3. Fytohormony a růstové regulátory I. auxiny, gibereliny a cytokininy Co to jsou hormony? • termín hormon – poprvé použitý v medicíně před 100 lety, pochází z řečtiny ηορμονε = stimulovat (ale nezahrnuje transport) • látky přenášené z jednoho místa na druhé (Went a Thimann, 1937) Co to jsou fytohormony? rostlinný hormon = fytohormon organická sloučenina syntetizovaná v jedné části rostliny, zpravidla translokovaná do jiné části, kde ve velmi malé koncentraci způsobuje fyziologickou odpověď (Salisbury a Ross 1985) mohou mít účinky stimulující, ale i inhibující organické sloučeniny syntetizované chemicky, které mohou být rostlinnými buňkami přijímány, transportovány a způsobují podobnou fyziologickou odpověď jako fytohormony. Co to jsou růstové regulátory? 5 skupin „klasických“ fytohormonů • auxiny 4 • cytokininy několik • gibereliny mnoho • kyselina abscisová • etylén • kyselina jasmonová • brassinosteroidy • polyaminy • oligosachariny • oligopeptidy • fenolické látky • strigolaktony... netradiční fytohormony Vývoj poznání o fytohormonech 1987- P.J.Davies: Plant Hormones and Their Role in Plant Growth and Development 1995 - P.J. Davies: Plant Hormones: Physiology, Biochemistry and Molecular Biology 2004 – P.J.Davies /ed./: Plant Hormones: Biosynthesis, Signal Transduction, Action! Auxiny • název auxin pochází z řeckého slova auxó, což značí zvětšovat se. • 1926 Frits Went - první užití termínu auxin pro zatím neidentifikovanou sloučeninu (Wuchsstoff), která způsobuje ohyb koleoptilí trav • 1936 identifikace Köhlerem v lidské moči a později prokázána Thimannem i v rostlinách • dnes víme, že je to kyselina indolyl-3-octová (IAA) Vliv auxinu • podílí se na fototropismu a geotropismu • způsobuje apikální dominanci • udržuje polaritu pletiv • stimuluje – prodlužování buněk – vývoj plodů – vývoj cévních svazků a diferenciaci vodivých pletiv – růst kořene (ale jen ve velmi nízké koncentraci = 10-7 až 10-13 M) – zakládání adventivních kořenů Fototropismus • 1880 – Ch. Darwin: význam koleoptile pro fototropismus • 1926 – F. Went: objev auxinu – umístění apexů koleoptilí na agar – přenos agarových bločků na dekapitované rostlinky (bez bočního osvětlení) – zvětšení pahýlu - neznámá látka difundující do agaru = Wuchsstoff = auxin Wentovy experimenty s koleoptylemi ovsa F. Went: Rostliny, 1979 Mechanismus fototropismu • směr světla je detekován apexem, modré světlo je nejúčinnější • auxin je syntetizován v meristému a translokován bazipetálně (dolů) • transportéry auxinu (PIN proteiny) jsou v plazmatické membráně na zastíněné straně prýtu • auxiny jsou přenášeny a stimulují prodlužování buněk na zastíněné straně • výsledkem je zakřivení stonku ke světlu Mechanismus gravitropismu • sedimentace amyloplastů v buňkách kolumely kořenové čepičky • spojení aktinových filament s váčky obsahujícími PIN proteiny • inserce PIN proteinů do plazmat. membrány umožní transport auxinu na spodní stranu kořene • inhibice prodlužovacího růstu na spodní straně • výsledkem je zakřivení kořene dolů Mechanismus gravitropismu J. Friml Vliv auxinu na růst kořene a stonku (podle Thimana) rozdílná reakce stonku a kořene je způsobena rozdílnou citlivostí jejich buněk na auxin koncentrace auxinu (ppm) 10-6 10-4 10-2 1 10 102 Translokace auxinu • auxin je přenášen polárním transportem z do buňky buňky pomocí přenašečů: na jedné straně je vnesen do buňky pomocí „ influx“ přenašečů v plasmatické membráně a transportován ke druhé straně buňky pomocí „efflux“ přenašečů tzv. PIN proteinů, kde mohou být transportovány