Kalusové kultury 6. Indukce a jejich využití Definice kalusu kalus je tvořen amorfní hmotou málo organizovaných tenkostěnných, parenchymatických buněk Debergh et al. http://users.ugent.be/~pdebergh/cal1_p1.htm Fenotyp buněk kalusů tabák Nicotiana tabacum cv. Xantha mrkev Daucus carota ssp. carota Iniciace kalusu Tvorba kalusu může být vyvolána poraněním stonků nebo kořenů. Taková „ochranná“ odpověď na poranění byla pozorována u všech skupin žijících rostlin Debergh et al. Buněčné dělení je aktivováno jako výsledek změn endogenní rovnováhy fytohormonů. • mechanické poškození • invaze mikroorganismů • napadení hmyzem ránový kalus na kmeni stromu Erythrina Původ kalusu Kalus vzniká proliferací buněk z mateřského pletiva. V kultuře je kalus iniciován umístěním explantátů na médium, které podporuje růst buněk. Hormony nebo růstové regulátory (auxiny) mění metabolismus buněk, které jsou v klidu na dělící se buňky. kalus vznikající z pletiva cévních svazků kalus vznikající z pletiv kořene kalus vznikající na embryu Debergh et al. Stadia založení kalusu in vitro 1. indukce 2. buněčné dělení 3. diferenciace Debergh et al. 1. stadium - indukce kalusu buňky se připravují na dělení U většiny taxonů (rostliny dvouděložné, jednoděložné, nahosemenné, kapradiny i mechorosty) může být tvorba kalusu vyvolána relativně snadno. Pletiva mnohých orgánů mohou mít vlastní potenciál pro dělení buněk na vhodném médiu. Avšak některá pletiva (např. meristémy – kambium) jsou lépe disponována pro rychlé dělení buněk než pletiva diferencovaných buněk (jsou kompetentní) . tvorba kalusu na segmentu listu v blízkosti cévního svazku Debergh et al. Iniciace kalogeneze = indukce tvorby kalusu Auxiny • 2,4-D • picloram Iniciace kalusu ze segmentů kořene mrkve Reinert and Yeomann (1981) Indukce kalusu na stonku byliny (N. tabacum L.) po infekci bakteriemi Agrobacterium tumefaciens vyvolaná působením bakteriálních genů pro biosyntézu auxinu a cytokininu nádory krčku klíčních rostlin = „crown-gall callus“ Tacchini a Walbot 1987 2. stadium - buněčné dělení aktivní dělení buněk vrací buňky do meristematického dediferencovaného stavu 3. stadium - diferenciace = organogeneze nebo somatická embryogeneze v kalusovém pletivu postupně diferencují orgány: • prýty • kořeny • somatická embrya a začínají probíhat reakce drah sekundárního metabolismu Diferenciace buněk kalusu kalusové kultury jsou význačné pozoruhodnou variabilitou typů buněčné diferenciace homogenní kalus tvořený pouze parenchymatickými buňkami se vyskytuje pouze zřídka cytodiferenciace vede ke tvorbě tracheálních elementů, sítkových elementů, suberinizovaných buněk, žláznatých buněk a trichomů. Diferenciace meristematických buněk ztráta jádra skleren. vlákno meristematické buňky článek cévy doprovodné buňky a sítkovice parenchymat. buňky Typy kalusů – podle struktury Kalusy mohou mít strukturu: • pevnou = tvořené buňkami se silně lignifikovanými stěnami - zpravidla pomalu rostoucí kalusy • snadno se rozpadající na malé fragmenty („friable callus“) - rychle rostoucí kalusy lignif. kalus Gloriosa rozpadavý kalus Gloriosa rozpadavý kalus Vinca Přímá a nepřímá morfogeneze in vitro nepřímá morfogeneze přímá morfogeneze Georg a Sherrington (1984), upraveno malá oblast dělících se buněk meristemoidů nebo nodulů cév se může stát centrem pro tvorbu: A. prýtových pupenů B. kořenových primordií C. somatických embryí Diferenciace meristematických buněk Somatická embrya v kalusové kultuře Daucus carota ssp.carota globulární somatická embrya v kalusové kultuře srdčité somatické embryo v kalusové kultuře Kalus iniciovaný z kambiálních segmentů kořene mrkve se somatickými embryi kalogeneze a jeho udržování: MS s 0.1 mg/l 2,4-D indukce SE: MS bez auxinu Morfologie buněk suspenzí a jejich viabilita fluorescein diacetát (FDA) = substrát pro esterázy, které aktivní pouze v buňkách s nepoškozenou plazmatickou membránou esterázy hydrolyzují FDA a tak se uvolní fluorescein, který v modrém světle vyzařuje žlutozelenou fluoreccenci http://users.ugent.be/~pdebergh/cal.htm Buňky kalusu mrkve Daucus carota ssp. carota Nomarského diferenciální interferenční kontrast (DIC) fluorescence živých buněk po inkubaci s FDA Kalusy = genetická nestabilita Kalusové kultury jsou charakteristické genetickou nestabilitou. Takto mohou vznikat fenotypové rozdíly v jedné kultuře. variace mohou mít základ • epigenetický • genetický http://users.ugent.be/~pdebergh/cal.htm Epigenetické změny = jakákoliv změny fenotypu, která nejsou výsledkem změny DNA (selektivní genová exprese) Tyto změny jsou nedědičné, tj. nedochází k přenosu změn na meiotické potomstvo, ale jsou stabilní a jsou přenášeny z jedné buněčné generace na generaci další vegetativně. (např. habituace na cytokinin). Genetické změny = chromosomové aberace, jaderná fragmentace a endoreduplikace (vede k polyploidii) Četnost těchto abnormalit obvykle vzrůstá s rostoucím stářím kultury. Kultivační podmínky mohou působit selektivně. Určité aneuploidní nebo polyploidní buňky mohou získat výhodu v rychlosti dělení nad normálními buňkami a mohou proliferovat rychleji. Pasážování kalusu Po určité periodě kultivace je nezbytné pasážovat kalus na čerstvé médium, vzhledem k vyčerpání esenciálních živin a vysychání gelu. Metabolity vylučované kalusem se mohou v mediu akumulovat až na toxickou úroveň. Pasážovaný kalus musí být dostatečně velký, aby byl zajištěn obnovený růst po přenosu na čerstvé médium. Pasáže se provádějí pravidelně každé 3 až 6 týdnů. typická růstová křivka x = doba pasáže Využití kalusové kultury pro transformace účinnost transformace demonstrovaná expresí aktivity enzymu β−glukuronidázy prokázána indigogenní histochemickou reakcí www.aber.ac.uk/plantpathol/brachytransform.htm. biolistická transformace trav (nejsou citlivé na Agrobacterium) – marker transformace = gen uidA pro β-glukuronidázu kalus válečky Brachypodium Schéma bioreaktoru kalusy se používají pro iniciaci buněčných suspenzí Bioreaktor s hydrodynamickým promícháváním nafouknuté plastické sáčky tvoří kultivační komoru vlnění vytvářené houpáním: a) zvětšuje povrch rozhraní vzduch - tekutina pro přenos kyslíku b) zabraňuje sedimentaci buněk jiná varianta kultivace suspenze v tekutém médiu