ES buněk odvozených z vnitřní buněčné masy Verifikace kmenových buněk sebeobnova x schopnost diferenciace Somatické kmenové buňky - specifické znaky/markery a vlastnosti - sebeobnova – opakované transplantace - diferenciace in vitro - diferenciace in vivo Embryonální kmenové buňky - specifické znaky/markery a vlastnosti - diferenciace in vitro - diferenciace in vivo - chiméry - teratomy view_14 Chimera a)Embryoidní tělíska (Embryoid bodies - EB) +jednoduché, více buněčných typů + tolerující genotyp - špatně definované podmínky - b)V monovrstvě + lépe definovné podmínky - malá výtěžnost - silně závislé na genotypu (myš) Diferenciace ES / EC buněk in vitro kultivace selekce indukce Rathjen 1998 / Bílek 2004 EBkapky2 kultivace selekce indukce Model pro studium vzniku a zachování somatických kmenových buněk ES buňky somatické kmenové buňky progenitory diferencované buňky kultivace selekce indukce Model pro studium vzniku a zachování somatických kmenových buněk v našich experimentech ES buňky s geneticky modifikovanými faktory podezřelýmy z regulace fenotypu somatických kmenových buněk somatické kmenové buňky progenitory diferencované buňky specifické inhibitory - četnost vzniklých somatických kmenových buněk - jejich vlastnosti (fenotyp a potenciál pro další diferenciaci) ES D3 Neurogeneze Hematopoéza granulopoeza 2 Laboratoř ps-Heinrich2003_02_0001 Příklad signální kaskády cytokinů na dráze transdukce signálu interleukinu-6 (IL-6) Heinrich 2003 JAK – Janusova kináza (tyrosin kináza) STAT – transduktor signálu a aktivátor transkripce (signal transducer and activator of transcription) MAPK_Signaling_680 Výběr nejvýznamějších oblastí vyžadujících metabolizmus retinolu/vit.A A) fotorecepce B) růst a vývoj organismu Ross, 2000 Kyselina retinová - RA § velmi silný induktor § pleiotropní působení ES / EC + EB + RA § buňky neurální § buňky kosterní svaloviny a adipocyty § buňky srdeční a hladké svaloviny nM RA ES / EC + monovrstva + RA § buňky primitivního entodermu § neurální buňky (motoneurony?) McCaffery a Dräger, 2000 A/B D C F E A/B D C E LBD/AF-2 DBD AF-1 LBD/AF-2 DBD AF-1 EEIVPS74PPS77PPPLPR EELVPS67PPS70PLPPPR EEMVPSS66PS68PPPPPR EEMVPSS77PS79PPPPPR RARa1 RARb2 RARg2 RKRRPS369RP RKRRPS362KP RRRRPS360QP RRRRPS371QP RARg1 RXRa SSSLNS22PTGR….S44P.. S48P.. S54P… SS61P.. SS75P..PTT87P S96P..S101P LNPSS265PNDP Serinové a threoninové zbytky fosforylované (■) u RAR/RXR receptorů, ukázány jsou i potencionálně fosforylovatelné(čísla) AF-1 (A/B doména) – oblast regulující aktivaci transcripce, nezávisle na ligandu DBD (C doména) – DNA vázající doména (DNA-binding domain) LBD/AF-2 (D/E doména) – oblast regulující aktivaci transkripce, závislé na ligandu PKA MAPKs + cdk7 JNK1 + JNK2 N- N- -C -C Systém pro detekci RA v buňkách/tkáních (RARE-LacZ reportér) RARE * LacZ RAR RXR RA RA RA RA Xn* b-galaktozidáza *další faktory/sekvence nezbytné pro funkci promotoru X-Gal X-Gal X-Gal X-Gal X-Gal Exprese a aktivita RALDH-2 v mozku myšího embrya (16 dpc) A) In situ hybridizace mRNA RALDH-2 B + C) RARE aktivita (RARE-LacZ reporter) Detekce buněk exprimujících indukovanou b-galaktosidázu McCaffery, 2000 RA - - + + - - + + - - + + LIF - + - + - + - + - + - + AG490 (5 mM) - - - - + + + + - - - - UO126 (5 mM) - - - - - - - - + + + + AG490 (mM) - 2.5 22.5 - 2.5 7.5 22.5 - - 2.5 7.5 22.5 LIF - - - + + + + - + + + + RA - - - - - - - + + + + + Protilátky – Ab = antibody - produkt B-lymfocytů/plasmatických buněk - rozpoznání cizorodého materiál – antigenu => regulace imunitních/obranných reakcí - detekce antigenů ve výzkumu - - monoklonální x polyklonální (jeden nebo více klonů produkujících buněk) - primární x sekundární x terciální ... 255px-Antibody ab12 Enz Schematický princip imunodetekce Enz Fig1 Cai2005_5_0001 Účinek séra na RA indukovanou neurální diferenciaci 6 days RT-PCR analýza exprese liniově specifických genů l neuroektoderm l entoderm Nediferencované buňky EC P19 Diferencované buňky EC P19 monovrstva + RA - sérum Diferencovane buňky EC P19 monovrstva + RA + sérum u buněčná jádra u cytokeratin EndoA pozitivní buňky – entoderm u N-CAM pozitivní buňky - neurony Leukemie inhibujicí faktor (LIF) posiluje RA indukovanou neurální diferenciaci EC buněk linie P19 Proliferace Diferenciace Apoptóza l neuroektoderm l entoderm ? SB-202190 UO 126 AG490 transkripční aktivita Stat-3 (reporter pAPRE-luc) transkripční aktivita AP-1 (reporter p3TP-Lux) transkripční aktivita RAR/RXR (reporter pRAREb2-luc) exprese a postranslační modifikace regulačních proteinů Bowman 2000 N-CAM Neuron-specific III b-tubulin RA RA+LIF AG 490 - + - - + - UO 126 - - + - - + Total protein 4 ds - + - - + - - - + - - + RA RA+LIF 6 ds P-Erk Erk UO126 - + - + - + - + LIF - - + + - - + + RA - - - - + + + + Detekce fosforylace (posttranslační modifikace) Erk kinázy (specifické protilátky) Detekce stupně diferenciace EC buněk indukovaných neurálním směrem (specifické protilátky)