do další buňky • PIN geny (PIN 1-8), kódují složky systému auxinových přenašečů • distribuce těchto přenašečů v buňce určuje, kterým směrem bude auxin transportován. Exprese a lokalizace AtPIN1 a AtPIN4 J. Friml (Cell 2002) » signál AtPIN1 byl detekován v plasmatické membráně buněk centrálního válce a slabší signál v buňkách endodermis. » AtPIN1 protein je lokalizován převážně na basální straně buněk. » AtPIN4 protein byl prokázán v oblasti buněk klidového centra (QC cells) a blízkého okolí. Exprese a lokalizace PIN proteinů ve špičce kořene Arabidopsis imunolokalizace AtPIN1 ukazuje na tok auxinu směrem k centru kořenového meristému (červené šipky) AtPIN4 reguluje směrování toku auxinu do kolumely – vytváří auxinové maximum (modré šipky). část auxinu je přesměrována vnějšími vrstvami zpět do elongační zóny a reguluje zakřivování kořene (AtPIN2, zelené šipky) (Friml a Palme 2002) 2 možnosti: • okamžitá reakce, přímý vliv na buňku (prodlužování) • pomalejší odezva - změna exprese genů Jak auxin způsobuje různé efekty v rostlině? Přímé vlivy auxinu přítomnost auxinu na povrchu buňky iniciuje okamžité reakce, jako jsou: • změny v pohybu iontů přes plazmatickou membránu do buňky a z buňky • extenze buněčné stěny - prodlužování buňky • auxin iniciuje tyto změny po vazbě na specifické receptory na povrchu buňky, pravděpodobně transmembránové proteiny jako ABP1 („AUXINBINDING PROTEIN 1"). Vliv auxinu na expresi genů mnoho vlivů auxinu je zprostředkováno změnami transkripce genů auxin vstupuje do buňky aktivním transportem v cytosolu se váže na proteiny jako ARF1 („AUXIN RESPONSE FACTOR1"). ARF1 je transkripční faktor transkripční faktor vstupuje do jádra a váže se na DNA sekvenci TGTCTC ACAGAG = promotory genů, které reagují na auxin (= auxin je tzv. response element) působení auxinu na transkripci genů je podobné působení steroidních hormonů u živočichů Schéma mechanismu účinku auxinů Salisbury 1992 ARF1 Auxiny - doporučené stránky experimenty s vlivem auxinu na iniciaci laterálních orgánů http://home.cc.umanitoba.ca/~umrahm04/39.768/P2/P2.html transport auxinu, přenos signálu http://www.public.iastate.edu/~bot.512/lectures/Auxin-action.htm vazebné proteiny pro auxin http://www.bio.unc.edu/faculty/jones/lab/auxin_binding_protein.html Kimbalova učebnice - auxiny http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/A/Auxin.html Přirozené auxiny kyselina indolyl-3-octová (n=1) IAA kyselina indolyl-3-máselná (n=3) IBA kyselina 4 chlor- indolyl-3-octová (Cl) 4-Cl-IAA kyselina fenyloctová Krystalické látky, špatně rozpustné ve vodě v kyselé a neutrální oblasti. Dobře rozpustné v organických rozpouštědlech a ve vodném alkalickém prostředí. IAA dosti nestálá (světlo) Biosyntéza auxinu vychází od tryptofanu Jsou známé dvě cesty, ale více preferovaná je cesta, kdy v prvním kroku dochází k transaminaci na indolpyruvát - pak následuje dekarboxylace na indolacetaldehyd - a po enzymatické oxidaci vzniká IAA. Enzymy nezbytné pro tuto syntézu jsou nejaktivnější v mladých nediferencovaných pletivech - meristémech, v mladých listech a plodech (v embryích) IAA je syntetizována zde. Obsah IAA (ng/g FW) dvouděložné (Heliopsis) jednoděložné (Triticum) Dörfling 1985 Syntetické látky (růstové regulátory) s účinkem auxinů kyselina indolyl-3-propionová α-naftyloctová β-naftoxyoctová IPA NAA NOA 1. indolové kyseliny 2. naftalenové kyseliny Syntetické látky s účinkem auxinů 3. chlorfenoxykyseliny 4. benzoové kyseliny 2,4-dichlorfenoxyoctová 2,4-D 2,4,5-trichlorfenoxyoctová 2,4,5-T 2-metyl-4-chlorfenoxyoctová MCPA dicamba Syntetické látky s účinkem auxinů 5. deriváty kyseliny pikolinové (izonikotinové) picloram 4-amino-3,5,6-trichloropikolinová kyselina vlastnosti syntetických auxinů jsou podobné IAA, ale jsou stálejší Herbicidy 2,4-D selektivně likviduje dvouděložní rostliny, ale ne trávy (podstatu selektivity ještě neznáme) 2,4-D se dostává do buněk usnadněnou difůzí, ale neexistuje její přenašeč z buňky ven (efflux carrier) „Agent Oringe“ používaný ve Vietnamu armádou USA k defoliaci pralesa byl směsí 2,4-D a 2-4-5-T Mechanismy kontroly množství auxinů • konjugace = kovalentní vazba na nízkomolekulární látky (aminokyseliny, cukry) funkce konjugátů (Bandurski 1984) .١ zásobní forma (neaktivního) hormonu .٢ ochrana hormonu před oxidací .٣ konjugáty jsou stabilní transportní formou .٤ konjugace slouží jako prostředek regulace množství endogenního hormonu • degradace = oxidace O2 a ztráta COOH - CO2 (dekarboxylace) Gibereliny • Kurosawa - při studiu houbové choroby rýže bakanae způsobené houbou Gibberella fujikuroi (v imperfektním stadiu Fusarium moliniforme) • ve vodě rozpustné látky produkované houbou kyselina giberelová = giberelin A3 (GA3) • terpeny – ent-giberelanový skelet • dnes je již známo více než 80 giberelinů (GA1, GA3 …) kyselina mevalonová ent-kauren GA1 Biosyntéza giberelinů neaktivní aktivní kyselina ent-kaurenová 3x AcCoA geranylgeranyl pyrofosfát první giberelin model struktury GA1 http://www.lars.bbsrc.ac.uk/plantsci/gas.html strukturní vzorec GA3 Gibereliny http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/G/Gibberellins.html 1 2 3 4 5 56 6 4 2 1 7 7 8 8 9 9 10 10 11 1112 12 13 13 14 15 15 14 16 16 17 17 1. prodlužování buněk spojené se stimulací růstu 2. dělení buněk v kambiu (spolupůsobení s IAA) 3. vyvolání partenokarpie 4. indukce kvetení v neindukčních podmínkách 5. porušení dormance pupenů nebo semen, indukce klíčení semen 6. mobilizace zásobních látek v semenech při klíčení (transkripce α-amylázy) Funkce giberelinů Cytokininy 1913 Gottlieb Haberlandt - látky obsažené ve floému mají schopnost indukovat buněčné dělení 1941 Johannes van Overbeek - podobné vlastnosti má endosperm z kokosových ořechů 1955 Miller et al. izolace prvního cytokininu ze spermatu sleďů - název kinetin = látka stimulující buněčné dělení (cytokinezi) 1956 Folke Skoog – výsledky pokusů s indukcí dělení buněk dřeně tabáku (poměr auxinů a cytokininů) 1961 Miller, 1963 Letham - izolace prvního přirozeného cytokininu z obilek (nezralého endospermu) kukuřice (Zea) = zeatin http://www.plant-hormones.info/cytokinins.htm Cytokininy fytohormony odvozené od adeninu (pozor na záměnu s cytokiny) nativní cytokininy izoprenoidní • zeatin (trans) (z nezralého endospermu Zea) • dihydrozeatin • izopentenyladenin aromatické • benzylaminopurin • m-topolin (3-hydroxybenzylaminopurin) izopentenyl adenin iPtrans – zeatin Z trans – zeatinribosid ZR Nativní cytokininy - izoprenoidní Nativní cytokininy- aromatické 6-(3-hydroxybenzylamino)purin meta-topolin mT poprvé izolován z listů topolu benzyladenin BA (benzylaminopurin BAP) furfuryl aminopurin kinetin K Syntetické cytokininy derivát močoviny thidiazuron TDZ • stimulace buněčného dělení název • potlačení apikální dominance podpora růstu axilárních meristémů, iniciace adventivních pupenů • stimulace vývoje chloroplastů • aktivace syntézy RNA a proteinů oddálení senescence • zvýšení odolnosti ke stresům (zasolení, sucho, vysoká teplota, vlhkost) Vliv cytokininů • vzájemná přeměna bází, nukleotidů a nukleosidů • N-glukosylace purinu a konjugace alaninu (N-9) • O-glukosylace a acetylace postranního řetězce • redukce dvojné vazby postranního řetězce • odštěpení postranního řetězce Metabolismus cytokininů: Kamínek (1992) Praha ACPD 2009 Praha ACPD 2005 Johannes van Staden Kamínek 1992 t-zeatin ribosid ipt isopentenyladenosin-mP isopentenyladenosin isopentenyladenin t-zeatin dihydrozeatin c-zeatin dihydro zeatin ribosid adenosin c-ox ct-izo c-ox adenin z-red Metabolismus cytokininů Biosyntéza a metabolismus cytokininů (MOK et MOK 2001) rostlina baktérie ATP ADP nebo AMP + DMAPP AtIPT4 ipt iPTP iPDP iPMP iPA iP zPTP zPDP zPMP ZR trans-Z cis-Z -c t izomeráza β-glukozidáza adenin + 3-methyl-butenal cytokininoxidáza o- glukosyl trans-zeatin zeatin reduktáza dihydro Z transZOG1 Transgenní tabák s aktivním ipt genem z Agrobacterium tumefaciens teratomy neschopné tvorby květu a semen nadprodukce endogenních cytokininů potlačení apikální dominance Regulace buněčného cyklu – ovlivnění fytohormony Frank, Schmülling (1999) TIPS P-áza ICK1 Cdk ABA cytokinin auxin GA cytokinin cytokinin aktivní aktivní neaktivní neaktivní olomoucin roskovitin Inhibitory kináz (CDK) odvozeny od cytokininů soutěží s ATP o vazebné místo v molekule kinázy M. Strnad Hypotéza příjmu a přenosu signálu cytokininu předpokládaný receptor cytokininu CKI1 Asp Asp His cytokinin CycD3 Metody stanovení cytokininů A. Biotesty .٢ Proliferace buněk v kalusové kultuře – nepoužívá se již příliš často, protože trvá velmi dlouho .٣ Expanze děloh ředkviček .٤ Inhibice ztráty chlorofylu v segmentech listů ječmene během senescence B. Chemické analýzy • chromatografie HPLC • hmotová spektroskopie LC/MS • radio-imunoanalýza RIA, ELISA Fytohormony a růstové regulátory II. Kyselina abscisová etylén netradiční fytohormony Kyselina abscisová hledání faktorů regulujících tvorbu abscisové zóny opadu listů a plodů: • abscisin - opad plodů bavlníku (1963 Frederick Addicot a kol., Kalifornie) • dormin - dormance javoru (1964 Phillip Wareing, UK) • lupin - opad květů Lupinus (1964 van Steveninck, UK) 1967 = kyselina abscisová ABA Kyselina abscisová Na rozdíl od živočichů nemohou rostliny uniknout z nevhodných podmínek (sucho, příchod zimy) aktivně. „Adapt or die.“ Kyselina abscisová (ABA) je hlavním činitelem při zprostředkování adaptací rostlin na stres. http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/A/ABA.html seskviterpen Vlivy kyseliny abscisové • stimuluje: – dormanci pupenů a semen – zavírání průduchů při vodním stresu – transkripci mRNA zásobních proteinů – senescenci • inhibuje – klíčení semen – vegetativní růst – dozrávání plodů – antiport K+ H + působí proti ostatním růst podporující fytohormonům Mechanismus kontroly zavírání stomat • vazba ABA na povrch plasmatické membrány svěracích buněk • růst pH v cytosolu • přenos Ca2+ z vakuoly do cytosolu • zvýšení Ca2+ v cytosolu blokuje příjem K+ svěracími buňkami a zvýšení pH vede ke ztrátě Cl• výsledkem je redukce osmotického tlaku a turgoru uzavření stomat příčný řez dělohou tabáku Dormance pupenů • ABA zprostředkuje přeměnu apikálního meristému na dormantní pupen (nově vytvářené listy = krycí šupiny pupenu = ochrana proti poškození a vyschnutí • ABA zabraňuje předčasnému rašení pupene • Přerušení dormance – prodloužené chladové období nebo prodlužování délky dne (fotoperiodismus) Zrání a dormance semen • v průběhu dozrávání semen se zvyšuje koncentrace ABA • ABA způsobuje dormanci semen a zabraňuje jejich předčasnému klíčení před koncem zimy nebo období sucha • dormance semen se překonává dostatečně dlouhým obdobím chladu a dostatečným přísunem vody Biosyntéza ABA k. mevalonová farnesylpyro-P violaxanthin xanthoxin kyselina abscisová přímá cesta nepřímá cesta přes syntézu karotenoidů konjugace glukosylester kyseliny abscisové http://www.plant-hormones.info/ethylene.htm Etylén Salisbury a Ross (1982) Plant Physiology Gloser (1995) Fyziologie rostlin H2 C=CH2 Etylén stará Čína - vliv pálení kadidla na urychlování dozrávání plodů Egypt – urychlování dozrávání fíků - poraněním 1864 – Německo, Francie: předčasný opad listů stromů v blízkosti plynových lamp 1901 - Neljubov - prokázal přítomnost etylénu ve svítiplynu + vliv etylénu na růst rostlin 1910 - transport pomerančů a banánů (Jamajská obchodní společnost) 1934 - Gane (Anglie) prokázal, že etylén je produkován dozrávajícími jablky a způsobuje: • měknutí dužiny • změny barvy • přeměna škrobu na cukr Etylén Etylén Dnes víme, že etylén je produkován všemi rostlinnými částmi, ale určité orgány jako jsou dozrávající plody, stárnoucí pletiva a meristém produkují mnohem větší množství etylénu. Etylén je tvořen také jako odpověď na stres jako je poranění nebo invaze patogenních organismů. Biosyntéza etylénu Yangův cyklus HCN, H2O, CO2 dozrávání plodů stárnutí poranění elicitory/patogeny stresy metionin ATP Pi+PPi S-adenosylmetionin ACC-syntáza ACC Etylén 5-metylthioadenosin ACC-oxidáza 1/2O2 aminocyklopropan karboxylová kyselina Trojná odezva (triple response) • kořeny nerostou pozitivně geotropicky • tloustnutí stonků (hypokotylů) • epinastické řapíky listů (zakřivují se směrem ke stonku) http://www.plant.uoguelph.ca/research/plantbio/BTamot.htm    trojná odezva klíčních rostlin rajčat po působení ACC na semena Účinky etylénu = rozmanité inhibuje dlouživý růst stonků a kořenů změnou orientace mikrofibril celulózy stimuluje dozrávání plodů rezistenci vůči poranění a chorobám tloustnutí stonku a kořenů, nestejná reakce vede k epinastii řapíků senescenci květů a plodů, vyvolává tvorbu odlučovací vrstvy v řapících listů a plodů (abscisi) tvorbu adventivních kořenů horizontální růst Netradiční fytohormony • brasinosteroidy (brasinolid) • kyselina jasmonová a metyljasmonát • polyaminy (putrescin, spermin, spermidin) • oligopeptidy (systemin) • oligosachariny • fenolické látky (deriváty kyseliny skořicové, benzoové, kyselina salicylová) Brasinosteroidy brasinolid 1979 izolován z pylu řepky Fyziologické účinky brasinosteroidů výrazně stimulují • dlouživý růst a dělení buněk (jejich účinná koncentrace je nižší než u auxinů) - biotesty na zakrslém hrachu, fazolu, aj., výrazně interagují s IAA = mění citlivost pletiv vůči IAA • gravitropismus • tvorbu dřevních elementů (xylogenezi) inhibují • zakládání a růst adventivních kořenů • opad listů a plodů Oligosachariny oligogalakturonidy - polymery odvozené od pektinu stimulují: tvorbu květů obranné reakce inhibují: tvorbu kořenů podstata působení: mění biosyntézu auxinu nebo inhibují jeho vazbu  xyloglukany – např. polymery odvozené od hemicelulosy stimulují: prodlužování buněk a růst obranné reakce morfogenezi (v kultuře) Kyselina jasmonová kyselina jasmonová JA - (aktivnější) a + forma izolace - jasmínový olej Jasminum grandiflorum poprvé izolována z houby Lasiodiplodia theobromae JA a její metylester MeJA – v mnoha rostlinách, téměř ve všech orgánech až 10ug/g FW Hlavní metabolické účinky JA stimuluje • senescenci = urychlování stárnutí listů • obranu vůči patogenům a hmyzu • obranu při poranění (= signálem při reakci na dotyk, na patogeny) inhibuje • klíčení semen • růst kořenů